全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 3期，第 359-366页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.3, 359-366
研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
唐东阶 1,2 张雨 2 王谜 2 唐纪良 1,2 臧宁 3*
1亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁, 530005; 2广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 3广西医科大学医学科学实验
中心,南宁, 530021
*通讯作者, zangninggxnn@163.com
摘 要 细菌锌吸收调控蛋白(Zur)在调控细胞锌离子平衡中起核心作用。研究发现，大肠杆菌的 Zur蛋白
(ZurE. coli)中半胱氨酸残基 Cys93、Cys96、Cys143和 Cys146是锌离子结合位点，是感受锌离子浓度和调控锌离子平衡
必需的氨基酸残基。本文研究了十字花科黒腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称 Xcc)的
Zur蛋白(ZurXcc)。序列分析结果显示，ZurXcc的 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168是与 ZurE. coli的 Cys93、Cys96、Cys143和
Cys146相对应的半胱氨酸残基，预示它们可能是 ZurXcc中的锌离子结合位点。此外，氨基酸置换结果发现，
Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168中任何一个被其它氨基酸置换后，ZurXcc即丧失调控锌离子平衡的能力，证明它们
是 ZurXcc调控锌离子平衡必不可少的，是可能的锌离子结合位点。胞外多糖(EPS)产量和致病力检测结果还表
明，ZurXcc调控锌离子平衡、EPS产生和调控致病在结构和功能上都是可以分开的。
关键词 黄单胞菌,锌吸收调控蛋白,氨基酸置换,锌离子结合位点,锌离子平衡
Functional Analysis of Four Cysteine Residues in the Zinc Uptake Regulator
ofXanthomonas campestris pathovar campestris
Tang Dongjie 1,2 Zhang Yu 2 Wang Mi 2 Tang Jiliang 1,2 Zang Ning 3*
1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530005; 2 College of Life Science and Technol-
ogy, Guangxi University, Nanning, 530005; 3 Medical Scientific Research Center of Guangxi Medical University, Nanning, 530021
* Corresponding author, zangninggxnn@163.com
DOI: 10.3969/gab.032.000359
Abstract Bacteria zinc uptake regulator, Zur, plays a central role in zinc homeostasis. It has been known that the
cysteine residues at positions of 93rd, 96th, 143rd, and 146th in E. coli (ZurE. coli) are the Zn2+-binding sites and thus are es-
sential for the Zn2+ sensing and zinc homeostasis regulation of ZurE. coli. Here, we investigate the Zur of Xanthomonas
campestris pathovar campestris (Xcc) (ZurXcc). Amino acid sequence analysis reveal that Cys125, Cys128, Cys165 and
Cys168 in ZurXcc are corresponding to Cys93, Cys96, Cys143 and Cys146 of ZurE. coli respectively, suggesting that these
residues may involve in binding of Zn2+. To challenge this hypothesis, the contribution of each of the four cysteine
residues to Zur function was determined using amino acid substitution analysis. The results show that, amino acid
substitution in Cys125, Cys128, Cys165 and Cys168 resulted in lost of the zinc homeostasis regulating function of ZurXcc,
demonstrating that the four cysteine residues are essential for zinc homeostasis regulation of ZurXcc. More important-
ly, our results demonstrated that the role of ZurXcc in the regulation of zinc homeostasis, EPS production and viru-
lence of Xcc is structurally and functionally separable.
