全 文 ：参 考 文 献
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( 1 9 9 6
一
0 3
一
0 8 收稿 )
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.
中药青箱子 、土鳌虫的等电聚焦电泳研究
湖北中医学院物化教研室 (武汉 4 3。。 6 1)
湖北中医学院附属 医院药剂科
陈振江 夸
张香梅
摘 要 应用等电聚焦电泳 ( is o e lec t r ie of e u s in g e le e t r o p h o r e s is 简称 IF E )技术 , 对果实种子类中
药青箱子 Ce osl ai a r g e n t ea L . 和动物类中药土鳌虫 E u P o lPy ha g a si ne n si W al k 进行 FI E 研究 。 结果
表明 , 清晰的电泳谱带既可作为鉴别药物纯度及真伪的依据 , 也可用于确定药物样品所含主要蛋
白质成分的等电 pH ,从而为中药材及其制剂的生产 、 贮藏提供定量参考数据 。
关 . 词 青箱子 土盆虫 等电聚焦电泳 等电 pH
在中医临床的应用上 , 果实种子类中药
和动物类中药 占有很大的 比重 , 所以应确保
用药质量 。 由于果实种子类和动物类中药材
均富含蛋白质 。 故可以认为它们疗效的好坏
与其所含蛋白质成分的性质密切相关 。 本实
验选用的果实种子类中药青箱子和动物类中
药土鳌虫为常用的中药材 。 在实际应用中经
常有混淆品出现 , 需用有效的方法加以鉴别
区分 ;此外 ,它们所含主要蛋白质成分性质如
等电 p H 的确定 , 对药材及制剂的生产 、 贮藏
和使用有重要意义 。 FI E 技术可以满足这两
方面的要求 。
FI E 是比普通的聚丙烯酞胺凝胶电泳更
为先进的一种电泳技术 。 含有不同蛋白质成
分的各种中药及其制剂均可应用 FI E 技术
对其进行质量分析与鉴定 〔1, 。 然而一般 的
IF E 需用的两性电解质价格昂贵 , 且需配备
较大功率的 电泳仪及与之配套的带有冷却装
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5 9 3
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置的 电泳槽 , 同时要求实验者具备较热练的
操作技巧方可完成 。 为减少昂贵试剂的用量 .
且用普通 的电泳设备即可完成 I F E . 使之能
在广大基层单位推广应用 , 我们应用改进的
FI E 技术 , 以青箱子和土鳌虫及牛血清 蛋白
制剂为例 , 进行 I F E 可行性研究 , 效果良好 。
1 仪器与试剂
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一
1 4 型电泳仪 , 圆盘电泳槽 ; 所用
试剂均为 A R 级 , 双蒸水 . p H S一 8 及 p H 3一
10 两性电解质 (北京军事医科院 ) 。
样品 :青箱子 、 土鳖虫 由本院鉴定教研室
鉴定并提供 ;牛血清蛋白由武汉大学生命科
学院赵永芳教授提供 (此为样品⑧ ) 。
2 方法
2
.
1 样品液的制 备 : 分别准称 g2 土鳖虫和
1
·
59 青箱子分置于乳钵 中捣碎后用适量有
机溶剂 (乙醚 、 无水乙醇 各 50 % )浸泡脱脂并
过滤 , 待有机溶剂挥发后再各加 sm l 生理盐
水研磨后置试管 中离 心 ( 4 0 0 o r /m in ) l om i n ,
取上清液分置于半透膜袋透析除盐即得样品
液① 、 ② 。
2
.
2 凝胶的制备 : 在 Z om l 烧杯中依次加入
30
.
8%凝 胶 母 液 Zm l , 40 %两 性 电 解 质
O
·
3m l
, 样品液① 0 . 3m l , 蒸馏水 3m l , 过硫酸
钾 (饱和 ) o · l m l , 1 0%四 甲基乙 二胺 1 0 0拌 l ,
混匀后立即注入 2 支 已准备好的凝胶管中 ,
胶加到离顶部 3一 sm m 处 (注意管内不能有
气泡 ,若有则应轻弹管壁排除掉 ) 。 胶上再小
心注 入 3m m 厚的水层 , 以 隔绝空气并使胶
面平整 , 室温下聚合 3 0m ni , 待胶 一水 界面清
晰可见后 , 用滴管吸去水层 。
按同样的方法制备样品② 、 ③的凝胶柱
各 2 支 。
2
.
3 电泳槽的安装 : 将制备好的 6支凝胶管
编号并分别用阳极电极液 (5 %磷酸缓冲液 )
洗涤各凝胶管上端 3 次 ; 用阴极 电极液 (5 %
乙二胺缓冲液 )洗涤各凝胶管下端 3 次 。 然后
将各凝胶管按统一的方法垂直固定于圆盘 电
泳槽中 , 上槽加入阳极电极液 (以恰好浸没各
凝胶管为宜 ) , 下槽加入阴极 电极液 (以凝胶
.
5 9 4
.
管浸入 3 5/ 为宜 ) 。
2
.
