全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｍａｒ. ２０１６ꎬ ３６(３):３５５－３６０
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４０４０２９
刘红全ꎬ林小园ꎬ潘艺华. 小球藻的甲基磺酸乙酯诱变及产 ＥＰＡ的条件研究 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(３):３５５－３６０
ＬＩＵ ＨＱꎬＬＩＮ ＸＹꎬＰＡＮ ＹＨ. ＥＭＳ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥＰＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(３):３５５－３６０
小球藻的甲基磺酸乙酯诱变及产 ＥＰＡ的条件研究
刘红全∗ꎬ 林小园ꎬ 潘艺华
( 广西民族大学 海洋与生物技术学院ꎬ 微生物与植物资源利用广西高校重点实验室ꎬ 南宁 ５３０００６ )
摘　 要: 小球藻是海水养殖系统中常用的单细胞微藻ꎬ繁殖能力强ꎬ易于规模化培养ꎬ且可合成不饱和脂肪酸
ＥＰＡ、ＤＨＡ等多种活性物质ꎬ在医疗和保健品开发中具有很高的应用价值ꎮ 目前商业化培养的藻种多从自然
界中直接获得ꎬ活性物质的产量较低且藻种易退化ꎮ 为了获得 ＥＰＡ 产量更高的藻种ꎬ该研究利用 ０.６％ ＥＭＳ
对小球藻进行诱变ꎬ利用尼罗红染色法进行初筛并通过单细胞分离技术得到 １ 株突变株 ＥＣ１ꎬ通过气象色谱
测定其 ＥＰＡ产量ꎮ 结果表明:与出发藻株相比ꎬ突变株 ＥＰＡ(二十碳五烯酸)产量提高了 ８.９７％ꎮ 根据单因素
试验确定突变株生长及产 ＥＰＡ 的合适培养条件ꎬ再通过正交试验筛选出培养条件的优化组合ꎬ表明突变藻
ＥＣ１株产 ＥＰＡ的较适条件为 ＮａＮＯ３７５ ｍｇ􀅰Ｌ
￣１ꎬｐＨ７.５ꎬ昼夜温度 １７~１５ ℃ꎬ接种量为 １２％ꎬ在此条件下培养 ７
ｄ其 ＥＰＡ的产量可达 ２５.３８ ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎬ传代实验表明突变藻株具有较好的遗传稳定性ꎮ 该研究结果为进一步利
用小球藻规模化生产 ＥＰＡ奠定了基础ꎮ
关键词: 小球藻ꎬ ＥＭＳ诱变ꎬ ＥＰＡ
中图分类号: Ｑ９４９.２　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０３￣０３５５￣０６
ＥＭＳ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ａｎｄ ｔｈｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥＰＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ＬＩＵ Ｈｏｎｇ￣Ｑｕａｎ∗ꎬ ＬＩＮ Ｘｉａｏ￣Ｙｕａｎꎬ ＰＡＮ Ｙｉ￣Ｈｕａ
( Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓꎬ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ａｎｄ Ｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｏｌｌｅｇｅｓ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００７ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ａｎｄ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ｂｅｃａｕｓｅ ｉｔ ｉｓ ｅａｓｙ ｆｏｒ
ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＵＦＡｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＥＰＡ ａｎｄ ＤＨＡꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｏｓｓｅｓｓ ｈｉｇｈ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ
ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ. Ｂｕｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅꎬ ｗｈｏｓｅ ａｃｔｉｖｅ
ｍａｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｌｏｗ ａｎｄ ｅａｓｙ ｔｏ ｄｅｇｒａｄａｔｅ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｌｇａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬ Ｃ. ｖｕｌｇａｒｉｓ
ｗａｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｂｙ ０.６％ ＥＭＳ. Ｕｓｉｎｇ Ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ｍｅｔｈ￣
ｏｄꎬ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＥＣ１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ２００ ｍｕｔａｎｔ ｃｌｏｎｅｓ. Ｔｈｅ ＥＰＡ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＥＣ１ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇ￣
ｒａｐｈｙ. Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ８.９７％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ. Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ. Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｗａｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ. Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＣ１ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ＮａＮＯ３ ７５ ｍｇ􀅰
Ｌ￣１ꎬ ｐＨ７.５ꎬ ｄａｙ￣ｎｉｇｈｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ １７－１５ ℃ꎬ １２％ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ７ ｄ. Ｔｈｅ ＥＰＡ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＥＣ１
收稿日期: ２０１４￣１２￣１６　 　 修回日期: ２０１５￣０４￣２６
基金项目: 国家自然科学基金(３０９６０２１５)ꎻ 广西自然科学基金(桂科青 ０７２８０１９)ꎻ 广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ(３０９６０２１５)ꎻ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ(０７２８０１９)ꎻ Ｘｉａｎｇｓｉｈｕ Ｙｏｕｎｇ Ｓｃｈｏｌａｒｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅａｍ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ(２０１４)]ꎮ
