全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Apr． 2015，35(2):288 － 294 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 11931 /guihaia． gxzw201408020
黄守程，刘爱荣，叶梅荣． 大豆 GmDnaJ1蛋白对几种重金属胁迫的响应研究［J］． 广西植物，2015，35(2):288 －294
Huang SC，Liu AＲ，Ye MＲ． Expression characterization of soybean GmDnaJ1 in response to heavy metal stresses［J］． Guihaia，2015，35(2):288 －294
大豆 GmDnaJ1 蛋白对几种重金属胁迫的响应研究
黄守程，刘爱荣*，叶梅荣
(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100 )
摘 要:通过对大豆铝胁迫下的转录组测序分析，发现一个差异表达的基因，其编码一个具有 101个氨基酸残
基的 DnaJ-like分子伴侣蛋白-GmDnaJ1(Glycine max DnaJ1)，等电点为 8． 97;序列分析表明该蛋白具有典型的
高度保守的 J domain功能域，是一种类型 III的 J蛋白;通过对其序列的同源性及进化关系分析，推测该蛋白可
能响应重金属胁迫。为进一步探究 GmDnaJ1是否能够对重金属胁迫产生应答反应，试验分别以 0或 100 μmol
·L-1 Cu2 +、Pb2 +和 Cd2 +溶液胁迫处理的不同时间(0、12、24、48和 72 h)大豆根尖 ＲNA为材料，通过实时定量
PCＲ研究了该蛋白基因的表达特征。结果表明:与对照相比，GmDnaJ1 受 Cu、Pb 和 Cd 等重金属的诱导而强
烈表达，呈现先升高后降低的趋势，其中 Pb、Cd处理 24 h后表达水平达到峰值，而 Cu处理 48 h后达到峰值;
此外，GmDnaJ1对 Cu、Pb和 Cd胁迫的响应程度也不同，表明该基因对这三种重金属的响应模式存在差异。
根据以上研究结果，推测大豆 GmDnaJ1蛋白不仅响应铝毒胁迫，而且可能在响应重金属胁迫方面具有重要的
作用，参与了大豆对重金属毒害的抵抗。该结果为深入研究 GmDnaJ1 在重金属胁迫响应中的功能及其分子
机制提供了一定的依据。
关键词:大豆;DnaJ-like蛋白;重金属胁迫;重金属响应;分子伴侣
中图分类号:Q945． 78 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)02-0288-07
Expression characterization of soybean GmDnaJ1
in response to heavy metal stresses
HUANG Shou-Cheng，LIU Ai-Ｒong*，YE Mei-Ｒong
(College of Life Sciences，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China )
Abstract:Although necessarily contributing to regulating the activities of the proteins that involved in maintaining
growth and development of living organisms，heavy metal elements，such as Cu，Pb and Cd，will become detrimental to
plants at excess concentrations in the environment． However，plants can respond to and survive in heavy metal contami-
nated conditions through different strategies，among which arousing multiple heavy metal-related genes is very essential．
Therefore，identification and functional analysis of crucial genes that associated with heavy metal response is of great im-
portance in elucidating the plant tolerance mechanism and finally improving the resistance to heavy metal stress． DnaJ