4 等电聚焦 : 按上 ( + ) 、 下 (一 )接通电泳
槽 电衡( ` 调整电流 为 3 . sm A /管 ,进行电泳 。
电泳 开始 . 电流不断下 降 , 以电流不再下降
( 电流表指针指 向零 )作为样品 已聚焦的标
志 。 全程电泳 h3 左右 。
.2 5 样品 p H 梯度的测定 : 电泳结束后 , 从
电泳槽中小心取 出各凝胶管 (注意标记好各
管 的 _L 、 下端 ) , 用蒸馏水洗涤凝胶两端及玻
璃管外壁 3 次 ` 随后取出胶条 (方法是用注射
器向凝胶柱与玻璃管壁之间轻轻注入少量蒸
馏水 , 必要时用吸耳球从胶管顶端轻轻将胶
条压出 ) , 精确测量各样品胶柱的长度后 , 将
1
、
2
、
3 号样品胶柱各取一条置于 20 %三氯醋
酸中固定 4 0 m ni ; 各样品剩余的一条胶柱按
0
.
cs m /段切成若干段 (必要时胶段可以分的
更 小 ) , 分置于各 已编号并盛有 l m l 蒸馏水
的 l om l 试管中 , 4 `C 下浸泡 hl , 用精密 p H
试纸 (或精密 p H 计 )测定各样品各段浸泡液
的 p H 值 。
3 结果与讨论
.3 1 经固定后的样品的胶柱上出现清晰的
乳白色电泳谱带 , 如图 1所示 。青箱子在酸性
区域有 2 条带 , 近中性区有一条较强带 , 碱性
区有一条弱带 ; 土鳖虫在偏酸性区有一条较
强带 , 在碱性区有两条较弱带 ;牛血清蛋白在
偏酸性区有一条较强带 。
3
.
2 以各段胶所在位置 (即胶柱长度 )为横
坐标 , 以相对应的浸泡液的 p H 值为纵坐标
作 图可求得各样品胶柱上的 pH 梯度曲线 。
以样品①为例结果见图 2 。 因胶柱经固定后
其长度会发生变化 , 故由 p H 一长度关系曲线
求被测样品所含主要蛋 白质成分的等电点
P( I )
, 所用长度是经校正后的长度即 :
胶柱长度 ~ 蛋白质迁移距离 X 原胶柱长 (没经固定 )现胶柱长 (经固定后 )
根据各样品在各 自 FI E 胶柱上 的谱带
位置 (经校正后 ) , 再分别与各 自的 p H 一长度
关系曲线对 比 , 可方便地得出各样品的蛋白
质 PI 。 例如样品①所含主要蛋 白质的 PI 分
别为 4 . 7和 5 . 7(指图 I A中的两条较粗谱
带 );样品②所 含主要 蛋 白质成分 的 P I为
4
.
5 ;样品③所含蛋白质的 P I为 4 .8, 其中样
品③用此法求得的 PI 与文献值完全一致 , 进
而证明本实验所得数据是可靠的 。
图 1 , 箱子 、 土盆虫及牛血清蛋白的 FI E 图谱
A
一青箱子 E 土鳌虫
C
一牛血清蛋白
凝胶 往长 ( cm )
图 2 , 花子 FI E一 p H 一胶柱长度关系 曲线
3
.
3 两性电解质的加入是为了在电泳支持
物上产生适宜平滑的 pH 梯度 。其 pH 灌输选
择得当可提高 IF E 分辨率 。 在测定未知样品
P l时 , 可先采用 p H 一 3 ~ 10 的两性 电解质 ,
等初步测出 Pl 后 , 再改用包括样 品 PI 在 内
的窄的 p H 范围的两性电解质 。 在实际工作
中 , 为获得均一的场强同时节省试剂简化操
作 , 可在 p H ~ 3一 10 的两性电解质中加入占
载体总量 10 %的 p H 一 5 ~ 8 的两性电解质 。
本实验即采用此法效果良好 。
3
.
4 本实验采用将样品液混入凝胶液中的
点样方法 , 即简化了操作 , 增大加样量 , 同时
依据 FI E 特点 ,避免了样品液体在胶柱 中所
占的一段 p H 梯度 , 从而扩大了电泳分离范
围 ,提高分辨率并缩短电泳时间 。
3
.
5 由于 FI E 谱带经固定后即可清晰地呈
现出来 , 故本实验简化了 “ 染色 ”操作 。但如果
是对药材所含蛋白质成分进行精密地测定 ,
一般应采用 “ 染色 ” 手段 , 同时将胶段分割的
更小 。
3
.