作者简介: 刘红全(１９７５￣)ꎬ男ꎬ黑龙江肇东人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ从事生物化学及遗传学的教学和科研工作ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｈｏｎｇｑｕａｎ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者
ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ２５.３８ ｍｇ􀅰ｇ￣１ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｇｏｏｄ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ. Ｔｈｅ ＥＰＡ ｙｉｅｌｄ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ
ｓｉｘｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗｏｕｌｄ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ. ｖｕｌｇａｒｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓꎬ ＥＭＳ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓꎬ ＥＰＡ
　 　 小球藻是海水养殖系统中最常用的单细胞微
藻ꎬ不仅营养价值含量高、富含不饱和脂肪酸ꎬ且繁
殖能力强ꎬ易于室内或户外规模化培养( Ｐｅｒｎｅｔ ｅｔ
ａｌꎬ２００３ꎻＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌꎬ２００６)ꎮ 随着研究的深入ꎬ微藻
的商业化价值迅速提高ꎬ如用作食品添加剂ꎬ药效成
分ꎬ不饱和脂肪酸ꎬ染料ꎬ污水处理及绿色能源
(Ｐｅｒｅｚ￣Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎮ 目前ꎬ大多数生产厂采
用的藻种多为从自然界直接分离获得ꎬ性状单一、稳
定ꎬ藻种易退化等问题ꎬ使得微藻的产量及生物活性
物质含量无法满足人们日益增长的需求(扬世杰
等ꎬ１９８８)ꎮ 因此有必要改进海洋微藻的育种技术ꎬ
从而对微藻的种质进行改良以培养出生长速度快ꎬ
不饱和脂肪酸产量高的新品种ꎮ
海洋微藻的诱变育种方法一般采用紫外线ꎬγ￣
射线ꎬ ＥＭＳ(甲基磺酸乙酯)ꎬ细胞融合及转基因等ꎬ
引起细胞核染色体断裂ꎬ碱基缺失、置换、重组等生
物学效应ꎬ使后代性状发生变异ꎬ获得可应用于微藻
养殖和加工的新品系(王妮等ꎬ２００９)ꎮ 其中 ＥＭＳ
(甲基磺酸乙酯)化学诱变技术在国内外已公认为
一种有效、成熟的技术ꎬ价格便宜ꎬ操作简单ꎬ引起突
变的范围广ꎬ在作物育种中得到广泛应用(降云峰
等ꎬ２０１２)ꎮ 本研究通过 ＥＭＳ 诱变以期筛选出生长
速度快、油脂含量高、可供开发利用的小球藻新
株系ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 藻种
所用藻种购买于武汉中科院水生生物研究所ꎬ
绿藻门的小球藻(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ)ꎮ
１.２ 培养条件
在 ２５０ ｍＬ 三角瓶内装 １００ ｍＬ 的培养液ꎬ１２１
℃高压下灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 培养温度(２４±１)℃ꎬ光照强
度(４ × ４０ Ｗ 日光灯照射)ꎬ 光暗周期为 １２ｈ / １２ｈꎮ
培养液采用 Ｆ / ２配方配制ꎬ人工海水的配方参考陈
百灵(２０１１)的稍作改进ꎮ 每天振摇 ２~３ 次ꎬ藻悬液
长到指数生长后期时ꎬ用于试验ꎮ
１.３ 甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)的诱变
１.３.１ ＥＭＳ诱变的预实验　 取处于对数生长期的藻
液 １０ ｍＬꎬ 离心收集藻细胞ꎮ 所得藻细胞分别放入
浓度为 ０.２％、０.４％、０.６％、０.８％、１.０％的 ＥＭＳ 溶液