Keywords Xanthomonas, Zinc uptake regulator, Amino acid substitutions, Zn2+ binding sites, Zinc homeostasis
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30671142)资助
锌是所有生命必需的微量元素，它作为一些蛋白
质的结构成分或作为一些酶的辅酶在各种生理过程
中发挥着非常重要作用(Patzer and Hantke, 2000)。但
是，和其它许多重金属一样，锌是有毒性的，当它在细
胞内的含量超过一定值时，就会对细胞产生毒害作
用，抑制细胞的生长甚至导致细胞的死亡；因此，细胞
中锌的含量是受到严格而精确的调控的(Patzer and
Hantke, 2000; Hantke, 2005)。研究证明，在细菌中，锌
吸收调控蛋白(zinc uptake regulator, Zur)在调控细胞的
锌离子平衡中起关键作用(Hantke, 2005)。锌吸收调控
蛋白 Zur首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中被鉴定
(Patzer and Hantke, 1998)。之后，通过基因组测序和基
因注释，zur的同源基因和 Zur的同源蛋白被发现广
泛存在于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中。到目前为
止，除了大肠杆菌外，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
(Gaballa and Helmann, 1998)、李斯特菌(Listeria monoc-
ytogenes) (Dalet et al., 1999)、金黄色葡萄球菌(St aphyl-
ococcus aureus) (Lindsay and Foster, 2001)、肠道沙门
氏菌(Salmonella enterica) (Campoy et al., 2002)、野油
菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris) (Tang et al.,
2005)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) (Shin et
al., 2007)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae) (Yang
et al., 2007)、猪链球菌(Streptococcus suis) (Feng et al.,
2008)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
(Schr觟der et al., 2010)的 Zur蛋白的功能也已经被确定。
在这些细菌中，zur基因突变均导致细菌对高浓度锌离
子的耐受力的下降，说明 Zur蛋白在细胞锌离子平衡
控制中起重要作用(Patzer and Hantke, 1998; Gaballa and
Helmann, 1998; Dalet et al., 1999; Lindsay and Foster,
2001; Campoy et al., 2002; Tang et al., 2005; Shin et al.,
2007; Yang et al., 2007; Feng et al., 2008; Schr觟der et al.,
2010)。有意思的是，在肠道沙门氏菌、野油菜黄单胞
菌、水稻黄单胞菌和猪链球菌中，zur基因突变会导致
这些病原菌的致病力显著下降，说明 Zur蛋白也在这
些病原菌的致病过程中起重要作用(Campoy et al.,
2002; Tang et al., 2005; Yang et al., 2007; Feng et al.,
2008)。而我们实验室的研究发现，在十字花科黒腐
病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称
Xcc)中，Zur蛋白除了参与细胞锌离子平衡和致病外，
还在 Xcc的胞外多糖产生中起重要作用(Tang et al.,
2005)。这些结果说明，除了调控细胞锌离子平衡外，
Zur蛋白还在其它细胞生理过程中发挥重要作用。
目前，大肠杆菌的 Zur蛋白(ZurE. coli)调控锌离子平
衡的分子机理已经研究得比较清楚，其机理是：当细
胞中的锌离子浓度过高时，ZurE. coli和锌离子特异结合；
而结合有锌离子的 ZurE.c oli被激活，因此能够和存在
于编码高亲和力锌离子吸收系统(high-affinity zinc up-
take system)的 znuABC基因簇的启动子的-10到-35
区的一段长度为 29 bp的回文序列(AAGTGGATATT
ATAACATTTCATGACTA)结合，从而阻止 RNA 聚
合酶和 znuABC启动子的结合，因而抑制 znuABC基因
簇的转录(Patzer and Hantke, 2000; Outten and OHallo-
ran, 2001)。有实验证据预示，枯草芽孢杆菌 Zur蛋白
以及 Xcc的 Zur蛋白(ZurXcc)可能也使用 ZurE.. coli相似
的机制来调控细胞锌离子平衡(Gaballa et al., 2002;
Huang et al., 2008)。研究表明，ZurE. coli的第 93、96、143
和 146位半光氨酸残基(Cys93, Cys96, Cys143和 Cys146)
能与锌离子特异结合，是 ZurE. coli的锌离子结合位点；
它们在 ZurE. coli感受细胞锌离子浓度中起必不可少的
作用(Patzer and Hantke, 2000; Outten and OHalloran,
2001; Outten et al., 2001)。其中，Cys93和 Cys96与锌离
