全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2015，35(3)：431—436 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guihai&gxzw201408004
谭亚芳，李娟，胡树枝，等．鸦胆子苦醇抑制人前列腺癌DU145细胞生长及作用机制EJ]．广西植物，2015，35(3)：431—436
Tan YF，I』i J，Hu SZ，et a1．Inhibitory effects of brusatol on human prostate cancer cels DU145 and its molecular mechanism[J]．Guihaia，2015，35(3)
431— 436
鸦胆子苦醇抑制人前列腺癌 DU1 45
细
谭 亚芳
胞生长及作用机制
， 李 娟 ，胡树枝 ，江仁望
(1．暨南大学 药学院 中药及天然药物研究所 ，广州 510632；2．深圳岭南药材资源开发与应用工程实验室 ，广东 深圳 518057)
摘 要 ：中药鸦胆子是一种常用的抗肿瘤 中草药，鸦胆子苦醇是来源于鸦胆子的主要成分。该研究探讨了鸦
胆子苦醇(brusato1)对人前列腺癌 DU145细胞的生长抑制及其作用机制 。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检
测鸦胆子苦醇对不同细胞株的生长抑制情况 ，以及不同浓度的鸦胆子苦醇对 DU145细胞 的增殖抑制率 ；应用
Hoechst 33258染 色法 观察 鸦胆子 苦 醇处理 DU145细胞 后所 发生 的形态 学变 化；分别 采用 PI单 染及
Annexin—V—FITC双染法流式细胞术分析细胞周期分布个凋亡率的变化；以 Western blot测定鸦胆子苦醇对
MAPK信号通路相关蛋 白表达的影响。结果表明：鸦胆子苦醇对人前列腺癌 DU145细胞的抑制作用更为显
著 ，并且可以时间和剂量依赖性地抑制人前列腺癌 DU145细胞 的生长，其半数有效抑制浓度 IC 。为(0．274-
O．04)／~mol·L ；鸦胆子处理 DU145细胞后，Hoechst 33258染色可见到明显的凋亡特征；细胞周期 图中可见
明显 的亚二倍体峰 ，且随着作用时间的延长凋亡 比例增加 ，FCM 检测鸦胆子苦醇作用 24 h后凋亡图中，可见
凋亡的发生 ；Western blot检测表明鸦胆子苦醇处理后可使磷酸化的 p38和 JNK表达增加 ，使磷酸化 的 ERK
表达降低 。鸦胆子苦醇能显著抑制 DU145细胞增殖 ，诱导 DU145细胞凋亡。磷酸化的 P38和 JNK的表达
增加 ，但磷酸化的 ERK表达下降，这表 明 MAPK途径的活化可能是鸦胆子苦醇对 DU145细胞生长抑制的作
用机制之一。因此 ，鸦胆子苦醇是潜在的抗前列腺癌药物 ，有必要进一步在动物水平阐明其抗前列腺癌活性。
关键词 ：鸦胆子苦醇 ；人前列腺癌 DU145细胞 ；凋亡；MAPK
中图分类号 ：R285 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2015)03—0431—06
Inhibitory effects of brusatol on human prostate cancer
cells DU1 45 and its molecular mechanism
TAN Ya-Fang ，LI Juan ，HU Shu-Zhi ，JIANG Ren-Wang ，
(Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou
510632，China；2．Shenzhen Engineering Laboratory of Lingnan Herbal Resource Development and
Application，Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen 518057，China)
Abstract：Fructus Bruceae iS a Chinese Traditiona1 Medicine that commonly used for the treatment of tumor
diseases．Brusatol is one of the major active components in Fructus Bruceae．This study was to explore the inhibitory
effects of brusatol against proliferation of human prostate cancer DU145 cels，and the molecular mechanism of apop—