proteins，belonging to molecular chaperone family，were widely found to be very important in response to biotic and abiot-
ic stresses． In the present study，we first identified an aluminum responsive gene，GmDnaJ1，(Glycine max DnaJ1)from
soybean transcriptome sequencing data． Then we analyzed the sequence of this gene and found that it encoded a DnaJ-
like protein，containing 101 amino acids with the isoelectric point of 8． 97． By means of homogeneous analysis，we further
收稿日期:2014-11-25 修回日期:2015-03-17
基金项目:安徽省自然科学基金(KJ2013080);安徽科技学院自然科学研究项目(ZＲC2013372)。
作者简介:黄守程(1980-)，男，安徽六安人，硕士研究生，讲师，从事抗性生理及分子机制研究，(E-mail)huangsc@ ahstu． edu． cn。
* 通讯作者:刘爱荣，教授，从事植物抗性生理研究，(E-mail)liuar@ ahstu． edu． cn。
revealed that GmDnaJ1 had the highly conserved J domain structure，which was the typical characteristics of type III DnaJ
proteins． Phylogenetic analysis of GmDnaJ1 with other J proteins from different plant species implied that the protein
probably exerted its role in response to heavy metal stress． In order to investigate the possible function of GmDnaJ1，we
used pre-cultured and uniformly grown soybean seedlings and then treated with 0 or 100 μmol·L-1 Cu2 +，Pb2 + and Cd2 +
solutions． The root tips of each sample were subsequently harvested at 0，12，24，48 and 72 h，respectively． ＲNA were
extracted and subjected to reverse transcription． After that，real time quantitative PCＲ(ＲT-qPCＲ)was performed to re-
veal the expression patterns of GmDnaJ1 under different heavy metal stresses for different times． The results indicated
that comparing with the controls，GmDnaJ1 could be dramatically up-regulated by Cu，Pb and Cd stresses over time． The
expression level of GmDnaJ1 increased at first and then decreased． We noticed that the peak of GmDnaJ1 expression ap-
peared at 24 h after being treated with Pb or Cd solution，whereas the peak of the gene occurred at 48 h when the soybean
suffered from Cu stress;Furthermore，we observed that the extent of GmDnaJ1 expression varied in response to different
heavy metal elements，implying a possibility that GmDnaJ1 exhibited different response models when the plants suffered
