全 文 ：62 • HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES
小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic
virus，ZYMV）最早是由Lisa等[1]在意大利和法国的小
西葫芦上发现的。随后，相继在地中海、东欧、南美
洲、澳洲以及亚洲的中部和南部均发现了ZYMV的存
在，目前该病毒已遍布全球50个左右的国家与地区。
ZYMV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒
属（Potyvirus），病毒粒子大小约750 nm×11 nm，无包
膜，由核苷酸（4.5%~7.0%）和蛋白质（93%~95.5%）
组成，基因组大小为9.6 kb，基因组只含有一个开放阅
读框（或开放读码框架，Open reading frame，ORF)，
编码10个功能蛋白。
ZYMV能够侵染葫芦科、苋科、藜科、豆科等11个
属的植物。在自然环境中，葫芦科植物感染该病毒后将
发生严重的系统性叶缘坏死、花叶、斑驳、褪绿黄化等
症状，果实出现不同程度的畸形，作物产量和商品价值
显著降低；尤其是苗期感染后果最为严重，产量损失达
95%~100%[2-3]。
ZYMV主要通过蚜虫以非持久性方式进行水平传
播，同时也可通过种子传毒（带毒率为0%~18.9%）进
行垂直传播[4]。随着种子贸易的全球化，加强对带毒种
子和带毒瓜果的监测是有效控制ZYMV传播的重要途径
收稿日期：2014-03-11
基金项目：湖南科技计划重点项目（2012FJ2009）
作者简介：陈远超（1988-），男，湖南浏阳市人，硕士研究生，主要从事微
生物与植物分子互作研究。
通讯作者：张德咏
湖南省葫芦科作物小西葫芦黄花叶病毒的检测
陈远超1,2，朱春晖2，孙书娥2，刘 勇2，张德咏1,2
（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省植物保护研究所，湖南 长沙 410125）
摘 要：根据已报道的小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）保守序列设计了一对特异性引物，在58℃下退火30 s，建
立了一种可靠、有效的ZYMV 普通RT-PCR检测方法。通过该方法成功克隆出一条长度为621 bp的HC-Pro基因片段，并与杭州分离物的ZYMV辅
助成分/蛋白酶（HC-Pro）基因核心区域（登录编号为AJ515911.1）的相似度达到99%。采用该方法对湖南省7个地区采集的疑似感病样品进行检
测，结果显示：ZYMV平均阳性检出率达54.0%，说明ZYMV是侵染湖南省葫芦科作物的主要病毒之一。
关键词：小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）；RT-PCR；检测；湖南省
中图分类号：S432.41 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）07-0062-04
Detection of Zucchini Yellow Mosaic Virus in Cucurbitaceous Crops in Hunan Province
CHEN Yuan-Chao1,2, ZHU Chun-Hui2, SUN Shu-e2, LIU Yong2, ZHANG De-Yong1,2
(1. College of Plant Protection, HNAU, Changsha 410128, PRC;
2. Hunan Institute of Plant Protection, Changsha 410125, PRC)
Abstract: According to the reported conserved sequence of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), a pair of specifi c primer was designed
and then annealed at 58℃ for 30 s, thereby successfully establishing an effective and reliable RT-PCR detection method for ZYMV.
Through the method, a 621 bp of HC-Pro gene segment was cloned successfully, and the similarity between it and the core gene region of
ZYMV HC-Pro isolated from Hangzhou samples (the login ID is AJ515911.1) reached 99%. Using the method to detect suspected infected
samples collected from seven areas of Hunan province, the results showed that the average positive detection rate of ZYMV was as high as
54.5%. Therefore, the ZYMV is one of the main viruses which infested in the cucurbitaceous crops in Hunan province.