(用 ０.０６ ｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ꎬｐＨ ＝ ７ 的磷酸缓冲液配制)中悬
浮至 １０ ｍＬꎬ处理 ３０ ｍｉｎꎮ 加入 １ ｍＬ 硫代硫酸钠
(５％)终止诱变反应ꎮ 离心去除诱变液ꎬｄｄＨ２Ｏ 冲
洗 １次ꎬ新鲜营养液洗涤 ２ 次ꎬ避光 １２ ｈꎮ 培养 １ ｄ
后测定细胞的致死率同时将藻液进行扩大培养ꎬ测
定比生长速率ꎮ 根据致死率和比生长速率确定合适
的诱变剂浓度ꎮ
１.３.２ ＥＭＳ诱变及突变株的筛选　 以预试验中确定
的诱变剂量对出发株诱变ꎮ 诱变后将全部藻液转移
到 ５０ ｍＬ三角瓶中ꎬ遮光 １２ ｈꎬ３ ｄ 后将藻液涂布在
固体培养基上ꎬ１２ ｄ 后分别挑取体积较大、浓绿色
的藻落 ２００株于 ５０ ｍＬ的培养液中ꎮ
利用尼罗红染色法进行初筛ꎮ 尼罗红是一种脂
溶性荧光染色剂ꎬ通过染色选择合适的激发波长和
自发波长可测定细胞内的油脂含量ꎬ细胞经染色后
的荧光强度与细胞内油脂含量显著相关(Ｅｌｓｅｙ ｅｔ
ａｌꎬ２００１ꎻＶａｎ ｅｔ ａｌꎬ ２００５)ꎮ 取 １ ｍＬ细胞密度为 １０６
的藻液ꎬ加入尼罗红染料(０.５ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１) ２０ μＬ 于
４０ ℃孵育 １０ ｍｉｎꎬ将染色好的藻细胞滴入载玻片
中ꎬ于荧光显微镜下观察细胞中脂滴的大小和数量
(Ｃｂｅｎ ｅｔ ａｌꎬ２００９ꎻＮａｓｒｉｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎮ
筛选出的藻株接种到 １５０ ｍＬ培养液中培养ꎬ每
隔 １ ｄ 计算细胞密度ꎬ１０ ｄ 后离心ꎬ烘干ꎬ测定脂肪
酸含量ꎮ 根据终细胞密度及脂肪酸含量筛选出一株
优良藻株ꎬ进行后续工作ꎮ
１.４ 突变藻株产 ＥＰＡ条件的优化
１.４.１ ＮａＮＯ３浓度对诱变株生长及产 ＥＰＡ 的影响　
ＮａＮＯ３浓度设置 ５ 个梯度:０、３７.５、７５、１０２.５ 和 １５０
ｍｇ􀅰Ｌ￣１ꎬ其余培养条件不变ꎮ 隔天测细胞密度ꎬ待
藻细胞长到稳定期后ꎬ提取 ＥＰＡꎮ
１.４.２ ｐＨ对诱变藻株生长及产 ＥＰＡ的影响　 ｐＨ设
置 ５个梯度:６.５、７.０、７.５、８.０、８.５ꎬ其余培养条件不
变ꎮ 隔天测细胞密度ꎬ待藻细胞长到稳定期后ꎬ提
取 ＥＰＡꎮ
１.４.３ 温度对诱变藻株生长及产 ＥＰＡ的影响　 温度
设置 ５个梯度:１７、２０、２３、２５、２７和 ３０ ℃ꎬｐＨ为７.５ꎬ
６５３ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
其余培养条件不变ꎮ 隔天测细胞密度ꎬ待藻细胞长
到稳定期后ꎬ提取 ＥＰＡꎮ
１.４.４ 接种量、培养天数及昼夜温差对诱变藻株产
ＥＰＡ的交互影响　 根据单因素实验中微藻生长及
产 ＥＰＡ的条件差异ꎬ选择合适的培养条件ꎬ通过正
交试验筛选出培养条件的优化组合(表 １)ꎮ
表 １　 试验因子及其水平
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｌｅｖｅｌｓ
因子
Ｆａｃｔｏｒ
水平 １
Ｌｅｖｅｌ Ｉ
水平 ２
Ｌｅｖｅｌ ＩＩ
水平 ３
Ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ
昼夜温度 (℃)
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｄａｙ￣ｎｉｇｈｔ
１７~１５ ２０~１８ ２３~２１
接种量 (％)
Ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｄｏｓｅ
８ １０ １２
培养天数 (ｄ)
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄａｙｓ
７ １０ １３
　 　 ｐＨ为 ７.５ꎬ其余培养条件不变ꎮ 每个试验重复
３次 ꎬ隔天测细胞密度ꎬ求平均值ꎮ
１.５ 遗传稳定性分析
将筛选得到的诱变株连续转接 ６ 代ꎬ测定第一
代和第六代的 ＥＰＡ含量ꎬ看是否能稳定遗传ꎮ
１.６ 不饱和脂肪酸的提取及气象色谱测定
１.６.１ 采用甲醇－氯仿提取法　 参考陈炜等(２０１０)采