子特异结合后可以维持 Zur蛋白的结构，因此被称为
结构锌离子结合位点(structural Zn2+ binding sites)；而
Cys143和 Cys146与锌离子特异结合后会导致 Zur蛋白
的结构改变，因此被称为锌离子感受位点(Zn2+ sensing
sites) (Outten et al., 2001)。为了寻找 ZurXcc中的锌离子
结合位点，本研究中，我们用 Vector NTI软件将 ZurXcc
的氨基酸序列与 ZurE. coli的序列进行比对。结果显示，
ZurXcc的 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168分别是与 ZurE. coli
的 Cys93、Cys96、Cys143和 Cys146对应的半光氨酸残基。
通过氨基酸置换，我们对 Cys125、Cys128、Cys165 和
Cys168这 4 个半胱氨基酸残基对 ZurXcc功能的重要
性进行了分析。结果证明，Cys125、Cys128、Cys165 和
Cys168是 ZurXcc调控锌离子平衡必不可少的，说明
Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168可能是 ZurXcc中的锌离
子结合位点。
1结果与分析
1.1氨基酸序列分析
我们实验室以前的研究发现，zur基因突变导致
Xcc对锌离子的耐受力下降、致病力降低和胞外多糖
产生减少，说明 ZurXcc除了调控锌离子平衡外，还具
有调控致病和胞外多糖产生的功能 (Tang et al . ,
2005)。Outten等(2001)人的研究证明，ZurE. coli的Cys93、
Cys96、Cys143和 Cys146半光氨酸残基是 ZurE. coli的锌离
子结合位点，是 ZurE. coli调控大肠杆菌锌离子平衡必
需的。为了找出 ZurXcc的锌离子结合位点，我们用
Vector NTI软件对 ZurXcc和 ZurE. coli的氨基酸序列进
行比对分析。结果发现，ZurXcc的 Cys125、Cys128、Cys165
和 Cys168 分别是与 ZurE. coli 的 Cys93、Cys96、Cys143和
Cys146 相对应的半光氨酸残基 (图 1)。我们推测，
Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168可能是 ZurXcc 的锌离子
结合位点。
十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
Functional Analysis of Four Cysteine Residues in the Zinc Uptake Regulator of X. campestris pathovar campestris 360
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.2表达特定位点氨基酸置换的突变体 ZurXcc的质粒
的构建
要确切地证明 Cys125、Cys128、Cys165 和 Cys168 是
ZurXcc的锌离子结合位点，需要复杂的结构生物学分
析，本研究中，我们用一些间接的证据来支持我们上
述的推测。
如果 Cys125、Cys128、Cys165 和 Cys168 确实是 ZurXcc
的锌离子结合位点，那么，当我们将这 4个半光氨酸
残基的任何一个替换成其它氨基酸后，必然会导致
ZurXcc无法感受细胞锌离子水平并因此丧失调控锌离
子平衡的能力。为此，我们决定通过氨基酸置换，确定
Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168对 ZurXcc功能(包括锌离
子平衡调控,致病调控和胞外多糖产生调控功能)的
重要性。
由于我们以前的实验已经证明，将一个表达野生
型 ZurXcc的质粒 pXC1430导入 Xcc8004的 zur突变
体 1430nk后，能够将该突变体对锌离子的耐受力、致
病力和胞外多糖产量恢复到野生型水平 (Tang et
al., 2005)。这样，确定 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168对
ZurXcc功能的贡献的最简单易行的实验策略就是：分别
构建表达带有 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168氨基酸置
换的突变体 ZurXcc 的质粒，然后将它们一一导入
1430nk中获得互补菌株，最后通过分析这些互补菌株
的表型恢复情况来推断这些半胱氨酸残基对 ZurXcc功
能的重要性。图 2是我们构建表达带有特定位点氨基
酸置换的突变体 ZurXcc的质粒的技术路线。最终，我们
按照图 2的策略以及“材料与方法”中描述的方法，构
建了表达 ZurXccCys125·Val、ZurXccCys128· Leu、ZurXcc-
Cys165·Ile 和 ZurXccCys168·Tyr 氨基酸置换的突变体
ZurXcc 的重组质 粒 ，pZurXccC125V、pZurXcccC128L、
pZurXccC165I 和 pZurXccC168Y (表 1)。
图 1利用VectorNTI软件对 ZurXcc和 ZurE.coli的氨基酸序列的比对结果
注: ZurXcc和 ZurE. coli序列来自 NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库(它们的 GenBank登记号分别是 AAU06
119和 AAN83443);黑色背景的氨基酸为相同的氨基酸;箭头所指的半胱氨酸基酸为本研究进行功能分析的半胱氨酸基酸,箭头上
的数字为该半胱氨酸基酸在 ZurXcc和 ZurE.coli中的位置
Figure 1 Alignment of the amino acid sequences of ZurXcc and ZurE. coli using Vector NTI Alignment program