Key words: zucchini yellow mosaic virus; RT-PCR; detection; Hunan province
之一。目前，ZYMV的检测方法主要有生物学检测、电
子显微检测、血清学检测和分子生物学检测4种方法。
分子生物学检测方法因其重复性好、检测时间短、灵
敏度和精确度高等特点被广泛应用于ZYMV的检测，
一般根据ZYMV相对保守的外壳蛋白（CP）序列设计
引物进行RT-PCR检测，随后又开发出了能够同时检测
多个病毒的多重RT-PCR[5]。此后，又根据ZYMV保守
基因序列的差异性相继开发出基因芯片技术[6]、分子杂
交技术[7]以及一维电泳肽指纹技术等[8]，大大提高了对
ZYMV种群内部的辨识度和灵敏度。
我国1991年由赵荣乐等[9]首次在新疆西瓜上发现
了ZYMV，此后相继在华北、华南、西南和华东地区
发现ZYMV疫情。湖南省是我国主要的葫芦科作物种
植区之一，葫芦科病毒病害发生较为严重，但此前尚
未见关于ZYMV在湖南发生的报道，因此试验拟建立
ZYMV普通RT-PCR检测方法并对来自湖南多个地区疑
似病样进行了检测，以期为湖南省ZYMV病情的预防和
控制提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试样品 根据湖南省地理条件、葫芦科作物种
植分布以及周边省份ZYMV病害发生等情况，先后从
长沙、娄底、张家界、衡阳、岳阳、常德、郴州7个地
区，采集了黄化花叶、褪绿斑驳等具有病毒病明显症
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DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2014.07.011
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状的瓜类叶片样品，于-80℃保存，样品种类及数量见
表1。
图1 不同退火温度下PCR产物的电泳图
Fig.1 The electrophoresis of PCR products at different annealing
temperatures
（CK1为清水对照，CK2为无模板对照，1~7退火温度分别为
60、59.5、58.7、57.4、55.8、54.6和53.7℃）
M CK1 CK2 1 2 3 4 5 6 7
750 bp→
1.2.3 序列测定与分析 使用PCR回收试剂盒对PCR
产物进行回收；将回收产物与T1载体进行连接；然后
转化至TRA NS5α感受态细胞中；将转化后的菌液平
均涂布在含氨苄霉素的LB固体培养基（抗生素浓度
0.1 mg/mL）平板上，37℃倒置培养过夜；挑取阳性克
隆转接到含氨苄霉素的LB液态培养基（抗生素浓度为
0.1 mg/mL）中，于200 rpm摇床上37℃培养过夜；将培
养好的菌液送至华大基因公司进行测序，测序结果用
DNAMAN等软件进行比对分析。
1.2.4 ZYMV生物学方法验证 选取RT-PCR检测为阳
性的叶片样品，采用石英砂法摩擦接种于西葫芦与苋色
藜的叶片上，于温室（28℃）下培养，并定时观察叶片
症状。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR反应条件的优化
由图1可知，引物ZYMV-F/R在60~53.7℃之间都能
扩增到目的条带，说明所设计的引物具有良好的温度
适用性。综合考虑之后，将退火温度定为58℃。优化
后PCR的反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性45
s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延
伸10 min。
表1 样品的种类及数量 （份）
Table 1 The types and quantities of sample
采样地点 南 瓜 丝 瓜 瓠 瓜 香 瓜 冬 瓜 西 瓜 苦 瓜 合 计
长 沙 37 22 3 0 10 0 0 72
娄 底 14 1 0 0 5 0 0 20
岳 阳 39 10 2 0 1 0 0 52
衡 阳 25 21 0 0 4 5 5 60
郴 州 28 11 0 0 0 10 5 54
常 德 15 25 1 10 0 5 10 66
张家界 24 0 0 0 0 0 0 24
合 计 182 90 6 10 20 20 20 348
1.1.2 主要试剂与引物 反转录试剂盒、TaqDNA聚
合酶、dNTPs、DNA Marker、TRANS5α感受态细胞、
pEASY-T1 载体和回收试剂盒（TransGen Biotech公
司）；琼脂糖凝胶（上海生工生物技术有限公司）；
Grinding Buffer、Washing Buffer、NLS和硅溶液（自
行配制）；其他化学试剂为国产分析纯。根据已报道
的ZYMV保守序列利用DNAMAN设计一对特异性引
物：ZYMV-F 5’-TGCTCAAGGCCGGAACTGT-3’，
ZYMV-R 5’-GCTTCAATCGCACGGTTACAC-3’（引物
浓度10 μmol/L，华大基因公司合成）。
1.1.3 主要仪器 台式离心机5 4 1 5 C（E p p e n d o r f
艾本德中国有限公司）；DYCP-38C卧式水平电泳
仪（北京六一仪器厂）；Alpha凝胶成像系统（美
国Alpha公司）；BioRad-s1000双槽PCR仪（美国
BioRad公司）等。
1.2 试验方法
1.2.1 植物叶片总RNA的提取 使用硅粒法提取样品植
物叶片的总RNA，其步骤参照Zhang等[10]的方法。
1.2.2 RT-PCR扩增 （1）cDNA合成。使用TransGen
Biotech公司反转录试剂盒一步法合成cDNA。RT反应
体系（20 μL）：2×TS mix 10 μL，Enzyme mix 1 μL，
Random primer 1 μL，样品总RNA 8 μL。充分混匀，使
用BioRad-s1000双槽PCR仪进行反转录，RT反应程序：
25℃ 10 min，42℃ 40 min，85℃ 10 min。（2）PCR扩