from different heavy metal stresses． The above results suggested that the soybean GmDnaJ1 not only involved in alumi-
num response，but also played an important role in response to heavy metal stresses，such as Cu，Pb and Cd，and probably
participated in the resistance to heavy metal toxicity． The present findings will provide some experimental basis for the
functional analysis of GmDnaJ1 and its molecular mechanism in response to heavy metal stress．
Key words:soybean;DnaJ-like protein;heavy metal stress;heavy metal response;molecular chaperone
重金属 Cd、Pb、Ag、As等是植物非必需元素，较
低的浓度下即对植物产生毒害作用，导致生长发育
受抑甚至死亡(Gill，2014);而有些重金属如 Cu、Zn
等作为酶的活化剂，对植物生长是必需的，但当浓度
超过一定限度即损害植物的生长发育(Hall，2002)。
重金属进入细胞内会导致蛋白质的结构破坏，活性
丧失或影响细胞对其他营养元素的吸收(Van Ass-
chee et al．，1990;Dennis et al．，1994)。重金属胁迫
还导致 DNA的断裂(葛才林等，2002)、抑制细胞分
裂和维管束的形成等(Nilima et al．，2014)。Cu、Cd
和 Hg 抑制小麦种子萌发过程中淀粉酶的活性(葛
才林等，2002)，而 Cu、Zn 和 Cd 导致纤细角毛藻叶
绿体荧光参数 Fv /Fm和 Fv /Fo 下降，并显著降低叶
绿素含量，导致光合作用受抑(梁英等，2008)。草
坪植物早熟禾在 Cu、Zn、Cd和 Pb 的胁迫下，表现出
显著的根系生长受阻，生物量及叶绿素含量的下降
(多立安等，2006)。富集 Pb 的藓类植物在高浓度
Pb胁迫下也表现出光合色素的下降(龚双姣等，
2009)。此外，重金属胁迫还导致细胞膜系统和亚
细胞结构的破坏(杨丹慧，1991;Mishra et al．，1999;
韦江玲等，2014)。
植物在进化过程中产生多样化的对抗重金属胁
迫的机制，外部机制包括细胞壁(Bringezu et al．，
1999;刘清泉等，2014)和根系分泌物的排斥作用
(Ma et al．，1997)，内部机制包括活性氧介导的抗氧
化酶保护作用(Zhang et al．，2007)、植物螯合肽
(Phytochelatins)和金属硫蛋白(Metallothioneins)的
螯合作用(Cobbett et al．，2002)、热激蛋白(heat
shock proteins，HSPs)的保护作用(Lewis et al．，
1999;Lewis et al．，2001;Kim et al．，2014)、液泡的区
室化作用(Davies et al．，1992)以及有机酸和氨基酸
的解毒作用等(Boominathan et al．，2003;Dresler et
al．，2014)。
热激蛋白(heat-shock proteins，HSPs)是生物遭
受胁迫(如干旱、低温、重金属离子等)之后大量产
生的一类特殊蛋白质 (Morimoto，1993)。DnaJ
(HSP40)是最早在 E． coli 中发现的一种调节蛋白
(Hartl et al．，1994)，在动物、植物以及真菌中广泛
存在与 DnaJ 功能相似的蛋白，称为 DnaJ-like 蛋白
(Craig et al．，1993;Zhu et al．，1993;Kazutoyo，
1997)。DnaJ-like蛋白广泛分布于细胞内多个细胞
器(Ｒajan et al．，2009)，参与植物多种多样的胁迫应
答反应，在植物的生物与非生物胁迫中具有非常重
要的作用。如响应病原菌的侵染(Jelenska et al．，
2007;Koramutla et al．，2014;Wang G et al．，2014)、
增强植物对高温(Kong et al．，2014a，b)、干旱
(Wang G et al．，2014;Wang X et al．，2014)、盐
(Yang et al．，2010)以及重金属(Venkatachalam et