Note: The sequences were from the sequence databases of National Center for Biotechnology Information (NCBI); The GenBank ac-
cession number of ZurXcc and ZurE. coli are AAU06119 and AAN83443, respectively; Black boxes indicate the identical residues; Arrows
indicate the cysteine residues studied in this work and the number above an arrow is the position of the cysteine in ZurXcc and ZurE. coli
图 2构建表达带有特定位点氨基酸置换的 ZurXcc蛋白的重组
质粒的策略
注:以 Xcc8004总 DNA为模板,分别用引物对 1430F/1430MR
和 1430MF/1430R进行 PCR扩增,将长度为 833 bp的 zur基
因(包括启动子和编码区)扩增为两个片段(片段 A和 B);在设
计引物时,除了将需要的突变碱基从引物 1430MR和 1430MF
中导入外 , 为了使得能够将片段 A 和 B 通过融合 PCR
(Kuwayama et al., 2002) 连接起来,还需要使引物 1430MR和
1430MF有 15 bp的序列相互互补;通过融合 PCR 将片段 A
和片段 B连接成一个完整的 833 bp的带有编码特定位点的
氨基酸置换突变的突变体 zur 基因片段后 , 再克隆到载体
pLAFR上,获得表达特定位点的氨基酸置换的突变体 ZurXcc
的重组质粒;●代表改变的碱基
Figure 2 Schematic presentation of the strategy used for construc-
tion of a recombinant plasmid expressing a ZurXccc protein with a
required amino acid substitution
Note: The 833 bp wild type zur gene (including promoter) was
amplified as two fragments (A and B) by PCR using Xcc8004 to-
tal DNA as template and the primer pairs 1430F/1430MR and
1430MF/1430R, respectively; The required mutations were intro-
duced through primers 1430MR and 1430MF; To ensure frag-
ments A and B can be linked together by fusion PCR (Kuwayama
et al., 2002), 1430MR and 1430MF must have 15 bp overlap se-
quences; The 833 bp mutated zur gene, which was obtained by
ligation of fragments A and B using fusion PCR, was cloned into
the vector pLAFR6 to generate the plasmid expressing a Zur pro-
tein with a wanted amino acid substitution; ● Indicates the al-
tered nucleotide
361
十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
Functional Analysis of Four Cysteine Residues in the Zinc Uptake Regulator of X. campestris pathovar campestris
1.3 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168是 ZurXcc调控锌离子
平衡必需的
为了确定 Cys125·Val、Cys128·Leu、Cys165·Ile 和
Cys168·Tyr氨基酸置换对 ZurXcc功能的影响，我们通过三
亲本接合分别将重组质粒 pZurXccC125V、pZurXccC128L、
pZurXccC1165I和 pZurXccC168Y导入 1430nk中，获得互
补菌株 C1430nkC125V、C1430nkC128L、C1430nkC1-
65I和 C1430nkC168Y (表 1)。接着，我们检测了这些
互补菌株的 Zn2+敏感性、胞外多糖产量和致病力，
并和野生型菌株 Xcc8004 以及带有表达野生型
ZurXcc的质粒(pXC1430)的 zur突变体(C1430nk)的相关
表型进行比较。表 2所列是所有被测 Xcc菌株的检
测数据。
首先，我们分析 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168氨
基酸置换对 ZurXcc的调控锌离子平衡能力影响。从表
2可以看到，野生型菌株 Xcc8004在含有终浓度为
400 μmol/L 的 ZnSO4的丰富培养基 NYG中生长良
好 (OD600=1.22)，而在同样培养条件下 zur 突变体
1430nk的生长非常差(OD600=0.13)，而当表达野生型
ZurXcc的质粒 pXC1430导入 zur突变体 1430nk后(互
表 1本研究使用的质粒和菌株
Table 1 Bacterial plasmids and strains used in this work
