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中国农学通报 2011,27(22):162-166
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜
变种引起的一种全球性病害，其发生普遍，可造成十字
花科蔬菜品质和产量严重下降[1]。该病害1973年最早
基金项目：国家自然科学基金课题项目“花椰菜-黑芥抗病异附加系的培育与鉴定”（30771206）；北京市科技计划项目“农村科技协调员支撑服务工
程”（Z09090501040904-4）。
第一作者简介：翟文慧，女，1984年出生，内蒙古人，硕士研究生，主要从事野油菜黄单胞菌致病型的分化研究。通信地址：100097北京市海淀区曙光
花园中路9号北京市农林科学院植物保护环境保护研究所Tel：010-51503434，E-mail：wenhuizhai@hotmail.com。
通讯作者：严红，女，1960年出生，北京人，副研究员，主要从事园艺作物的细菌病害及其生防技术研究。通信地址：100097北京市海淀区曙光花园中
路9号北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，Tel：010-51503434，E-mail：yanhong0219@yahoo.com.cn。
收稿日期：2011-03-01，修回日期：2011-05-27。
十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.
campestris）AFLP分析体系的建立及优化
翟文慧 1，贾春枫 2，周 莹 1，黄金宝 1，刘 凡 3，严 红 1
（1北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097；2青岛出入境检验检疫局，山东青岛 266001；
3北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）
摘 要：以英国华威大学收集的十字花科蔬菜黑腐病菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas
campestris pv.campestris）的6个生理小种菌株为材料，优化了该类菌种的AFLP分析体系包括DNA的提
取、Mse I/EcoR I酶切时间、扩增反应体系的组成及染色方法等步骤，建立了一套适于该菌种的AFLP分
析体系。该体系中各最优因素为：酶切体系为 50 µL，模板DNA用量为 600 ng，酶切体系中Mse I和
EcoR I各加入5 U，酶切温度为37℃，反应时间为4~6 h；预扩增产物稀释10倍进行选择性扩增；检测方
法为银染法，银染液中硝酸银含量为8 g/L且染色时间是15 min时效果最佳，该体系的建立为该类菌种
的分子水平遗传多样性研究提供了技术支撑。
关键词：十字花科蔬菜黑腐病；Xanthomonas campestris；AFLP
中图分类号：S432 文献标志码：A 论文编号：2011-0493
Construction and Optimization of an efficient System for Xanthomonas campestris pv. campestris
AFLP Analysis
Zhai Wenhui1, Jia Chunfeng2, Zhou Ying1, Huang Jinbao1, Liu Fan3, Yan Hong1
(1Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097;
2Qingdao Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao Shandong 266001;
3Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097)
Abstract: 6 isolates of Xanthomonas campestris pv. campestris collected by University of Warwick was used
as the materials. The affect factors of AFLP were optimized, which were DNA extraction method, digestion time
of Mse I/EcoR I, compositions of PCR reaction system and staining method, and an efficient system for X.
campestris pv. campestris AFLP analysis was established. The optimized factors were: the digestion system was
50 μL, the DNA template was 600 ng, the Mse I and EcoR I were both 5 U, the temperature was 37℃, reaction
time was 4-6 h, pre-amplified products were diluted 10-fold for next selective amplification, the detection
method was silver staining (AgNO3 content was 8 g/L and staining time was 15 min or so). The system was a
powerful support for molecular level of genetic diversity in X. campestris pv. campestris.