al．，2009)胁迫的抗性等。但目前关于 DnaJ-like 蛋
白在重金属胁迫中的研究较少。我们从大豆铝胁迫
下的转录组鉴定出一个差异表达的编码 DnaJ-like
蛋白的基因，命名为 GmDnaJ1。我们通过实时定量
9822 期 黄守程等:大豆 GmDnaJ1 蛋白对几种重金属胁迫的响应研究
PCＲ(real time quantitative PCＲ，ＲT-qPCＲ)探讨了该
基因在铜 (Copper，Cu)、镉 (Cadmium，Cd)、铅
(Plumbum，Pb)胁迫的表达特征，以期为进一步研究
DnaJ-like 蛋白在重金属胁迫中的功能及抗性机制
提供实验基础，并为增强植物在重金属胁迫环境下
的抗性提供潜在的靶标。
1 材料与方法
1． 1 材料准备与处理
选取大豆(Glycine max)品种 BaXi10 为材料。
大豆种子经 0． 1%升汞消毒 15 min 后，至少用蒸馏
水反复冲洗 5 次后置于装有珍珠岩培养盆中于 25
℃、黑暗中放置 1 d;萌发后于生长室内培养 2 d
(日 /夜温度为 26 ℃ /22 ℃，16 h /8 h 光周期，光照
强度 400 μmol·m-1·s-1，相对湿度 70%)，然后转
入 1 /2 Hoagland 营养液中培养 4 天，之后选取生长
良好且一致的幼苗进行 0 μmol·L-1 Al3 + (含 100
μmol·L-1 CaCl2，pH4． 6)或 50 μmol·L
-1 Al3 +(含
100 μmol·L-1 CaCl2，pH4． 6)处理，分别收集 48 h的
大豆根尖 ＲNA用于转录组测序。另外，分别配制含
有 100 μmol·L-1的 CdCl2、CuSO4和 Pb(NO3)2的
Hoagland溶液，对预培养 7 d 的大豆幼苗进行根胁
迫处理，再分别收集 0、12、24、48 和 72 h 根尖作为
实验材料用于后续分析。
1． 2 转录组测序
转录组测序由 Hiseq2000 平台进行，纯化并片
段化 mＲNA后反转录合成双链 cDNA，经处理后与
接头连接，然后纯化并构建 cDNA 文库用于高通量
测序。用 ＲPKM(Ｒeads Per Kilo bases per Million
reads)值衡量基因在样本中的表达，用 2-fold change
和 P-value进行表达差异判断。
1． 3 序列比对及分析
根据基因的 ID，从 Ensembl Plants网站(http:/ /
plants． ensembl． org / index． html)获取目的基因编码
蛋白的氨基酸序列号进行 Blast 比对(http:/ /blast．
ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi)，根据比对结果，选取
不同物种的相关基因序列，用 DNAman 软件进行多
重序列比对，用 MEGA6 软件构建 NJ(Neighbor-join-
ing)进化树。
1． 4 ＲT-qPCＲ表达验证
样品根尖总 ＲNA提取用 Trizol试剂盒(Takara)
进行。根据 Promega 公司的反转录试剂盒用 1 μg
总 ＲNA合成 cDNA第一链。将 cDNA 稀释 12 倍作
为模板备用。20 μL ＲT-qPCＲ 反应体系如下:4 μL
稀释的 cDNA、3 μL 2 μmol·L-1特异性引物和 10
μL SYBＲ Green Ｒeal-time PCＲ Master Mix(Toyobo)，
反应在 7300 Ｒeal Time PCＲ System(Applied Biosys-
tems)上进行。程序如下:95 ℃预变性 1 min，然后
95 ℃15 s，55 ℃ 15 s 和 72 ℃ 45 s，共 40 个循环。
每个样品做 3 个生物学重复和 3 个实验重复，以大
豆看家基因 GAPDH 为内参基因，采用相对定量法
对基因的表达模式进行分析，根据算式 2 －［ΔCt
(specific gene)－ ΔCt(specific gene)the lowest lev-
el］计算基因的相对表达量。所用引物如下:大豆
GmDnaJ1 基因(5-GAAAGCTCAGCGAACCAATT-3
和 5-TTCCCATTTCCTTCCACTTC-3)及大豆 GAPDH
基因(5-TGGACACTGGAAGCATCACG-3和 5-AA-
CAGTCTTCTGGGTAGCGG-3)。
1． 5 数据处理与分析
数据处理、差异显著性检验(T 检验，双尾，α =
0． 05)采用 GraphPad Prism 5 专业软件进行，图表绘
制采用 Microsoft Excel 2010 进行。
图 1 GmDnaJ1在铝胁迫下的差异表达情况 A． 高通
量测序结果;B． ＲT-qPCＲ结果 ＊＊ 表示处理组与对照组之
间在 P ＜ 0． 01 水平上差异显著。