用氯仿－甲醇混溶液(２ ∶ １ꎬｖ / ｖ)超声提取粗脂肪酸ꎬ
将粗提液加入等体积的 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ￣１的 ＫＯＨ￣ＣＨ３ＯＨ混
溶液于 ７５ ℃水浴中皂化ꎬ用正己烷萃取后用气相色
谱测定ꎬ在整个操作过程中需充 Ｎ２保护不饱和脂肪
酸不被氧化ꎮ
１.６.２ 脂肪酸的色谱测定　 用日本岛津的气相色谱
仪ꎬ６０ ｍ × ０.３２ ｍｍ × ０.２５ μｍ石英毛细管柱ꎬ汽化
室和检测器的温度均为 ２５０ ℃ꎬ色谱柱的升温程序
为初始 ７０ ℃ꎬ以 ３０ ℃􀅰ｍｉｎ￣１的速率升至 １５０ ℃ꎬ然
后以 ５ ℃􀅰ｍｉｎ￣１升到 ２５０ ℃ꎬ保持到所测样品的峰
值都出现ꎮ 载气为高纯 Ｎ２ꎬ流速 ３０ ｍＬ􀅰ｍｉｎ￣１ꎬＨ２
流速为 ４０ ｍＬ􀅰ｍｉｎ￣１ꎬ空气流速为 ４５０ ｍＬ􀅰ｍｉｎ￣１ꎬ
分流比为 １ ∶ ６０ꎬ进样量 １ μＬꎮ 通过与标准脂肪酸
保留时间的对比鉴别各脂肪酸组分ꎬ面积归一化法
计算出所需脂肪酸的相对含量ꎮ
２　 结果与分析
２.１ ＥＭＳ的诱变结果
在 ＥＭＳ诱变处理中ꎬ随着浓度的增加微藻的颜
色逐渐变浅ꎬ当浓度达到 １.０％ 时藻液出现大量浅
白色的糝状固体ꎮ 待细胞死亡稳定后测定致死率结
果如图 １ꎮ
图 １　 ＥＭＳ诱变处理后小球藻的致死率
Ｆｉｇ. １　 Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｒａｔｅ ｏｆ ＥＭＳ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ Ｖｕｌｇａｒｉｓ
　 　 从图 １看出ꎬ随诱变剂浓度的增大ꎬ小球藻的存
活率急剧下降ꎬ通过方差分析诱变剂浓度对微藻的
致死效应呈显著性差异(Ｐ ＝ ０.０００ ７)ꎮ 当浓度处于
０.４％~０.８％之间时ꎬ致死率倍增ꎬ说明此时的诱变
剂浓度是处于多数细胞的敏感区域与耐受极限ꎮ 经
过 ＥＭＳ处理后ꎬ小球藻的生长受到不同程度的抑
制ꎮ 在低于 ０.８％的 ＥＭＳ 处理下ꎬ小球藻一周即可
恢复生长ꎬ而当浓度为 １％时需要 ２０ ｄ 才能恢复正
常生长ꎮ 因此综合考虑小球藻恢复生长的时间及比
生长速率和 ＥＰＡ 含量变化ꎬ得到最佳诱变剂 ＥＭＳ
的浓度为 ０.８％ꎮ
２.２ 诱变后优良藻株的选育
２.２.１ 尼罗红染色进行初筛　 尼罗红是一种亲脂性
的恶嗪类荧光染料ꎬ能与脂类物质结合ꎬ在一定的激
发波长下发射出脂特异性荧光ꎬ通过检测脂荧光强
度即可测定细胞中的油脂含量ꎮ 荧光显微镜观察比
较细胞内油珠的大小、数量ꎬ荧光强度判断微藻油脂
含量高低ꎬ作为富油微藻初筛的指标ꎬ简便快速ꎮ 对
分离得到的微藻进行尼罗红染色ꎬ观察荧光强度ꎮ
从图 ２看出ꎬ筛选得到的诱变藻株ꎬ其细胞明显
大于对照组的微藻ꎬ脂肪粒大小和数量也比对照组
提高ꎬ这与气象色谱测定的脂肪酸含量提高相一致ꎮ
２.２.２ 通过比生长速率及 ＥＰＡ含量进行筛选　 经过
预实验的最佳诱变剂量诱变后ꎬ利用单细胞分离技
术ꎬ初筛、复筛得到 １ 株生长较快、脂肪酸含量较高
的藻株ꎬ以诱变剂名称及微藻名称的首字母命名为
ＥＣ１ꎮ 其 ＥＰＡ含量及比生长速率如图 ３、图 ４ꎮ
通过挑取 ２００个藻落ꎬ根据生长情况及含脂量ꎬ
筛选得到一株突变藻ꎮ 从图 ３看出ꎬ 选育出的藻株
７５３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘红全等: 小球藻的甲基磺酸乙酯诱变及产 ＥＰＡ的条件研究
图 ２　 诱变藻株油脂的荧光定性分析(１０×２０)
Ｆｉｇ. ２　 Ｏｉｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｌｇａｅ ｓｔｒａｉｎｓ
图 ３　 诱变后选育藻株的 ＥＰＡ含量　
Ｆｉｇ. ３　 ＥＰＡ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＥＣ１
图 ４　 诱变后选育藻株的比生长速率
Ｆｉｇ. ４　 Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ＥＣ１