Key words: crucifers black rot; Xanthomonas campestris; AFLP
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翟文慧等：十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）AFLP分析体系的建立及优化
在美国各地大规模发生[2]，20世纪90年代，非洲大部分
国家的十字花科蔬菜上也发生了该病害，成为制约该
地区十字花科蔬菜安全生产的主要病害[3-4]。中国的十
字花科蔬菜黑腐病20世纪50年代末最早在华北地区
发生，到 70年代中期时，已对十字花科蔬菜的生产造
成了一定威胁，其中北京、山东、山西等地发生较为严
重[5-6]；至80年代，该病在全国各地已普遍发生，从黑龙
江到海南岛均有，对中国十字花科蔬菜的生产造成严
重危害，而且使蔬菜的品质也受到很大影响[6-9]。该病
害 的 病 原 菌 为 野 油 菜 黄单胞菌野油菜变种
（Xanthomonas campestris pv. campestris），具有生理小
种分化现象，目前国际上最常报道的有6个生理小种[10-11]，
关于X. campestris pv. campestris生理小种及其遗传分
化的研究在中国未见公开报道，AFLP（Amplified
Fragment Length Polymorphism）分析体系的建立将为
快速明晰中国X. campestris pv. campestris的分子水平
的遗传分化提供了便捷的技术支撑。
AFLP即扩增片段长度多态性，最早是由荷兰科
学家Zabeau和Vos在 1993年发展起来的一种DNA多
态性的检测方法[12-13]。该技术最初主要用于植物遗传
育种上的分子标记、种质资源的鉴定等，现已被广泛
用于动植物和微生物的遗传多样性分析、遗传图谱构
建、医疗诊断、系统发育及分类等研究领域。AFLP既
包含了RFLP分析的可靠性又兼顾了 PCR的一些便
捷特点，是一种相对简单、快速和可靠的DNA分析技
术[14]。在细菌研究领域，AFLP已被用于梭状芽孢杆菌
属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、假
单胞菌属和黄单胞菌属等的流行病学调查、分型及鉴
定[15]。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 试 验 中 所 用 6 株 X. campestris pv.
campestris菌株均购自英国华威大学，详见表1。
1.1.2 试剂 dNTPs（2.5 mmol/L）、Ex Taq酶（2.5 U/µL）
为大连Takara公司产品，EcoRI（10 U/µL）、MseI（10 U/
µL）为美国NEB公司产品。EcoRI、MseI接头及引物
序列由上海生物工程有限公司合成。丙烯酰胺、甲叉
双丙烯酰胺为美国Sigma公司产品，过硫酸铵等其它
化学试剂均为北京化学试剂公司产品。
固定液：冰醋酸 10 mL/L，无水乙醇 200 mL/L，去
离子水 1800 mL/L。染色液：AgNO3 5 g/L。显影液：
NaOH 30 g，37%甲醛 10 mL/L。终止液：无水Na2CO3
15 g/L。
1.1.3 仪器 高压垂直电泳为Bio-rad公司产品（电源
PowerpacTM，电泳槽Sequi-Gen GT）。
1.2 方法
1.2.1 样品全基因组DNA的提取和质量检测 参考分
子克隆（第 3 版）的 CTAB 法并稍加改进进行 X.
campestris pv. campestris的全基因组DNA提取，采用
琼脂糖凝胶电泳检测提取全基因组DNA的纯度和浓
度。吸取1 µL的待测DNA样品，用已知浓度的λDNA
Mark作对照，进行 0.8%的琼脂糖凝胶电泳，用EB染
色后，在Gel DocTM XR+ Imaging Syste（BIO-RAD公
司）下拍照记录并观察样品DNA与Mark的亮度和分
散程度，对DNA样品的质量和浓度做出评价，合格样
品存放于-20℃，备用。
1.2.2 样品的全基因组DNA酶切 本试验采用EcoR I
和Mse I两种限制性内切酶进行酶切。酶切体系为50 µL
时，DNA样品模板设计 5个梯度即 200 ng、400 ng、
600 ng、800 ng和1000 ng。为了获得X. campestris pv.