6 聚丙烯酞胺的纯度 、 待测样 品液的脂 、
盐含量均对 p H 梯度有一定的影响 。 本实验
样品的脱脂 、 脱盐处理其 目的就在于消除不
利影响 , 以获得理想 FI E 谱带 。
上述实验 , 所得结果重现性良好 。 目前我
们继续应用该技术做着果实种子类及动物类
中草药的 IF E 研究 , 以期为含有蛋 白质成分
的中药及其制剂的鉴别和生产 , 提供一套较
完整的参考标准 。
致谢 : 本实验工作得武汉大学生命科 学
院生化技米实验室赵承芳教授的热情指导和
帮助 , 特此致谢 。
参 考 文 献
l 陈振江 , 等 . 中成药 , 1 99 4 , 16 ( 9 ) : 5 2
2 赵承芳编著 . 生物化学技术原理及其应用 . 武 汉 : 武 汉大
学出版社 , 第二版 , 19 94 . 331
( 1 9 9 6
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0 1
一
2 2 收稿 )
.日目.A
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硬币覃药 习百96年第 乏7卷第 10 期 · 5 9 5 ·
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紫外分光光度法测定八宝丹中胆红素含量的改进
厦门中药厂 ( 3 6 1 0 0 9) 吴味勤 . 黄建平 郑一民 周佩珊
摘 要 分别以 ( a) 乙醉一氯仿 (3 : 7) 和 ( b) 醋酸 一氯仿 ( 1 : 4) 为溶媒 , 以相应试剂作空白 ,用标准曲
线法和吸收系数法测定八宝丹中胆红素的含量 , 并进行比较 。 结果表明 , 吸收系数法简便可行 ,溶
媒 ( b) 较合理 。
关桂词 紫外分光光度 八宝丹 胆红素 酸催化异构化
八宝丹中含牛黄 、 田七 、 蛇胆 、 察香等 , 胆
红素是天然牛黄的主要成分 。 现行标准中的
含量测定系以 ( )a 乙 醇一氯仿 ( 3 : 7) 作溶媒 ,
其中滴加 1滴浓盐酸 , 使胆红素从钙盐中游
离出来 , 溶解在溶媒中 。 我们注意到胆红素在
强酸 中易发生酸催化异构化 (即由天然牛黄
中的 B R IX a 转变成 B R l a + B R X I a ) 〔, 〕和
红色反应 , 其稳定性受到一定影响〔, , 。 采用
( b )醋酸 一氯仿 ( 1 : 4) 作溶媒 , 其中醋酸既能
代替乙醇溶解包在胆红 素钙盐外面的胆 汁
酸 , 使胆红素游离出来 ,且不易使其发生异构
化及红色反应 。 为此将溶媒 b( ) 与原来的溶
媒 ( a) 进行比较 , 考察溶媒 b( ) 用于测定八宝
丹中胆红素含量的可行性 。
1 仪器与试药
岛津 u v 一 2 65 紫外 可 见分光 光 度计 ;
Q C 25 O 型超声波清洗器 ; 胆红素对照 品 (中
国药品生物制品检定所 ) ; 所用试剂均为分析
纯 。
2 方法与结果
2
.
1 最大吸收波长的选择 : 取胆红素对照品
和样品适量 , 分别用溶媒 ( a ) 、 b( )制备检测溶
液 , 以 相 应 的 试 剂 为 空 白 , 分 别在 5 0 0 一
4 0 o n m 波长段扫描 , 结果表明 , 最大吸收波
长均为 4 5 3n m , 与部颁标准一致 。
2
.
2 标准曲线的绘制 : 精密称取胆红素对照
品 sm g , 置 5m0 l 棕色量瓶中 , 加溶媒 (b )溶
解 , 并稀释至刻度 , 摇匀 。 精确吸取 0 . 2 , .0 4 ,
0
.
6
,
0
.
5
,
1
.
om l
, 分别置 1n0t l 棕色量瓶中 ,
加溶媒 b( )至刻度 , 摇匀 , 以相应的试剂为空
白 , 照分光光度法在 4 5 n3 m 波长处直接测定
吸收度 。 结果在 2 ~ 1 0拌g /m l 范围内 ,具有良
好的线性关系 , 回归方程为 A ~ 1 0 . 4 0 7C +
0
.
0 0 2 0 9
, r = 0
.
9 9 9 9
。
2
.
3 胆红素提取方法的比较 : 将八宝丹研
细 , 各精密称取 10 份样品 ,分别以溶媒 ( b) 作
冷浸 、 加热回流和直接超声波处理 。 结果表
明 , 冷浸提取需 h3 , 加热回流提取需 hl , 而直
接超声波处理 sm ni 已完全 。 超声波处理方
便 、 省时 。 我们选用超声波处理 10 m ni 。
2
.
4 加抗氧剂对样品测定的影响 : 取同一批
样品若干份 , 分别作加抗氧剂 10 % N a H SO 3
2滴与不加抗氧剂的样品测定 。 结果表明 , 两
种溶媒不加抗氧剂 N a H S O : , 均使测定结果
偏低约 2 0% , 而对测定的稳定性影响不明
显 。
2
.
5 稳定性实验 : 按样品的测定方法 , 每隔
3 o m in 测吸收值 , 结果 ( a ) 、 ( b )溶媒系统均在
2
.
s h 内稳定 , 吸收值几乎不变 。
2
.
6 精密度试验 : 取同一批样品 , 精确称取
·
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