tosis induced by brusatol was further investigated．The inhibitory activities of brusatol against human prostate cancer
cells DU145 and PC3，hepatocellular carcinoma cel1 HeDG2，human breast adenocarcinoma cel1 MCF-7，human colon
收稿日期：
基金项 目：
作者简介：
通 讯作 者 ：
2014—08 20 修回日期 ：2014 12 3
国家教育部博士点基金(20114401110005)；中央高校基本科研业务费(11612603)；广东省高层次人才项 目(JN2010)。
谭亚芳(1990一)，女 ，湖南娄底人 ，硕士研究生，从事中药与天然药物抗肿瘤活性研究 ，(E—mail)tyflO06903782@163．corn。
江仁望 ，教授 ，从事中药与天然药物活性成分研究 ，(E mail)tr州iang@jnu．edu．cn。
432 广 西 植 物 35卷
adenocarcinoma cel HT-29，human pulmonary carcinoma cell A549 were assessed bv MTT assay．The time-and con—
centration-dependent inhibition by brusato1 on the most sensitive DU145 cells were further studied．and Hoechst
33258 staining was used to observe celular morphologic changes．The distribution of cel cycle and apoptosis were an
alyzed by flow cytometry through PI and Annexin-V／FITC-PI doubleqabeled staining．To further analyze the
possible mechanism of cell apoptosis，we investigated the protein expression levels of MAPK signaling pathway in
DU145 cels after treatment with brusatol by Western blot．At the same concentration，brusato1 showed the most po—
tent inhibition on the proliferation of DU145 cells in the M TT assay．Furthermore，brusato1 was found to inhibit
DU145 cel growth in a time—and concentration-dependent manner．The IC 。of the 48 h time course was(O．27_-L-O．04)
“mo1．L ．Apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining，which showed increased fragmented chromatin and
apoptotic bodies after the treatment with O．25／~mol·L of brusatol as compared with the solvent contro1．A typical
subdiploid peak was observed by flow cytometry，and the ratio of subdiploid peak was further increased with the
time．Apoptosis of DU145 cells was analyzed by AnnexinV／FITC-PI staining and flow cytometry detection．The ap
optosis rate was increased from 0．7 to 10．6 after the treatment of brusatol for 24 h，which confirmed that brusa—
tol could induce apoptosis．W estern blot analysis showed that brusatol can affect the expression levels of MAPK su—
perfamily at a concentration of O．25／amol·L after incubation for 45 min，1．5，3，6，12 and 24 h．Brusatol selectively