campestris基因组DNA双酶切的最佳时间，将反应液混
匀后置于37℃分别酶切2、4、6、8、10 h和20 h。
1.2.3 接头连接 接头序列由上海生物工程技术服务有
限公司合成后稀释到适宜的工作浓度（EcoRI adapter
（5 pmol/µL），MseI adapter（50 pmol/µL）。将EcoRI和
MseI的单链接头分别等量混合，在 95℃中变性 5 min
后，室温冷却，使单链接头自动复性为双链接头。取
5 μL经过酶切的DNA样品，加入EcoRⅠ接头、MseⅠ
接头以及 T4 DNA 连接酶，连接体系为 T4 DNA
Ligaes buffer（含ATP）2 µL，EcoRI adapter（5 pmol/µL）
1 µL，MseI adapter（50 pmol/µL）1 µL，T4 DNA Ligaes
（5 U/µL）0.4 µL，用ddH2O补齐10 μL，16℃连接过夜。
1.2.4 预扩增反应 试验中所用的引物均由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成后稀释到适宜的工作浓
度（10 µmol/L）取连接后的样品5 μL，用EcoRⅠ、MseⅠ
预扩增引物，Ex Taq酶进行预扩增，扩增体系为：酶切连
接完成的样品 5 µL，预扩增引物（E接头引物/M接头
引物，10 µmol/L/10 µmol/L）各 0.7 µL，dNTPs 2 µL，
生理
小种
1
2
3
4
5
6
HRI
编号
3811
3849A
5212
1729A
3880
6181
病原菌
X. campestris pv. campestris
X. campestris pv. campestris
X. campestris pv. campestris
X. campestris pv. campestris
X. campestris pv. campestris
X. campestris pv. campestris
寄主
Brassica oleracea
B. oleracea
B. oleracea
B. oleracea
B. oleracea
B. rapa
表1 菌株来源
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PCR buffer（10×）2.5 µL，Taq酶0.2 µL，然后用ddH2O补
齐至总体系25 µL。扩增程序为94℃ 2 min；94℃ 30 s，
56℃ 30 s，72℃ 1 min，20个循环；72℃ 5 min。扩增结束
后，将预扩增产物稀释5、10、20、30、40、50倍置于-20℃
冰箱保存备用。
1.2.5 选择性扩增 分别取稀释 5倍、10倍、20倍、30
倍、40倍和 50倍的预扩增产物各 5 μL进行选择性扩
增，扩增体系为预扩增样品 5 µL，选择性扩增引物（E
系列引物/M 系列引物，10 µmol/L/10 µmol/L）各
0.7 µL，dNTPs 2 µL，PCR buffer（10×）2.5 µL，Taq 酶
0.2 µL，然后用 ddH2O补齐至总体系 25 µL，扩增程序
为 94℃ 2 min；94℃ 30 s，65℃（ -0.7/Cycles）30 s，
72℃ 60 s，12个循环；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，
23个循环；72℃ 5 min。
1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
（1）6%聚丙酰胺凝胶电泳：电泳缓冲液为1×TBE，
80 W恒功率预电泳 30 min后上样，样品混入 loading
buffer后 95℃变性 3 min上样 8 μL，80 W恒功率电泳
2 h左右结束。
（2）染色：电泳结束将玻璃板从电泳槽取下，小心
分开两块玻璃板，将带胶的平板放入固定液中，在摇床
上固定 40 min以上至指示剂完全脱色；水洗 3 min；银
染15~20 min，然后快速水洗；放入显影液中，直至纹带
出现；终止反应，放入终止液中 5 min；水洗；胶放在室
温下自然晾干。
2 结果与分析
2.1 全基因组DNA的提取及质量检测
根 据 1.2.1 中 的 方 法 提 取 X. campestris pv.
campestris全基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，
如图1。
由图 1推知，1和 2号生理小种的全基因组DNA
约80 ng，3号生理小种全基因组DNA约10 ng，纯度符
合本试验要求。
2.2 模板DNA浓度的确定
不同模板浓度在同一酶切体积下，酶切效果是不
同的。酶切时设计了DNA的量分别为 200、400、600、
800、1000 ng共 5个梯度，酶切结果如图 2。由图 2推
知，DNA 200 ng、400 ng的酶切产物量较少，其余量则
相对较为合适，所以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种
AFLP分析DNA模板用量以 600~1000 ng为宜，太少
则其产物的量不够，太多则容易导致酶切不充分。综
合考虑到经济等方面的因素，确定X. campestris pv.
campestris AFLP 用酶切体系最佳的 DNA 用量为
600 ng。
2.3 酶切时间对酶切反应的影响
反应液混匀后置于37℃分别酶切2、4、6、8、10 h和
20 h。样品酶切不同时间后经 1%琼脂糖凝胶电泳后
的结果如图 3，说明 2 h 就能将 X. campestris pv.
