全 文 ：书·问题探讨·
收稿日期：２０１５－０５－２５
基金项目：北京市农业局科技新星计划项目（编号：２０１３０９２９）。
作者简介：云晓敏（１９８０—），男，海南文昌人；农艺师，主要从事种子检
验工作；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｎ１２４＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
十字花科蔬菜黑斑病菌ＰＣＲ检测方法研究
云晓敏，　宋　歌，　律宝春，　蒋晓春
（北京市种子管理站，　北京１０００８８）
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　Ｃａｕｓｉｎｇ　Ｂｌａｃｋ
Ｌｅａｆ　Ｓｐｏｔ　ｏｆ　Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ
ＹＵＮ　Ｘｉａｏｍｉｎ，ＳＯＮＧ　Ｇｅ，ＬＢａｏｃｈｕｎ，ＪＩＡＮＧ　Ｘｉａｏｃｈｕｎ
摘　要：为建立十字花科蔬菜黑斑病菌分子检测鉴定技术，以
黑斑病菌３个种芸薹链格孢（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ），甘蓝链格
孢（Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）和萝卜链格孢（Ａ．ｒａｐｈａｎｉ）为实验对象，筛
选适宜其生长的富集培养基；依据文献报导和３个种ＤＮＡ的
ＩＴＳ序列共设计合成７对特异性引物，利用ＰＣＲ检测方法进行
鉴定。结果显示，ＰＤＡ和ＣＭＡ均适合十字花科蔬菜黑斑病菌
的富集培养；引物 Ｂ　２ 和 Ｓ　１ 可分别对 Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ 和
Ａ．ｒａｐｈａｎｉ菌种进行特异性鉴定，而Ａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ特异性鉴定还
需进一步研究确定。
关键词：　芸薹链格孢菌；甘蓝链格孢菌；萝卜链格孢菌；
培养基；引物；ＰＣＲ检测方法
ＤＯＩ编码：　１０．１６５９０／ｊ．ｃｎｋｉ．１００１－４７０５．２０１５．１０．６５
中图分类号：　Ｓ　４１－３０　　　文献标志码：　Ａ
文章编号：　１００１－４７０５（２０１５）１０－００６５－０４
黑斑病是十字花科蔬菜作物的一种主要种传病
害，带菌种子发芽后会引发猝倒病，造成幼苗猝倒。如
果幼苗感染本菌后，即使苗期不产生明显的病症，但种
子带菌可在植株上增殖或群集，致生长后期或采种株
爆发严重的危害。全国各大白菜产区均有不同程度的
病害发生，西南、华北地区近年来为害呈上升趋势，南
方秋季多雨季节发病最为严重，一般发病年份可减产
１０％～２０％，发病严重的年份可减产３０％～４０％，所
以在进行种子调运、播种前进行种子健康检测和预警
显得尤为重要。
十字花科黑斑病病原菌主要是半知菌亚门丝孢纲
丝孢目暗色孢科链格孢属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）的真菌［１］，包
括Ａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ，Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ，Ａ．Ｒａｐｈａｎｉ　３种链格
孢菌［２－３］，关于该病病原的培养条件［２］及ＰＣＲ鉴定［８］，
国内已有初步研究。近年来，随着十字花科蔬菜黑斑病
危害的日趋严重，黑斑病也引起了国外研究者的重视。
Ｂａｓｓｉｍｂａ，Ｄ．Ｄ．Ｍ首次报道萝卜中的黑斑病是由萝卜
链格孢菌引起，并同时进行了ＰＣＲ鉴定研究［１０］。但有
关从种子（苗）上分离和富集３种链格孢菌所适宜的培
养基，以及不同菌株特异ＰＣＲ检测方法还需要进一步
研究。本试验针对３种链格孢菌培养基筛选及ＰＣＲ检
测方法进行了初步研究，探索建立简便、准确、高效的十
字花科蔬菜黑斑病菌种子（苗）健康检测技术。
１　材料与方法
１．１　供试材料
１．１．１　供试菌株
十字花科蔬菜黑斑病菌３个种共７个菌株由中国
农业大学种子健康中心提供，其中芸薹链格孢菌３个
菌株分别为ｃａｅ１、ｃａｅ２和ｃａｅ３；甘蓝链格孢菌２个菌
株分别为ｃｏｌａ１和ｃｏｌａ２；萝卜链格孢菌２个菌株分别
为ｒａｐ１、ｒａｐ２。
１．１．２　培养基
参照文献［２］方法，选择了以下８种培养基。
ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＳＤＡ培养基：葡萄糖（２０．０ｇ），蛋白胨
（１０．０ｇ），琼脂（２０．０ｇ），蒸馏水（１Ｌ）。
ＰＤＡ培养基：马铃薯（２００．０ｇ），葡萄糖（２０．０ｇ），
琼脂（２０．０ｇ），蒸馏水（１Ｌ）。
ＣＳ培养基：硝酸钠３ｇ，磷酸氢二钾（１ｇ），硫酸镁
（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）（０．５ｇ），氯化钾（０．５ｇ），硫酸亚铁
（０．０１ｇ），蔗糖（３０ｇ），琼脂（２０ｇ），蒸馏水（１Ｌ）。
ＣＭＡ　ｗｉｔｈ　Ｔｗ８０培养基：玉米粉（４０．０ｇ），琼脂
（１５．０ｇ），吐温８０（１０ｍＬ），蒸馏水（１Ｌ）。
ＭＡ培养基：麦芽浸膏（２５．０ｇ），琼脂（２０．０ｇ），蒸
馏水（１Ｌ）。
ＭＤＳ培养基：ＫＨ２ＰＯ４（１ｇ），ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
（０．５ｇ），蛋白胨（５ｇ），葡萄糖（１０ｇ），琼脂（２０ｇ），蒸馏
水（１Ｌ），ｐＨ自然；此培养液１　０００ｍＬ加１％孟加拉红
水溶液３．３ｍＬ。临用时每１００ｍＬ培养基中加１％链
·５６·
问题探讨　　云晓敏 等：十字花科蔬菜黑斑病菌ＰＣＲ检测方法研究
霉素液０．３ｍＬ。
ＰＳＡ培养基：马铃薯（２００ｇ），蔗糖（１５ｇ），琼脂
（２０ｇ），蒸馏水（１Ｌ）。
ＳＮＡ培养基：Ｋ２ＨＰＯ４（１．３６ｇ），Ｎａ２ＣＯ３（１．０６
ｇ），ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（５．０ｇ），葡萄糖（５．０ｇ），天门冬素
（１．０ｇ），琼脂（２０ｇ），蒸馏水（１Ｌ）。
１．２　实验方法
１．２．１　供试菌株在不同培养基上的生长速率比较
从十字花科蔬菜黑斑病的３个种里分别取一个菌
株（ｃａｅ１、ｒａｐ１、ｃｏｌａ１）进行试验。将供试菌株在ＰＤＡ
平板上活化，于２５℃恒温、黑暗条件下培养大约７ｄ，
用直径为６ｍｍ的真菌打孔器截取菌落外缘制备菌
饼，将菌饼接种到预先制备的８种供试培养基平板
（Φ＝８．５ｃｍ）中央，每种供试培养基视为一个处理，
４次重复，置于２５℃恒温、黑暗条件下培养７ｄ，测量
各菌落直径，按下列公式计算出各处理菌落平均生长
速率，比较３种菌株在不同种培养基上平均生长速率
以及每个菌株在不同培养基上生长速率的差异。
平均生长速率（ｍｍ／ｄ）＝（测定菌落直径－菌饼
直径）／培养天数。
１．２．２　供试菌株基因组ＤＮＡ的提取
将７个株菌转接到ＰＤＡ液体培养基上，在２５℃、
１３０ｒ／ｍｉｎ恒温摇床上培养４～５ｄ，用灭菌纱布过滤
菌丝体，无菌吸水纸吸干营养液后，－２０℃保存备用。
采用天根生化科技（北京）有限公司提供的新型植物基
因组提取试剂盒（ＤＰ　３２０）提取菌丝的基因组ＤＮＡ。
１．２．３　ＤＮＡ质量检测
采用１．０％琼脂糖凝胶对提取的ＤＮＡ进行电泳
检测。
１．２．４　引物及设计
４对引物引自文献［８］、［１１］，包括真菌核糖体基
因的通用引物Ｔ　１，扩增３个菌种核糖体５．８ＳｒＤＮＡ
侧翼ＩＴＳ区的特异引物：Ｂ　１、Ｂ　２、Ｂ　３。同时本实验室
根据３个菌种ＩＴＳ区ＤＮＡ序列，利用在线引物软件
（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｑ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｗｅｂ－ｐｒｉｍ－
ｅｒ）设计针对３个种的特异性扩增引物：Ａ．ｒａｐｈａｎｉ的
引物Ｓ　１，Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ的引物Ｓ　２和Ａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ的
引物Ｓ　３。所有引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限
责任公司合成。具体序列见表１。
１．２．５　ＰＣＲ引物扩增
ＰＣＲ扩增反应体系为２５μＬ：１０×Ｔａｑ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ　ｅａｃｈ）２μＬ，
Ｔａｑ　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．２μＬ，Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（１０
ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ和Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μ
Ｌ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ　１．０μＬ（含２５～５０ｎｇ　ＤＮＡ），ｄｄＨ２Ｏ
１８．３μＬ。
表１　引物序列情况表
引物名称 　　　　　序列 来源 片段大小
Ｔ　１
Ｆ：ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ
Ｒ：ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ
文献报道 ３１５ｂｐ
Ｂ　１
Ｆ：ＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡ
Ｒ：ＡＡＧＧＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡ
文献报道 ３７１ｂｐ
Ｂ　２
Ｆ：ＡＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧ
Ｒ：ＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧ
文献报道 ４５７ｂｐ
Ｂ　３
Ｆ：ＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＧ
Ｒ：ＣＣＡＧＴＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＡＡＴＴ
文献报道 ４１１ｂｐ
Ｓ　１
Ｆ：ＣＣＣＴＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＡ
Ｒ：ＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧ
设计 ４７０ｂｐ
Ｓ　２
Ｆ：ＡＴＡＣＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡＴＧ
Ｒ：ＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＧＴＡＡＧＧＴＧＣＣ
设计 １　０１８ｂｐ
Ｓ　３
Ｆ：ＴＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＡ
Ｒ：ＡＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＡ
设计 ５４４ｂｐ
２　结果与分析
２．１　不同培养基上黑斑病菌３个种菌株生长速率
比较
　　观察同一黑斑病菌菌株在不同培养基上生长速率
发现，３种菌株均在ＰＤＡ和ＣＭＡ两种培养基上生长
相对较快（图１），说明这２种培养基适合３种黑斑病
菌的富集培养；另外３种黑斑病菌在同一培养基上的
生长速率存在差异，除ＳＮＡ培养基外，其余培养基上
ｃｏｌａ１的生长速率最快，ｃａｅ　１次之，ｒａｐ１的生长速率
最慢（图１）。
图１　不同培养基上３种黑斑病菌株生长速率比较
２．２　菌种的ＰＣＲ鉴定
利用菌种富集培养的菌丝，通过试剂盒方法提取
得到７个菌株的基因组ＤＮＡ，通过琼脂糖电泳检测，
提取的ＤＮＡ条带较亮，没有弥散（图２），说明提取的
ＤＮＡ质量好，可以用于ＰＣＲ扩增。
首先利用文献提供的引物进行扩增，结果显示，针
对真菌核糖体基因的通用引物Ｔ　１都能扩增出５８０ｂｐ
的片段（图３），但是长度与文献报导的３１５ｂｐ不符，说
明是非特异扩增，不能用于十字花科蔬菜黑斑病菌后
续的克隆和测序；针对３种病菌特异性鉴定仅对
·６６·
第３４卷　第１０期　２０１５年１０月　　　　　　 　　　种　子　（Ｓｅｅｄ）　　　 　　 　　　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．１０　Ｏｃｔ．　２０１５
Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ菌 的 引 物 Ｂ　２ 扩 增 出 目 的 条 带
（４５７ｂｐ），其他菌均未扩增出目标片段（图４），特异性
强。由本实验室根据ＩＴＳ序列设计的３个病菌的特
异引物扩增结果显示，仅针对Ａ．ｒａｐｈａｎｉ引物Ｓ　１表
现出扩增特异性，目标条带为４７０ｂｐ（图５），而针对
Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ设计的特异性引物Ｓ　２特异性差，对试
验中所有链格孢菌均能扩增出１　０１８ｂｐ的目标条带
（图６）；另外针对Ａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ设计的特异性引物Ｓ　３
未能对芸薹链格孢及其相近链格孢菌株ＰＣＲ扩增出
任何条带，结果图省略。因此，通过本试验，确定了
Ａ．ｒａｐｈａｎｉ和Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ病菌的特异性检测引物，而
Ａ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ病菌的特异性引物需要进一步试验研究。
图２　菌株ＤＮＡ提取效果
图３　通用引物Ｔ　１扩增结果
图４　引物Ｂ　２扩增结果
图５　引物Ｓ　１扩增结果
图６　引物Ｓ　２扩增结果
３　讨　论
十字花科蔬菜黑斑病是世界范围内为害比较严重
的十字花科蔬菜真菌性病害之一，近年来十字花科蔬
菜黑斑病的发生趋势有所上升，对我国十字花科蔬菜
生产造成严重威胁。十字花科蔬菜黑斑病菌为种传真
菌性病害，因此种子健康检测成为防治此病害的重要
手段。但常规的种子健康检测方法大多存在时间过
长、精度不高、专一性不强等缺点。有鉴于此，本研究
建立了一个快速、准确、灵敏的ＰＣＲ检测方法，用于检
测十字花科蔬菜种子携带的黑斑病菌。
本研究从８种培养基中筛选到适宜十字花科蔬菜
黑斑病３个种生长的２种培养基（ＰＤＡ，ＣＭＡ），通过
富集培养获得大量用于分子检测的菌丝体。通过
ＰＣＲ特异扩增，确认病菌Ａ．ｒａｐｈａｎｉ和Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏ－
ｌａ的特异扩增引物和检测方法，为十字花科蔬菜黑斑
病菌检测奠定了基础。下一步研究可对病菌Ａ．ｂｒａｓ－
ｓｉｃａｅ的特异引物进行设计和鉴定，同时通过对通用引
物的扩增对扩增后的ＰＣＲ产物进行克隆和测序，根据
测序结果设计 Ｔａｑｍａｎ探针和引物，通过实时荧光
ＰＣＲ方法对菌株进行检测和鉴定，这样既可以提高检
测灵敏度，又可以降低假阳性率，提高检测的效率。
参考文献：
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白菜致病性的研究［Ｊ］．科教文汇（下半月），２００６（８）：２０８．
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培养条件比较［Ｊ］．菌物学报，２００４，２３（４）：５７３－５７９．
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区序列分析［Ｊ］．菌物学报，２００５，２４（３）：４１４－４２１．
［５］肖长坤，李勇，李健强，等．十字花科蔬菜种传黑斑病研究进
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（转下页）
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问题探讨　　云晓敏 等：十字花科蔬菜黑斑病菌ＰＣＲ检测方法研究

（接上页）
［７］张毅，李进，李婷，等．十字花科蔬菜黑斑病的识别与防治
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［８］肖长坤，李健强，师迎春，等．十字花科蔬菜黑斑病菌的ＰＣＲ
鉴定［Ｊ］．植物病理学报，２００５，３５（３）：２７８－２８２．
［９］ＢａｓｓｉｍｂａＤ　Ｄ　Ｍ，Ｍｉｒａ　Ｊ　Ｌ，Ｖｉｃｅｎｔ　Ａ．Ｆｉｒｓｔ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　Ａｌｔｅｒ－
ｎａｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｃａｕｓｉｎｇ　Ｂｌａｃｋ　Ｓｐｏｔ　ｏｆ　Ｔｕｒｎｉｐ　ｉｎ　Ｓｐａｉｎ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１３，９７（１１）：１　５０５．
［１０］Ｗｈｉｔｅ　Ｔ　Ｊ．Ｌｅｅ　Ｓ．Ｔａｙｌｏｒ　Ｊ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｒｉｂｏ　ｓｏ　ｍａｌ　ＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎ
ｃｔｉｃｓ．Ｉｎ：ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｏｌｓ：Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅ　ｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｆｉ－
ｃａｔｉｏｎ［Ｍ］．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ　ｓ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ．Ｃａｌｉｆｏ～ａ．１９９０：
３１５－３２２．
收稿日期：２０１５－０５－１５
基金项目：山东省高校人文社会科学研究计划项目（编号：Ｊ　１２ＷＧ　６４）；山东省社科规划办项目（编号：１３ＣＪＲ　１１）；山东省高校人文社会科学研究计
划项目（编号：Ｊ　１４ＷＦ　５５）；山东省自然科学基金（编号：ＺＲ　２０１４ＧＬ　０１０）。
作者简介：高　洁（１９８０—），女，山东潍坊人；博士，讲师，研究方向：农业经济管理。
植物品种权保护制度的设计分析
高　洁，　周志霞
（潍坊学院经济管理学院，　山东 潍坊２６２１００）
Ｔｈｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｖａｒｉｅｔｙ　Ｒｉｇｈｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＡＯ　Ｊｉｅ，ＺＨＯＵ　Ｚｈｉｘｉａ
摘　要：实现育种创新收益与社会收益之间的平衡，是植物品
种权保护制度设计者必须考虑的问题。本文通过构建单一政
策框架下的博弈模型，探讨了植物品种权保护制度的设计机
制。研究表明：植物品种权保护期是一个有限的值，合理的植
物品种权保护期既可以使育种创新者获得足够补偿，又可以尽
可能降低社会福利净损失。
关键词：　植物品种权保护制度；设计机制；
植物品种权保护期
ＤＯＩ编码：　１０．１６５９０／ｊ．ｃｎｋｉ．１００１－４７０５．２０１５．１０．６８
中图分类号：　Ｆ　２０４　　　文献标志码：　Ａ
文章编号：　１００１－４７０５（２０１５）１０－００６８－０３
植物品种权是一种有效激励育种创新的制度安
排，它通过赋予育种创新者一定时期的垄断权使其弥
补研发成本、获取垄断收益。然而，育种创新者利用植
物品种权获得垄断权的同时，也存在社会福利的无谓
损失（ｄｅａｄ－ｗｅｉｇｈｔ　ｌｏｓｓ）。由植物品种权保护制度所
导致的无谓损失是为激励育种创新不得不付出的代
价，在一定程度上有其合理的一面。实际上，植物品种
权保护制度的作用就是要使育种创新者的收益与社会
收益达到某种平衡。因此，如何有效地发挥植物品种
权保护制度的创新激励作用和降低其垄断力量，是任
何一个政策制定者在设计植物品种权保护制度时都必
须考虑的问题。基于上述认识，本文对植物品种权保
护制度的进行最优化设计，以期为政府制定植物品种
权保护制度提供理论依据。
１　模型构建
随着中国种业市场的逐步放开，种子已成为“门
槛”最低的农资造假领域，品种权人受到的潜在威胁更
多地是来自于假种子的贩卖。设如下基本假设：１）
在育种创新者选择申请品种权保护后，也就自动转为
品种权人，这里不考虑品种权转让、许可等情况。也就
是说，育种创新者与品种权人是不同阶段对同一人的
不同称呼。２）实施品种权侵权行为的一方，统称为侵
权者。３）一般情况下，假种子总是不同程度地劣于品
种权种子。４）种植农户对种子的需求是同质的。即
只要假种子和品种权种子的种植性能一样，种植农户
对它们的需求是一致的；当假种子种植性能逐渐下降
时，其需求量也在下降。５）侵权成本是侵权者在实施
侵权行为时付出的成本，包括生产成本、精神成本、机
会成本和违法成本。这里的违法成本是指其中指侵权
者被发现后需支付的补偿性赔偿（补偿性赔偿是指通
过赔偿使品种权人恢复到侵权前的状态，仅限于补偿
实际损失）。其中，生产成本、精神成本和机会成本是
必然发生的，而违法成本的发生存在偶然性。设生产
成本、精神成本和机会成本之和为Ｋ，违法成本为Ｃ，
·８６·
第３４卷　第１０期　２０１５年１０月　　　　　　 　　　种　子　（Ｓｅｅｄ）　　　 　　 　　　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．１０　Ｏｃｔ．　２０１５