Fig． 1 Differential expression of GmDnaJ1 in response to
Al stress A． High throughput sequencing results;B． ＲT-qPCＲ
results ＊＊ on the graph indicate significant difference (P ＜0． 01)
between Al treated and Al free samples． Data are shown as mean ± SD
(n =3)．
2 结果与分析
2． 1 GmDnaJ1 基因差异表达分析
转录组测序结果显示 GmDnaJ1 在对照样品中
092 广 西 植 物 35 卷
图 2 GmDnaJ1 与其他物种 DnaJ-like蛋白氨基酸 N-末端同源性比对分析
Fig． 2 Alignment comparison of N-terminal region of the deduced amino acid sequences
of GmDnaJ1 with the J proteins of other species
的 reads数是 63． 11，50 μmol·L-1 Al3 +胁迫下的 reads
数是 146． 77，Log2(fold-change)为 1． 22，p 值为 0．
038，表明该基因为差异表达的基因。ＲT-qPCＲ 进一
步验证显示该基因在 Al 处理下表达上调 3． 9 倍，表
明 GmDnaJ1可能参与大豆耐铝胁迫(图 1)。
2． 2 多序列比对及进化树分析
序列分析发现 GmDnaJ1 的开放阅读框(OＲF)
包含 306 个核苷酸，编码一个具有 101 个氨基酸残
基的多肽链，分子量为 11 556． 0 Da，等电点为 8． 97。
如图 2 所示，GmDnaJ1 氨基酸序列与其他具有 N-末
端的 DnaJ 蛋白的氨基酸序列进行了多重序列比对
表明，该蛋白的 N-末端(4 ～ 72 aa)具有高度保守的
J domain，但没有典型的富含甘氨酸结构域(G /P do-
main)、Cys 区域(CＲＲ domain)，因此可以推断
GmDnaJ1 属于类型 III DnaJ蛋白，即仅具有 J domain
而没有其他保守结构域。我们以多重序列的比对为
基础进行进化树分析，聚类结果显示 GmDnaJ1 与
AAB36543 具有较高的同源性(62． 9%)，暗示其可
能具有相似的功能(图 3)。Chai et al． (2000)研究
发现芸豆(Phaseolus vulgaris)的一个 DnaJ-like 蛋白
基因———PvSＲ6(AAB36543)受 Cu、Zn、Hg、Cd 和 As
等重金属的诱导而强烈表达。因此，我们推测
GmDnaJ1 可能也响应重金属的胁迫，参与胁迫
应答。
2． 3 Cu、Pb和 Cd 胁迫下 GmDnaJ1 不同时间点的
表达特征分析
为进一步探究 GmDnaJ1 对重金属胁迫的响应
1922 期 黄守程等:大豆 GmDnaJ1 蛋白对几种重金属胁迫的响应研究
图 3 GmDnaJ1与其他物种 J protein的进化树分析
芸豆(AAB36543)、欧洲大叶杨(EＲP60220)、大豆(ACZ57923)、
蓖麻(EEF49938)、葡萄(CBI39568)、玉米(NP_001151973)、白
云杉(AAB01572)、水稻(EAZ26617)、苜蓿(ACJ86084)、大豆
(ACU19837)、拟南芥(Q9SAG8)、拟南芥(AF214107)、拟南芥
(AAP21357)。线上数值代表分支长度。
Fig． 3 Phylogenetic relationship of GmDnaJ1 with other
J-proteins Phaseolus vulgaris(AAB36543)，Populus trichocarpa
(EＲP60220 )，Glycine max (ACZ57923 )，Ｒicinus communis
(EEF49938)，Vitis vinifera(CBI39568)，Zea mays(NP_001151973)，
Picea glauca(AAB01572)，Oryza sativa Japonica(EAZ26617)，Medi-
cago truncatula(ACJ86084)，Glycine max(ACU19837)，Arabidopsis
thaliana(Q9SAG8)，Arabidopsis thaliana(AF214107)，Arabidopsis
thaliana(AAP21357)． The numbers on each line indicate length of
the branch．
特征，我们用 ＲT-qPCＲ分析了 100 μmol·L-1 Cu、Pb
和 Cd处理不同时间下的 GmDnaJ1 表达模式。如图