ＥＰＡ 含量较高ꎬ为 ２２. ９５ ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎬ比对照组提高
８.９７％ꎮ 从图 ４看出ꎬ诱变后的微藻恢复生长后ꎬ比
生长速率与对照组相似ꎬ说明诱变剂的后效作用不
是很明显ꎮ
２.３ 对选育出的藻株进行培养条件的优化
２.３.１ 氮源对诱变藻株产 ＥＰＡ的影响　 小球藻的生
长主要受氮和磷的影响ꎬ氮源不仅影响细胞的生长
速度ꎬ而且还严重影响细胞内活性物质的合成积累ꎮ
本研究考察了氮源浓度对诱变藻株产 ＥＰＡ 的影响
(图 ５)ꎮ
图 ５　 ＮａＮＯ３对小球藻诱变株产 ＥＰＡ的影响
Ｆｉｇ. ５　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＮａＮＯ３ ｏｎ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＣ１
从图 ５可以看出ꎬ在一定浓度范围内ꎬ随氮源浓
度的增加脂肪酸积累量增大ꎬ在 ＮａＮＯ３浓度为 ７５
ｍｇ􀅰Ｌ￣１时ꎬＥＰＡ的积累量达到最大ꎬ此后随 ＮａＮＯ３
浓度增加ꎬＥＰＡ含量降低ꎮ 通过方差分析得到 Ｐ 值
为０.０６４ꎬ说明氮源对 ＥＣ１的影响不显著ꎮ
２.３.２ ｐＨ值对诱变藻株产 ＥＰＡ 的影响　 ｐＨ 值对小
球藻的生长及生化组分有着重要的影响作用ꎮ 一般
认为海洋微藻生长的最适 ｐＨ与海水的 ｐＨ相同ꎬ在
８５３ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
６.５~８.５之间(图 ６)ꎮ
图 ６　 ｐＨ值对小球藻诱变株产 ＥＰＡ的影响
Ｆｉｇ. ６　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＣ１
从图 ６ 看出ꎬ诱变株产 ＥＰＡ 的较适 ｐＨ 值为
７.５ꎮ 在较适 ｐＨ 条件下 ＥＣ１ 的 ＥＰＡ 含量为 ２４.９８
ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎬ通过方差分析得到 ｐＨ对诱变株 ＥＰＡ 的产
量影响呈显著性差异(Ｐ<０.０５)ꎮ
２.３.３ 温度对诱变藻株产 ＥＰＡ的影响　 海洋微藻的
较适生长温度一般为 ２０~３０ ℃ꎬ但产 ＰＵＦＡｓ的较适
温度因藻种而异ꎬ一般情况随温度的降低脂肪酸不
饱和度增加ꎬ因为在低温条件下ꎬ藻类需通过生产更
多的 ＰＵＦＡｓ 来维持细胞膜的流动性(杨官品等ꎬ
２００５)ꎮ 通过实验发现小球藻的耐受温度较高ꎬ在
３０ ℃条件下也能正常生长(图 ７)ꎮ
图 ７　 温度对小球藻诱变株产 ＥＰＡ的影响
Ｆｉｇ. ７　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＣ１
　 　 由图 ７可知ꎬ低温有利于 ＥＰＡ 的积累ꎬ筛选获
得的诱变藻株在 ２０ ℃条件下 ＥＰＡ 的含量最高ꎬ为
２２.６６ ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎮ 通过方差分析ꎬ发现温度对 ＥＰＡ 的
产量影响差异性不显著(Ｐ>０.０９)ꎮ
２.３.４ 环境条件的正交组合对诱变株产 ＥＰＡ 的影响
　 不同的培养条件对微藻中 ＥＰＡ 含量的影响见直
观分析见表 ２ꎮ 由表 ２ 可知ꎬ影响 ＥＣ１ 产 ＥＰＡ 的因
素主次顺序是培养天数>接种量>昼夜温度ꎬ根据 Ｋ
值得到产 ＥＰＡ 的最优组合为 １７ ~ １５ ℃、接种量
１２％ꎬ培养 ７ ｄꎮ
表 ２　 培养条件对 ＥＣ１产 ＥＰＡ的影响
正交试验结果及直观分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｏｎ ＥＣ１ ｐｒｏｄｕｃｅ ＥＰＡ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ
实验号
Ｃｏｄｅ
水平(Ｌｅｖｅｌ)
昼夜温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｆ ｄａｙ￣ｎｉｇｈｔ
(℃)
接种量
Ｉｎｏｃｕｌｕｍ
ｄｏｓｅ
(％)
培养天数
Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｄａｙｓ
(ｄ)
ＥＰＡ产量
ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
(ｍｇ􀅰ｇ￣１)
１ １７~１５ ８ ７ ２１.４３
２ １７~１５ １０ １０ １５.３３
３ １７~１５ １２ １３ ２４.６６
４ ２０~１８ ８ １０ １３.９０
５ ２０~１８ １０ １３ １３.４５
６ ２０~１８ １２ ７ ２４.９３
７ ２３~２１ ８ １３ １６.９４
８ ２３~２１ １０ ７ １５.９７
９ ２３~２１ １２ １０ １３.１４
Ｅ　 ｋ１ ２０.４７３ １７.４２３ ２０.７７７
Ｃ　 ｋ２ １７.４２７ １４.９１７ １４.１２３
１　 ｋ３ １５.３５０ ２０.９１０ １８.３５０
Ｒ ５.１２３ ５.９９３ ６.６５４
２.４ 遗传稳定性分析
鉴于诱变藻株的性状常常不稳定ꎬ尤其在连续继
代培养时ꎬ为了检测所得藻株的性状是否稳定ꎬ连续
转接 ６代ꎬ测定第一代和第六代的 ＥＰＡ含量(图 ８)ꎮ
由图 ８可知ꎬ这诱变株第一代和第 ６ 代的 ＥＰＡ
产量变化不显著(Ｐ＝ ０.１６)ꎬ说明选育的变异藻种具
有良好的遗传稳定性ꎮ
３　 讨论
小球藻是较早用于人工培养且培养方法比较成
熟的藻种ꎬ具有生长快、繁殖迅速、易培养、营养丰富
等特点ꎮ 其多不饱和脂肪酸含量较高ꎬ在一般的培
养条件下ꎬ ＥＰＡ 占总脂肪酸的 １４. ８％ (梁英等ꎬ
１９９９)ꎮ Ｔｒｉｐａｔｈｉ ｅｔ ａｌ(２００１)ꎬ使用 ＥＭＳ 浓度 ０.１２％~
０.４８％ꎬ处理雨生红球藻 １ ｈꎬ致死率为 ３４％ ~ ８０％ꎮ
本实验中使用 ０.２％ ~ １.０％的 ＥＭＳ 处理ꎬ处理时间
３０ ｍｉｎꎬ致死率在 ２０％ ~ ９０％ꎮ 由此可见ꎬ致死率结
果相差较大ꎮ 这可能与藻种自身有关:不同品系的
９５３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘红全等: 小球藻的甲基磺酸乙酯诱变及产 ＥＰＡ的条件研究
图 ８　 诱变藻株第 １代与第 ６代的 ＥＰＡ含量比较
Ｆｉｇ. ８　 ＥＰＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １ｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｈｅ ６ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｌｇａｅ ｓｔｒａｉｎｓ
绿藻ꎬ对 ＥＭＳ的耐受能力不同ꎻ即使是同一品系处
理时藻细胞的生长状态不同ꎬ或处理方法不同ꎬ得到
的致死率存在差异ꎮ 因此在 ＥＭＳ 诱变育种工作中ꎬ
首先要测定实验的藻种对 ＥＭＳ的耐受程度ꎬ根据实
验结果确定合适的诱变剂量和诱变时间后再进行诱
变筛选实验ꎮ 本研究对小球藻进行 ＥＭＳ 诱变ꎬ得到
的较适浓度为 ０.８％ꎬ致死率 ８２.４％ꎮ
将在最适条件下诱变得到的藻液进行划线分离
筛选ꎬ获得 １ 株油脂产量较高的藻株ꎬ命名为 ＥＣ１ꎬ
其 ＥＰＡ 产量为 ２２. ９５ ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎬ比对照组提高了
８.９７％ꎮ 本研究发现ꎬ较低的氮源浓度有利于脂肪
酸的积累ꎬ这与 Ｇｈｕｌａｍ ｅｔ ａｌ(２０１２)的研究相一致ꎮ
本研究发现ꎬ诱变株产 ＥＰＡ 的较适 ｐＨ 为 ７.５ꎬ这与
Ｐａｈｌ ｅｔ ａｌ(２０１０)认为海洋藻最适生长 ｐＨ 为 ７.２ ~
８.１的结果相似ꎮ 通过条件优化得到 ＥＣ１ 的最佳培
养条件为 ＮａＮＯ３７５ ｍｇ􀅰Ｌ￣１ꎬｐＨ７.５ꎬ昼夜温度为 １７~
１５ ℃、接种量 １２％、培养 ７ ｄꎮ 在此条件下培养ꎬ诱
变株 ＥＣ１ 的比生长速率为 ０. ２６０ ４ꎬＥＰＡ 产量为
２５.３８ ｍｇ􀅰ｇ￣１ꎮ
通过遗传稳定性试验分析可知这株诱变藻第一
代和第六代的 ＥＰＡ 产量变化不显著(Ｐ ＝ ０.１６)ꎬ这
说明选育的变异藻种具有良好的遗传稳定性ꎮ
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０６３ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