increased the phosphorylation of p38 and JNK，while decreased the phosph0rylation of ERK1／2，al in time-dependent
manners．Brusatol could significantly inhibit the proliferation of DU145 cels at a dose-and time-dependent manner，
and it could also induce cel apoptosis．The increased phosphorylation of p38 and JNK，while decreased phosphoryla—
tion of ERK1／2 suggested that mitogen activated protein kinase(MAPK)pathway might be involved in the brusatol
induced apoptosis on DU145 cells．Thus brusatol is a potential anticancer drug against the prostate cancer．Further
studies to reveal its anticancer properties at the animal level are warranted．
Key words：brusato1；human prostate cancer cels DU145；apoptosis；MAPK
前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤
之一 。根据美国的一项调查显示 ，前列腺癌发病率
已经超过肺癌发病率 ，跃居男性肿瘤之首 (Jemal et
n ．，2009)，前列腺癌 的治疗一直是个 难题 ，因此 寻
找高效的抗前列腺癌药物成为研究热点 。鸦胆子来
源于苦木科植物鸦胆 子(Brucea javanica)的干燥
成熟果实 ，鸦胆子中的苦木素内酯类化合物具有很
好 的抗 疟疾 (0’Neil et口z．，1987)、抗 肿 瘤作 用
(Yang etⅡz．，1997)、抗烟草花叶病毒(Shen et az．，
2008；Yan et＆z．，2010)、抗菌(桂平华等，2008)、抗
白血病(Polonsky et nz．，1980)、抗锥体虫病(Bawm
et a1．，2008)，是鸦胆子属植物的一类主要活性成分
(丁晨旭等，2006)。
鸦胆子苦醇(brusato1)是从鸦胆子 中提取得 到
的一种苦木内酯类化合物，目前关 于鸦胆子苦醇活
性的研究报道有抗 白血病(Mata—Greenwood et a1．，
2002；Cuendet et a1．，2004)、抗胰腺癌(Zhao et a1．，
2011)等，但目前尚未见有鸦胆子苦醇诱导前列腺癌
DU145细胞凋亡 的研究报道 。因此本研究初 步探
讨了鸦胆子苦醇抑制前列腺癌 DU145细胞生长作
用及其作用机制，为鸦胆子苦醇用于前列腺癌的临
床治疗提供理论基础。
l 材料与方法
1．1材料与试剂
四 甲 基 偶 氮 唑 盐 (MTT)、二 甲 基 亚 砜
(DMSO)、碘化丙 啶(PI)购 自 Sigma公司 ；DMEM
培养基、0．25 胰蛋 白酶购 自美 国 Gibco公司；胎牛
血清 、青霉素、链霉 素购 自美 国 Hyclone公司 ；Ho—
echst 33258染色液 、DNA Ladder抽 提试剂盒购 自
碧云天生物技术研究所 ；p38、P—p38、ERK、P ERK、
JNK 、P—JNK、l3一actin单克隆抗体及辣根过 氧化 酶
标记的羊抗兔购白Cel Signaling Technology公司。
1．2细胞培养
人前列腺 癌细胞 (DU145，PC3)、人肝 癌细胞
(HepG2)、人乳腺 癌细胞 (MCF一7)、人结 肠癌细胞
(HT一29)、人肺癌细胞(A549)购 自中国典型培养物
保藏 中心。以含 10 胎 牛血清及 1 青链霉 素的
DMEM 培养基 ，于 37℃、饱和湿度下 5％的培养箱
中培养，细胞呈单层贴壁生长，实验均取对数生长期
的细胞 。
1．3鸦胆子苦醇的制备
取鸦胆子药材 1O kg，粉碎并用 1O倍量 95％乙
3期 谭亚芳等 ：鸦胆子苦醇抑制人前列腺癌 DUI45细胞生长及作用机制 433
醇渗漉提取，过滤，合并提取液，减压浓缩得浸膏约
800 g。用水混悬，石油醚萃取 3次，合并萃取液，减
压浓缩得石油醚萃取部分 121 g。再用氯仿萃取 3
次，减压浓缩得氯仿萃取部分 32 g；最后，用正丁醇
萃取 3次，减 压浓缩得 正丁 醇部分 181 g，水部分
441 g。取 正 丁醇 的萃 取部 分 86 g，经 大 孔树 脂
D101层析 ，乙醇水梯度洗脱 ，所得馏分进 一步使用
硅胶柱层析 ，ODS，凝胶 ，制备型高效液相等多种方