1~8为λDNA 10，20，30，40，50，60，70，80 ng
9~11为1、2、3号生理小种的全基因组DNA
图1 DNA质量检测
1000
750
500
250
100
bp
2000
1~5为样品，样品量分别为200，400，600，800，1000 ng；M为Marker
图2 不同样品浓度的酶切结果
1000
750
500
250
100
bp
2000
M为marker；1~6道分别为酶切2、4、6、8、10、20 h产物
图3 不同酶切时间对酶切结果的影响
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翟文慧等：十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）AFLP分析体系的建立及优化
campestris DNA部分切开。随着时间进一步延长，酶
切越来越充分，由此可见，适当增加酶切时间，可以提
高酶切效果，但是时间过长，势必延长整个试验周期。
为了节省时间并且保证双酶切的充分，确定酶切时间
为4~6 h。双酶切充分后，进行连接。
2.4 预扩增产物稀释倍数的影响
预扩增反应产物进行稀释后用作选择性扩增反应
的模板，用M-CAT/E-ACA引物组合进行选择性扩增，其
产物琼脂糖凝胶电泳结果如图4。从图4中可看出，稀释
5、10、20、30、40、50倍的预扩增产物都可以得到比较稳
定的选择性扩增条带，虽然AFLP对DNA的浓度要求不
严格，但低于1×10-12 g/μL时得到的AFLP指纹样式往往
不可靠，因此确定预扩增产物的稀释倍数为10倍。
2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
在选择性扩增后，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳，然后通过银染法进行染色。在整个银染过程中要
注意硝酸银的含量和银染时间。经反复试验，以银染
液中硝酸银含量 8 g/L并且染色时间为 15 min时染色
效果最佳。此外，还要掌握好染色后漂洗时间和显色
时间，在染色结束后的漂洗时间尽量不要超过 5 s，否
则显影时造成“白板”或者染色较浅，不易分辨。部分
银染结果如图 5，该图为 6个菌株引物筛选银染结果，
可见条带清晰、丰富。
3 结论与讨论
通过探索，我们成功的建立了一套适用于 X.
campestris pv. campestris的AFLP分析体系，体系中各
最优因素为：当酶切体系为 50 µL时，模板DNA用量
为 600 ng，酶切体系中Mse I和EcoR I各加入 5 U，酶
切温度为37℃，反应时间为4~6 h；预扩增产物稀释10
倍进行选择性扩增；检测方法为银染法，银染液中硝酸
银含量为 8 g/L且染色时间是 15 min时效果最佳。该
方法的建立为以后利用 AFLP技术对 X. campestris
pv. campestris进行遗传多样性研究提供了标准化的程
序。
目前，中国尚未见到通过 AFLP来快速鉴定 X.
campestris pv. campestris致病型分化的相关报道。在
细菌领域，国外诸多学者已经开始利用分子标记来快
速鉴定病原菌的生理小种。本研究的目的就是建立起
适合X. campestris pv. campestris进行AFLP分析的体
系，为下一步建立X. campestris pv. campestris各生理
小种的快速鉴定分子标记提供基础。
AFLP试验结果的准确性和可靠性取决于多方面
因素，既有样品质量问题，也要考虑操作技术。提取高
质量的DNA是试验成功的前提之一。高质量的DNA
既要求DNA分子具备完整性，又要符合一定的纯度要
求。若DNA断裂较多，会造成酶切片断不能充分样品
本质，最终指纹图谱的可靠性就会降低甚至完全不能
反映真实的情况。
DNA酶切的彻底性和接头连接的充分性也是影
响因素之一。如果DNA酶切不完全，酶切片段覆盖不
1~6道的分别为稀释5、10、20、30、40、50倍的预扩增产物；
M为Marker
图4 不同稀释倍数的模板的选择性扩增电泳检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
图5 选择性扩增产物的银染结果
1~24为 6个生理小种的选择扩增产物，1~6泳道为引物 E113/
M113，7~12泳道为引物E112/M112，13~18泳为引物E13/M13，19~24泳
道为引物E11/M11。
250
500
750
1000
2000
bp
150
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了整个基因组，反映的则不是真实的多态性，也就难以
建立真实的分子指纹图谱；酶切时间的长短是影响模
板DNA能否酶切完全的一个重要因素，时间过于短
暂，酶切肯定不完全，酶切时间过长，既浪费时间又可
同时造成DNA片段的降解，所以一定要掌握好酶切时
间；为了保证样品酶切完全，酶切时间与样品的纯度具
有一定的相关性，纯度越高，完全酶切所需要的时间越
短。
在进行染色时，银染时间要把握好，时间过长会导
致“黑板”现象，背景发暗，不利于观察；从染色液中取
出来后漂洗时间不要超过5 s，否则很容易造成“白板”
现象或者染色较浅，不易分辨带纹。由于AFLP试验
流程较长，步骤较多，涉及因素也较多，所以具体操作
中容易出现问题。为了成功建立野油菜黄单胞菌野油
菜致病变种AFLP体系，在试验中必须严格按实验流
程操作。
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