菌株和质粒
Strains or plasmids
大肠杆菌
E. coli
JM109
十字花科黑腐病菌
Xcc
8004
1430nk
C1430nk
C1430nkC125V
C1430nkC128L
C1430nkC165I
C1430nkC168Y
Plasmids
pLAFR6
pRK2073
pZurXccC125V
pZurXccC128L
pZurXccC165I
pZurXccC168Y
特性
Relevant characteristics
大肠杆菌,基因型: RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1△ (lac-proAB)/F
[traD36, lacIq, lacZ△M15]
E. coli, RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1△ (lac-proAB)/F [traD36, lacIq,
lacZ△M15]
Xcc野生型菌株;抗利福平
Xcc wild type strain; Rifampicin resistance (Rifr)
8004中 zur::pK18mob;抗利福平,卡那霉素
As 8004, but zur::pK18mob, Rifr, Kanr
1430nk中含有质粒 pXC1430;抗利福平,卡那霉素,四环素
1430nk harboring pXC1430, Rifr, Kanr, Tcr
1430nk中含有质粒 pZurXccC125V;抗利福平,卡那霉素,四环素
1430nk harboring pZurXccC125V, Rifr, Kanr, Tcr
1430nk中含有质粒 pZurXccC128L;抗利福平,卡那霉素,四环素
1430nk harboring pZurXccC128L, Rifr, Kanr, Tcr
1430nk中含有质粒 pZurXccC165I;抗利福平,卡那霉素,四环素
1430nk harboring pZurXccC165, Rifr, Kanr, Tcr
1430nk中含有质粒 pZurXccC168Y;抗利福平,卡那霉素,四环素
1430nk harboring pZurXccC168Y, Rifr, Kanr, Tcr
广谱载体质粒;抗四环素
Broad host range cloning vector, Tcr
接合帮助质粒; Tra+, Mob+, ColE1,抗链霉素
Helper plasmid, Tra+, Mob+, ColE1, Spcr
pLAFR6带有编码 C125→V置换的 Zur的 DNA片段;抗四环素
pLAFR6 containing a mutated zur gene that encodes Zur with C125→ V, Tcr
pLAFR6带有编码 C128→L置换的 Zur的 DNA片段;抗四环素
pLAFR6 containing a mutated zurgene that encodes Zur with C128→ L, Tcr
pLAFR6带有编码 C165→ I置换的 Zur的 DNA片段;抗四环素
pLAFR6 containing a mutated zur gene that encodes Zur with C165→ I, Tcr
pLAFR6带有编码 C168→Y置换的 Zur的 DNA片段;抗四环素
pLAFR6 containing a mutated zur gene that encodes Zur with C168→ Y,Tcr
来源
Reference or source
Yanisch-Perron et al., 1985
Daniels et al., 1984
Tang et al., 2005
Tang et al., 2005
本工作
This work
本工作
This work
本工作
This work
本工作
This work
Huynh et al., 1989
Leong et al., 1982
本工作
This work
本工作
This work
本工作
This work
本工作
This work
362
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
补菌株 C1430nk)，能够完全恢复 zur突变体在该培养
条件下的生长(OD600=1.15)。但是，当表达Cys125·Val、
Cys128·Leu、Cys165·Ile和 Cys168·Tyr氨基酸置换 ZurXcc
的质粒(pZurXccC125V, pZurXccC128L, pZurXccC16 5I和
pZurXccC168Y)导入 zur 突变体 1430nk 后，却无法恢
复 zur 突变体在该培养条件下的生长(表 2)。这些结
果说明，这些氨基酸置换导致 ZurXcc丧失了调控锌离
子平衡的能力，因此证明 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168
是 ZurXcc调控锌离子平衡必需的。
1.4 Cys125 和 Cys168 是 ZurXcc 调控胞外多糖产生必
需的
现在我们来分析 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168氨
基酸置换对 ZurXcc的调控胞外多糖产生的能力的影
响。从表 2中的胞外多糖产量数据可以看到，野生型菌
株 Xcc8004和 zur突变体 1430nk的胞外多糖产量分
别为 9.7 g/L和 2.1 g/L，而带有表达野生型 ZurXcc的质
粒的互补菌株 C1430nk的胞外多糖产量为 9.1 g/L。说
明表达野生型 ZurXcc的质粒能够将 zur突变体 1430nk
的胞外多糖产量恢复到野生型水平。但是，表达
Cys125·Val 和 Cys168·Tyr 氨基酸置换 ZurXcc 的质粒
( pZurXccC125V 和 pZurXccC168Y )导入 zur 突变体