4 所示，在对照组中，GmDnaJ1 表达量很低，而在不
同的重金属胁迫下表达量均急剧上升，表明 GmD-
naJ1 受 Cu、Pb和 Cd的诱导表达。我们发现在不同
重金属处理后，GmDnaJ1 的表达水平总体上呈现随
时间先升高后降低的趋势，但在 Pb、Cd处理 24 h后
表达水平即达到峰值，而在 Cu 处理 48 h 后其表达
水平才达到峰值，表明 GmDnaJ1 虽对不同重金属胁
迫有着相似的应答模式，但存在着响应时间的差异。
此外，该基因对三种重金属的响应能力存在差异，其
中 Cu处理 12、24、48 和 72h 后，其表达量分别是对
照的 61、83、140 和 88 倍;Pb 处理 12、24、48 和 72 h
后，其表达量分别是对照的 35、57、28 和 10 倍;而
Cd处理 12、24、48 和 72 h 后，其表达量分别是对照
的 165、807、331 和 388 倍。GmDnaJ1 对持续的重金
属胁迫的应答反应暗示着其可能参与了大豆对重金
属胁迫的解毒作用。
3 讨论与结论
现代工农业的飞速发展和随意排污导致了环境
污染的加剧，其中重金属污染在我国较为严重。我
国从 20 世纪 90 年代开始探索土壤重金属污染的植
物修复技术，并取得了一定成果(闫研等，2008;胡
鹏杰等，2014)。阐明植物对重金属的抗性机制是
培育超富集植物、提高植物在重金属环境中生长发
育能力的重要理论基础，而与重金属胁迫应答相关
基因的筛选、鉴定及功能分析是研究其分子机制的
前提条件。Zhen et al．(2007)通过大豆蛋白质组学
发现三个 DnaJ-like蛋白受铝诱导而强烈表达，其中
有两个蛋白是被新诱导表达，另一个蛋白在铝胁迫
24、48 和 72 h 的表达量分别是对照的 3． 75、11． 45
和 9． 07 倍。通过 cDNA 芯片方法分离铝胁迫下玉
米根系的基因表达差异，也发现一个在玉米中差异
表达的 DnaJ-like蛋白(Cancado et al．，2008)。
本文基于转录组高通量测序技术发现了一个受
铝胁迫而显著上调表达的 DnaJ-like 蛋白基因 GmD-
naJ1，具有一个 306 核苷酸组成的开放阅读框
(Open Ｒeading Frame，OＲF)，编码 101 个氨基酸残
基的 J蛋白(J protein)，包含一个高度保守的 J结构
域(J domain)。同源性分析表明该基因与芸豆
(Phaseolus vulgaris)的一个 DnaJ-like 蛋白———
PvSＲ6 具有较高的同源性，因 PvSＲ6 的表达受到重
金属的强烈诱导(Chai et al．，2000)，我们推测
GmDnaJ1 也响应重金属胁迫。ＲT-qPCＲ 结果显示
GmDnaJ1 确能响应 Cu、Pb 和 Cd 等重金属的胁迫，
在处理 12、24、48 和 72 h后呈现显著的上调表达模
式，且均在处理后 48 h内达到表达峰值，表明 GmD-
naJ1 能在短时间内迅速增强表达，以应对重金属导
致的胁迫效应，这与 Chai et al． (2000)的研究结果
相似，但随着时间的持续，可能由于植物的毒害程度
加剧，导致该基因的表达水平下降。从 GmDnaJ1 在
不同重金属胁迫下的表达特征来看，我们推测该基
因对这三种重金属的响应能力可能存在差异，表现
为对 Cu的耐受力较强，对 Pb 的耐受力次之，而对
Cd 的耐受力较弱。另外，GmDnaJ1 在三种重金属
胁迫下的表达量变化存在差异，推测可能是由于不
同重金属产生的胁迫程度的差异所导致。
292 广 西 植 物 35 卷
图 4 GmDnaJ1在不同重金属胁迫下的表达模式 ＊＊ 表示处理组与对照组之间在 P ＜ 0． 01 水平上差异显著。
Fig． 4 Expression patterns of GmDnaJ1 under different heavy metals treatments ＊＊ on the graphs indicate
significant difference (P ＜0． 01)between Al treated and Al free samples． Data are shown as mean ± SD (n =3)．
本文初步研究了大豆铝响应 DnaJ-like 蛋白基
因—GmDnaJ1 对三种重金属(Cu、Pb 和 Cd)胁迫的
响应特征，为深入理解重金属胁迫下分子伴侣的胁
迫响应特征提供一定的理论依据，但其响应机制并
不清楚;另外，该基因的诱导表达能否有效提高大豆
对重金属胁迫的抵抗能力，仍需进一步研究。下一
步工作将通过转基因过表达和 ＲNA 干扰(ＲNA in-
terference，ＲNAi)等手段继续探究 GmDnaJ1 的功能
及抗性机制。
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