法分离纯化 ，得到化合物鸦胆子 苦醇 32．0 mg。准
确称 取 一 定 量鸦 胆 子 苦 醇 溶 于 DMSO 配 成 5O
mmol·L。的贮备液，分装，一20℃避光储存备用。
实验前用 DMEM 培养基稀 释成 不同浓度 ，DMSO
终浓度小于 0．1 。
1．4鸦胆子苦醇对不同肿瘤细胞株增殖的抑制作用
取生长对数期的前列腺癌细胞(DUI45、PC3)、
人肝癌细胞 (HepG2)、人 乳腺癌细胞 (MCF一7)、人
结肠癌细胞(HT一29)、人肺癌细胞 (A549)用质量体
积 比 O．25 的胰蛋 白溶 液消化 ，并 接种 于 96孔板
上。接种 24 h后 ，加入不 同浓度的待测样品 ，并 以
相同体积比DMSO作为对照，培养 48 h后，每孑L加
入 50 L MTT溶液(5 mg·mL )，4 h后离心弃上
清液 ，加入 DMSO(100 L·孑L。)，振荡 5 rain左
右，置酶标仪中测定 OD值，波长为 570 nm，实验重
复 3次 ，并计 算 细胞抑制 率 ，同时作 图并用 SPSS
18．0软件求得半数抑制浓度(IC 。)。
1．5鸦胆子苦醇对前列腺癌 DU145细胞增殖的抑制
作 用
取单层培养的 DUI45细胞 (DMEM，含 10 胎
牛血清)，用质量体积比 0．25 9／6的胰蛋白溶液消化，
接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液 100 L，细
胞数为3 000个)。接种 24 h后，加入不同浓度待测
样品，共 设 6个 药物 浓度 ，药物 最 终浓 度 分别 为
3．125×10～、6．25× 10～、12．5× 10 、25× 10一、50×
10 和 1O0×10 mol·L ，以相 同体积 比 DMSO作
为对照 ，在培养 48 h后 ，每孔加入 50／,LMTT溶液
(5 mg·mL。)，4 h后离 心弃上清液 ，加入 DMSo
(100／,L·孔。)，振荡 5 min左右，置酶标仪中测定
OD值，波长为 570 nm，实验重复 3次，并计算细胞
抑制率，同时作图并用 SPSS 18．0软件求得半数抑
制浓度 (IC 。)。
1．6鸦胆子苦醇处理后的细胞形态学观察
采用 Hoechst 33258荧光染色法 ，取对数 生长
期细胞接种 于六孑L板 上，待细胞长 至 80 时 ，加入
终浓度为 0．25>mol·L 的鸦 胆子苦醇作用 24 h
后 ，吸尽培养液 ，加入 4％多聚 甲醛固定 20 rain。去
除固定液，用 PBS洗 2遍 ，每次 3 min，吸尽液体 ，加
入 0．5 mL Hoechst 33258染色液 ，染色 5 min，荧光
显微镜下观察 。
1．7 PI单染流式细胞术检测细胞周期
取对数期生长的 DU145细胞接种于 6孔板 ，待
细胞长至 80 时，加入终浓度 为 0．25／~mol·L 的
鸦胆子苦醇，分别作用 6、12、24 h后，用胰酶消化收
集细胞 ，PBS洗涤后加入 7O 乙醇 ，4℃固定过夜 。
检测前离心去掉乙醇并用 PBS洗涤 2次，加入含
RNaseA的碘化丙啶(PI)染色液 500／xL，室温避光
染色 30 rain，流式细胞仪(型号 Beckman Galios)检
测 ，Wincycle32软件分析亚二倍体峰 。
1．8 Annexin—V—FITC双染法流式细胞术流式细胞仪
检测细胞凋亡
取对数期生长的 DU145细胞接种于 6孔板 ，待
细胞长至 80 左右 ，分别加入终浓度 0．25／~mol·
L。的鸦胆子苦醇，作用 24 h后，胰酶消化收集细
胞。用 PBS洗 1次 ，1 000 r·min。离心 5 rain，加
200 L binding缓冲液重悬细胞 ，加 5 L Annexin
V—FITC，室温避光孵育 10 rain，1 000 r·min 离心
5 rain弃上清，加 200／,L binding缓冲液重悬细胞 ，
加入 5 L PI，上机检测 。
1．9蛋 白免疫印迹 实验(Western blot)
DU145细胞经终浓度 0．25／~mol·L。的鸦胆子
苦醇分别处理 0、0．75、1．5、3、6、12、24 h后 ，用胰酶
消化收集细胞 ，PBS洗涤 2次，加入细胞裂解液 ，冰
上裂解细胞 30 min。BCA法测定蛋 白质浓度。用
12 SDS—PAGE凝胶 电泳分离蛋 白质。电泳后将
蛋白转印纸硝酸纤维素膜上，封闭后一抗 4℃孵育
过夜 ，二抗室温孵育 1 h后 ECL显色。
2 结果与分析
2．1鸦胆子苦醇对不 同肿瘤细胞株增殖的抑制作用
经检测 得 DU145细胞 、PC3细胞 、HepG2细
胞 、MCF一7细胞 、HT一29细胞 、A549细胞的半数抑
制浓 度分 别 为 (0．27±0．03) mol·L 、(0．55±
0．06)／~mol·L 、(3．21± 0．22)f,mol·L一、(0．90±
0．09)tmol·L一、(0．96± 0．儿 )／,mol·L 、(0．70±