1430nk 后，却无法恢复 zur突变体的胞外多糖产量
(表2)。说明这两个氨基酸置换导致 ZurXcc丧失了调控
表 2 Cys125, Cys128, Cys165和 Cys168的氨基酸置换对 ZurXcc蛋白的功能的影响 X
Table 2 Effect of amino acid substitutions in Cys125, Cys128, Cys165and Cys168 on the biological function of Xcc Zur proteinX
菌株名称
Strain name
8004
1430nk
C1430nk
C1430nkC125V
C1430nkC128L
C1430nkC165I
C1430nkC168Y
携带的质粒
Plasmid carrying
无质粒
No plasmid
无质粒
No plasmid
pXC1430
pZurXccC125V
pZurXccC128L
pZurXccC165I
pZurXccC168Y
Zur蛋白中的氨
基酸置换情况
Amino acid substit
ution in Zur
无变化
No changes
无 Zur蛋白
No Zur protein
无变化
No changes
Cys125·Val
Cys128·Leu
Cys165·Ile
Cys168·Tyr
在 NYG培养基中的生(OD600)
Growth in NYG with (OD600)
1.28←0.066 a 1.22←0.083 a
1.33←0.085 a 0.13←0.019 b
1.32←0.148 a 1.15←0.095 a
1.19←0.088 a 0.19←0.037 b
1.49←0.196 a 0.17←0.033 b
1.38←0.036 a 0.17←0.038 b
1.33←0.153 a 0.18←0.015 b
胞外多糖产量(g/L)
EPS yield (g/L)
9.7←0.78 a
2.1←0.49 b
9.1←0.69 a
2.2←0.34 b
5.3←0.84 c
5.5←1.27 c
2.1←0.22 b
病斑长度(mm)
Lesion length (mm)
13.3←1.07a
1.22←0.81b
12.71←0.35a
10.59←0.31a
0.94←0.40 b
2.71←0.54 b
12.5←0.35 a
注: A:不添加 ZnSO4; B: 400 μmol/L ZnSO4; X:菌株的锌敏感性,胞外多糖产量和致病力的检测和数据统计分析按我们以前描述
的方法(Tang et al., 2005)进行;表中数据是三次实验的平均值←标准误;在同一列数据中,数值后标有不同的英文字母表示两个
数值存在显著差异(p=0.05)
Note: A: No added ZnSO4; B: 400 μmol/L ZnSO4; X: The zinc sensitivity, EPS production and virulence of Xcc strains were measured
as previously described (Tang et al., 2005); Data are the mean←standard deviation from three repeats; Different letters in data column
indicate significant difference at p=0.05
胞外多糖产生的能力，证明 Cys125和 Cys168是 ZurXcc
调控胞外多糖产生必需的。而表达 Cys128·Leu 和
Cys165·Ile氨基酸置换的 ZurXcc的质粒(pZurXccC128L和
pZurXccC165I)还能够部分互补 1430nk的胞外多糖产
量(表 2)，说明这两个氨基酸尽管不是 ZurXcc调控胞外
多糖产生必需的，但它们对 ZurXcc调控胞外多糖产生
有一定的作用。
1.5 Cys128 和 Cys165是 ZurXcc调控致病必需的
接着我们来分析 Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168氨
基酸置换对 ZurXcc调控致病的能力的影响。从表 2中
的致病力数据可以看到，在我们的检测条件下，接种野
生型菌株 Xcc8004和 zur突变体 1430nk的叶片的平
均病斑长度分别为 13.3 mm和 1.22 mm，而接种带有
表达野生型 ZurXcc蛋白的质粒的互补菌株 C1430nk的
叶片的平均病斑长度为 12.71 mm。证明表达野生型
ZurXcc的质粒能够将 zur突变体 1430nk的致病力恢复
到野生型水平。但是，表达 Cys128·Leu和 Cys165·Ile氨
基酸置换 ZurXcc的质粒(pZurXccC128L和 pZurXccC165I)
丧失了恢复 zur 突变体的致病力的能力，证明 Cys128
和 Cys165是 ZurXcc调控致病必需的氨基酸残基。而表达
Cys125·Val 和 Cys168·Try 氨基酸置换 ZurXcc 的质粒
(pZurXccC125V和 pZurXccC168Y)能完全恢复 zur突变
体的致病力，说明 Cys125和 Cys168不是 ZurXcc调控致
A B
363
十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
Functional Analysis of Four Cysteine Residues in the Zinc Uptake Regulator of X. campestris pathovar campestris
病必需的。
1.6 ZurXcc调控锌离子平衡、胞外多糖产生和致病在结
构上是可以分开的
最后我们来综合分析 Cys125、Cys128、Cys165 和
Cys168的氨基酸置换对 ZurXcc的调控锌离子平衡、胞外
多糖产生和致病的功能的影响。尽管 Cys125·Val和
Cys168·Try氨基酸置换丧失了 ZurXcc的调控锌离子平
衡和调控胞外多糖产生的能力，但对 ZurXcc的致病调
控能力没有任何影响。这一结果说明，ZurXcc调控致病
的功能是可以和调控锌离子平衡以及胞外多糖产生
的功能分开的。此外，Cys128·Leu和 Cys165·Ile氨基酸
置换丧失了 ZurXcc的调控锌离子平衡和调控致病的能
力，但对 ZurXcc的调控胞外多糖产生能力只有部分影
响。证明 ZurXcc调控胞外多糖产生的功能也是可以和
调控锌离子平衡以及控致病的功能分开的。因此，
ZurXcc调控锌离子平衡、胞外多糖产生和致病的功能
在结构上是可以分开的。
2讨论
锌吸收调控蛋白 Zur是一类锌响应转录调控蛋
白(zinc-responsive transcriptional regulator)，广泛存在
与革兰氏阴性和革兰氏阳性在细菌中，在调控细胞的
锌离子平衡中起核心作用(Hantke, 2005)。Zur调控细
胞锌离子平衡的基本原理是，Zur能够感受细胞中锌
离子的浓度并作出响应——当细胞中的锌离子浓度
达到一定值时，Zur蛋白中锌离子结合位点和锌离子
特异结合从而激活其抑制高亲和力锌离子吸收系统
基因转录的功能，因而避免更多的锌离子进入细胞
(Hantke, 2005)。研究表明，大肠杆菌 Zur蛋白(ZurE. coli)
的 Cys93、Cys96、Cys143和 Cys146半光氨酸残基是锌离子
结合位点，也是 ZurE. coli调控细胞锌离子平衡必需的氨
酸残基。本研究中，我们根据氨基酸序列分析结果，推
测十字花科黑腐病菌(Xcc)的 Zur蛋白(ZurXcc)的 Cys125、
Cys128、Cys165和 Cys168分别是与 ZurE. coli的 Cys93、Cys96、
Cys143和 Cys146相对应的半光氨酸残基，因此可能是
ZurXcc的锌离子结合位点。而进一步的功能分析结果
证明，这 4个半光氨酸残基是 ZurXcc调控锌离子平
衡必需的。这一结果支持我们的推测。但必须指出
的是，我们的结果不是直接证据；要完全证明
Cys125、Cys128、Cys165和 Cys168就是 ZurXcc的锌离子结
合位点，还需要对结合有锌离子的 ZurXcc进行精细
的结构分析。
目前，人们已经在许多细菌中对 Zur的功能进行
了鉴定，结果发现，在几乎所有细菌中，Zur在细胞锌
离子平衡调控中均是关键作用 (Patzer and Hantke,
1998; Gaballa and Helmann, 1998; Dalet et al., 1999;
Lindsay and Foster, 2001; Campoy et al., 2002; Tang et
al., 2005; Shin et al., 2007; Yang et al., 2007; Feng et al.,
2008; Schr觟der et al., 2010)。但值得注意的是，在某些
细菌中，Zur蛋白除了参与锌代谢过程外，还参与氨基
酸转运和致病等其它细胞过程。例如，我们研究组之
前的研究发现，在十字花科黑腐病菌(Xcc)中，zur基因
突变后，除了导致该菌对 Zn2+的敏感性增加外，还导
致该菌胞外多糖产量和致病力的降低，说明在 Xcc
中，Zur是一个多功能调控蛋白，它除了调控细胞锌平
衡外，还参与胞外多糖产生和致病过程的调控(Tang
et al., 2005)。尽管目前人们对 Zur调控细胞锌平衡的
机制已经有了较深入的了解，但对其参与其它代谢过
程的机制却还一无所知。在本研究中，我们通过研究
ZurXcc的 4个推测与锌离子结合的半光氨酸残基在锌
离子平衡、胞外多糖产生和致病调控中的作用，结果
发现 ZurXcc调控锌离子平衡、胞外多糖产生和调控致
病在结构和功能上都是可以分开的。我们的结果预
示，ZurXcc调控锌离子平衡、胞外多糖产生和调控致病
的途径是不同的。这一结果和我们之前的实验结果将
ZurXcc调控的锌离子平衡相关基因突变后并不影响
Xcc的胞外多糖产量和致病力(Huang et al., 2008)相
吻合；同时也进一步证明了我们最初的关于 zur突变
导致的胞外多糖产量和致病力的下降并非由于锌离
子平衡紊乱所致的推测(Tang et al., 2005)。目前，ZurXcc
调控 Xcc锌离子平衡的机制已经基本清楚(Huang et
al., 2008)，但其调控胞外多糖产生和致病的机制以及
感受锌离子浓度的机制还不清楚。我们的结果为研究
这些未明的机制提供了重要线索。
3材料与方法
3.1本研究使用的细菌菌株、质粒和引物，以及细菌的
培养条件
表 1所列是本研究使用的质粒和菌株。表 3所列
是本研究使用的引物
大肠杆菌和 Xcc的培养：大肠杆菌在 LB培养基
(Miller, 1972)，37℃培养。Xcc 在丰富培养基 NYG
(Daniels et al., 1984)，28℃培养。必要时加抗菌素利福
平(终浓度: 50 g/mL)或 /和四环素(终浓度: 5 g/mL)。
3.2 DNA操作和质粒接合转移方法
DNA操作按 Sambrook 等(1989)描述的方法进
行。大肠杆菌和 Xcc的质粒接合转移实验按 Turner
等(1985)描述的方法进行。
364
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 3本研究使用的引物
Table 3 Primer pairs used in this study
引物对名称
Primer pair name
1430F/1430C125VR
1430C125VF/1430R
1430F/1430C128LR
1430C128LF/1430R
1430F/1430C165IR
1430C165IF/1430R
1430F/1430C168YR
1430C168YF/1430R
引物序列(5 to 3)a
Sequence (5 to 3)a
cccggatcccccaggtcagcccggacatttcgc/atggcagcggtcg(ca)acgatcaggaac
cgttcctgatc(tg)gtcgaccgctgcca/actaagcttccactagcagcggctcgattcacgc