O．06) tool·I ，结果如图 1所示 ，其中鸦胆子苦醇
对前列 腺癌 DU145、PC3细胞 的抑 制作用最 为 显
434 广 西 植 物 35卷
著 ，并且 DU145细胞对鸦胆子苦醇更为敏感 。
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1
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DU1 45 PC3 Hepg2 MCF— 7 HI— 29 A549
肿瘤细胞株 Tumor ceI I I iDes
图 1 鸦胆子苦醇对不同肿瘤细胞株的半数抑制浓度
Fig．1 Half inhibitory concentration of brusatol
inhibiting different tumor cell lines
2．2不同浓度鸦胆子苦醇对 DU145细胞增殖的抑制
作用
图 2显示 ，3．125×10 、6．25×10～、12．5×10 、
25×l0～、5O×10 和 100×10 mol·L 鸦 胆子苦
醇对 DU145细胞具有不同程度的抑制作用 ，呈时间
和剂量依赖性地抑制 DU145细胞的生长，其半数有
效抑制浓度 IC 。为(0．274-O．04)／~mol·L ；经观察，
我们选择 0．25／~mol·L。的鸦胆子苦醇浓度作为后
续实验的药物剂量 。
g案
0O
80
60
20
O
培养时间 CuIture t ime(h)
图 2 不同浓度鸦胆子苦醇抑制 DU145
细胞的时效和量效关系
Fig．2 Inhibiting effects of brusatol on the proliferation of
DU145 cels in dose~and—time dependant manner
2．3 Hoechst 33258荧 光 染 色检 测 鸦 胆 子 苦醇 对
DU145细胞形态的影响
经 Hoechst 33258染色发现，正常细胞呈均匀
弥散荧光 ，而经 0．25／~mol·L 鸦胆子苦醇处理 24
h后，可以观察到细胞核呈碎片状 ，呈现致密浓染的
颗粒状荧光 ，此为典型的细胞凋亡特征 (图 3)。
2．4鸦胆子苦醇对 DU145细胞周期的影响
我们进一步考察 了鸦胆子苦醇对 DU145细胞
周期的影响 ，如图 4所示，0．25／,mol·L。鸦胆子苦
醇分别处理 6、12、24 h后 ，通过 亚二倍体峰检测其
凋亡率分 别为 (0．16 4-0．04) 、(1．46 4-0．11) 、
(8．584-0．32) 、(14．46 4-1．20) ，即随着作用时间
的增加，亚二倍体峰明显增加，即在鸦胆子苦醇作用
24 h后凋亡最 明显 。
2．5鸦胆子苦醇对 DU145细胞凋亡的影响
为进一步 确认 凋亡 的发生 ，采用 Annexin V
FITC双染法检测鸦胆子苦醇对 DU145细胞 凋亡
的影响，如图 5所示 ，0．25 ptmol·L。鸦胆子苦醇作
用 24 h后 ，与对照组相 比凋亡 明显，对照组 凋亡率
为 1．7 ，加药组凋亡率为 10．6 、这也 印证了鸦胆
子苦醇可 以诱导 DU145细胞发生凋亡．
2．6鸦胆子苦醇诱导 DU145细胞凋亡可能的作用机制
通过 Western blot检 测鸦 胆 子 苦 醇 对 p38、
ERK及 JNK及其磷酸化 活性形式表达 的影 响，结
果如图 6。以终浓度为 0．25／~mol·L。的鸦胆子苦
醇分别处理 0、0．75、1．5、3、6、12、24 h后检测得 ，P—
p38、P—JNK的表达呈明显 的递增趋势 ，表明两者均
被激活 。P—ERK在 12 h后呈 明显的减弱趋势 ，表
明活性被抑制 ，由此可知 ，P—p38、P—ERK及 P—JNK
均参与了鸦胆子苦醇诱导细胞凋亡的过程 。
3 讨论
目前发现天然产物可以通过多种方式发挥抗肿
瘤 的作用 ，如抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化 ，诱导细
胞凋亡，抗肿瘤细胞粘附与浸润转移等。本研究 发
现鸦胆子苦醇可以抑制 DU145细胞 的生长 ，并且具
有时间和剂量依赖性。经 0．25／~mol·L。的鸦胆 子
苦醇处理 DU145细胞 24 h后 ，Hoechst 33258荧光
染色研究发现 ，鸦胆子苦醇可以诱导 DU145细胞发
生典型的核破碎 ，呈现致 密浓染 的颗粒状荧光 。流
式细胞术检测发现 ，随着时间的增长，凋亡峰 比例在
逐渐增加 ，以上均说明鸦胆子苦醇可 以诱导 DU145
细胞凋亡的发生。前列腺癌的发生 、发展是个复杂
的过 程，多 种 信 号 转 导 通 路 可 能 参 与 其 中
(Karhadkar et＆Z．，2004)。丝 裂原 活化 蛋 白激 酶
(mitogen—activated protein kinases，MAPKs)信 号
途径存在于生物体的大多数细胞 内，是真核生物细
3 2 1 O