cccggatcccccaggtcagcccggacatttcgc/caccgcgctatgg(ca)aggcggtcgcag
ctgcgaccgc(tg)ctccatagcgcggtg/actaagcttccactagcagcggctcgattcacgc
cccggatcccccaggtcagcccggacatttcgc/gcgcacttggca(ca)atcaggccgtgca
tgcacggcctg(tg)attgccaagtgcgc/actaagcttccactagcagcggctcgattcacgc
cccggatcccccaggtcagcccggacatttcgc/aacccgcagccgc(g)ccacttggcaca
tgtgccaagtg(c)ggcggctgcgggtt/actaagcttccactagcagcggctcgattcacgc
引物用途及产物长度(bp)
Purpose and product length (bp)
扩增编码 C125V氨基酸置换突变体
Zur的A片段, 501 bp
Amplify theAfragment ofC125VZur, 501bp
扩增编码 C125V氨基酸置换突变体
Zur的 B片段, 345bp
Amplify theB fragment ofC125VZur, 345bp
扩增编码 C128L氨基酸置换突变体
Zur的A片段, 510 bp
Amplify theAfragment ofC128LZur, 510bp
扩增编码 C128L氨基酸置换突变体
Zur的 B片段, 336 bp
Amplify theB fragment ofC128LZur, 336bp
扩增编码 C165I氨基酸置换突变体
Zur的A片段, 620 bp
Amplify theAfragment ofC165IZur, 620bp
扩增编码 C165I氨基酸置换突变体
Zur的 B片段, 226 bp
Amplify theB fragment ofC165IZur, 226 bp
扩增编码 C168Y氨基酸置换突变体
Zur的 A片段, 632 bp
Amplify theAfragment ofC168YZur, 632bp
扩增编码 C168Y氨基酸置换突变体
Zur的 B片段, 214 bp
Amplify theB fragment ofC168YZur, 214bp
注: a序列中带下划线的为人为加上的酶切位点;括弧内的碱基为原来的碱基而方框内的是突变后的碱基
Note: aAdded restriction sites are underlined; nucleotides in parentheses indicate the original nucleotides and boxed nucleotides indi-
cate the altered nucleotides
3.3质粒和菌株的构建
质粒构建：表达特定位点氨基酸置换 Zur蛋白的
重组质粒的构建按图 2所示的实验流程进行。表达
Cys125·Val置换的突变体 ZurXcc的质粒pZurXccC125V
的构建过程是：以 Xcc8004的总 DNA为模板，分别
用引物对 1430F/1430C125VR和 1430C125VF/1430R
(表 3)进行 PCR，扩增出长度分别为 501bp的片段 A和
345 bp的片段 B。接着，通过融合 PCR方法(Kuwa-
yama et al., 2002)将片段 A和 B连接成一个完整的
片段，然后再将这一 DNA片段克隆到载体 pLAFR6
上即得到重组质粒 pZurXccC125V。除了使用的引物
不同外，表达 ZurXccCys128·Leu、ZurXccCys165·Ile 和
ZurXccCys168·Tyr氨基酸置换突变体 ZurXcc的重组质粒
pZurXccC128L、pZurXccC165I和 pZurXccC168Y (表 1)的
构建方法和构建 pZurXccC125V 的方法相同。构建
pZurXccC128L、pZurXccC165I 和 pZurXccC168Y 使用的
引物分别为：1430F/1430 C128LR和 1430C128 LF/14
30R、1430F/1430C165IR和 1430C165IF/1430R、以及
1430F/1430C168YR和1430C168YF/1430R (表3)。
菌株构建：在帮助质粒 pRK2073帮助下，通过三
亲本接合将质粒 pZurXccC125V、pZurXccC128L、pZurXcc-
C165I和 pZurXccC168Y从大肠杆菌 JM109分别转入
Xcc的 zur突变体 1430nk中，获得互补菌株 C1430nk-
C125V、C1430nkC128L、C1430nkC165I和 C1430nk-
C168Y (表 1)。
3.4 Xcc的锌敏感性、胞外多糖产量和致病力的检测
Xcc的锌敏感性、胞外多糖产量和致病力的检测
按我们以前描述的方法(Tang et al., 2005)进行。
作者贡献
唐东阶和臧宁是本研究的实验设计者及负责
人，是实验研究的主要执行人；张雨和王谜参与部分
实验；唐纪良参与实验设计和实验结果分析；唐东阶
和臧宁完成数据分析、论文写作及修改；全体作者都
365
十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白中四个半胱氨酸残基的功能分析
Functional Analysis of Four Cysteine Residues in the Zinc Uptake Regulator of X. campestris pathovar campestris
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究所需经费获国家自然科学基金项目(3067-
1142)资助。
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