增。以cDNA为模板进行扩增反应，PCR反应体系（20
μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，上下游引物各
1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 13.2 μL。
PCR反应程序优化：在53.7~60℃之间设计7个退火温
度进行梯度PCR反应，整个反应程序为：94℃预变性
3 min；94℃变性45 s，53.7~60℃退火30 s，72℃延伸
1 min，35个循环；72℃延伸10 min。（3）扩增产物检
测。反应结束后将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中100V电
泳30 min，随后使用凝胶成像系统进行观察。
2.2 克隆序列分析
选取长沙地区南瓜样品的凝胶电泳进行测序，结
果显示：引物ZYMV-F/R扩增出的基因片段处在ZYMV
HC-Pro基因的核心区域，长度为621 bp，序列见图2。
NCBI比对结果显示，克隆得到的片段与杭州分离物的
ZYMV 辅助成分/蛋白酶（HC-Pro）基因核心区域（登
录编号为AJ515911.1）的相似度达到99%，证明长沙的
该样品中含有ZYMV病毒。同时，也说明试验建立的
ZYMV普通RT-PCR检测方法可用于ZYMV的检测。
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2.3 湖南省不同地区样品的ZYMV检出情况
从表2中看出，从湖南省7个不同地区采集的348份
疑似感病样品中，总共检测出ZYMV阳性样品185份，
平均检出率达到54.0%。从不同品种来看，以香瓜的检
出率最低，仅10%，瓠瓜的检出率最高，达83.3%；除
香瓜、冬瓜和苦瓜以外，其他葫芦科作物的检出率都
达到了50%及以上。从地区来看，除娄底市和常德市以
外，其他地区的检出率均超过了51.0%，其中张家界市
的阳性样品检出率达到了70.8%。
RT-PCR技术因其简便快速、灵敏度高、特异性强
的特点，已广泛应用于植物病毒的检测。前人的研
究结果表明，使用PCR技术检测ZYMV是切实可行
的[11-12]。通常利用ZYMV相对保守的CP基因序列设计
特异性引物进行PCR反应，该试验利用DNAMAN软件
对多条ZYMV全序列进行比对分析，发现ZYMV的HC-
Pro基因中的核心区域相对保守，这与前人的研究结果
相似[13]，故以此为基础设计了一对特异性的引物。凝胶
电泳结果显示所设计的引物有良好的温度适应范围和
良好的特异性，成功克隆出一条长度为621 bp的HC-Pro
基因片段，并与杭州分离物的ZYMV 辅助成分/蛋白酶
（HC-Pro）基因核心区域（登录编号为AJ515911.1）
的相似度达到99%。随后利用所建立的ZYMV普通RT-
PCR检测技术对来自湖南省不同地区的疑似寄主植物
进行了ZYMV检测，结果表明：除香瓜、冬瓜和苦瓜
以外，其他葫芦科作物的检出率都达到了50%及以上；
除娄底市和常德市以外，其他地区的检出率均超过了
51.0%。从而证明所建立的ZYMV RT-PCR检测方法具
有良好的可靠性与适用性。不过该方法仍然存在一定的
不足，与廖富荣等[14]所建立的ZYMV RT-PCR检测方法
以及张永江[15]建立的一步法RT-PCR方法相比，存在检
测周期过长的缺点，有待进一步优化，缩短检测时间，
实现快速检测。
从田间检测结果来看，湖南省不同地区的葫芦科
作物上均检测出了ZYMV，田间样品的平均阳性检出率
达到54.0%。这说明ZYMV在湖南普遍发生，是侵染湖
南瓜类作物的主要病毒之一。不同的葫芦科作物检出率
差异较大，最低为10%，最高为83.3%，这有可能与不
同葫芦科作物抗病性不一致有关。试验中还发现ZYMV
与黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic
virus，CGMMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic
virus，CMV）存在复合侵染葫芦科作物的现象，其关
联性有待进一步研究。
不同地区的ZYMV分离物存在着较大差异，具有
丰富的血清学多样性及遗传多样性。探讨ZYMV的流行
进化规律、地理起源及流行病学规律，对抗病品种的选
育、抗病资源的改良以及ZYMV防治新策略的制定有重
要意义。湖南省 ZYMV 分离物的遗传多样性、进化规
律以及流行规律需要进一步深入研究。
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图2 长沙南瓜样品的测序结果
Fig.2 The sequencing results of pumpkin samples from Changsha city
表2 湖南各地区葫芦科样品中ZYMV的检出情况
Table 2 The detection case of ZYMV among cucurbitaceous samples
from Hunan Province
采样地点 南 瓜 丝 瓜 瓠 瓜 香 瓜 冬 瓜 西 瓜 苦 瓜 合 计 检出率（%）
长 沙 25 13 3 0 3 0 0 44 61.1
娄 底 6 1 0 0 1 0 0 8 40.0
岳 阳 26 0 1 0 0 0 0 27 51.9
衡 阳 15 12 0 0 2 4 0 33 55.0
郴 州 18 8 0 0 0 1 4 31 63.0
常 德 5 11 1 1 0 3 4 25 37.9
张家界 17 0 0 0 0 0 0 17 70.8
合 计 112 45 5 1 6 8 8 185 54.0
检出率（%） 61.5 50.0 83.3 10 30 55.0 40.0 54.0 -
2.4 生物学检测
分子生物学检测为阳性的样品摩擦接种于苋色藜
与西葫芦叶片后，均在10~12 d出现相应症状。在苋色
藜植株上，最先开始在摩擦部位出现单个的黄色斑点，
随着时间的推移斑点部位渐渐枯萎并出现红色晕圈，
10~12 d形成局部性侵染症状。而西葫芦植株上，接种
后6~7 d即出现明显的系统性侵染症状，最先开始表现
为子叶枯萎黄化，随后在新叶上出现褪绿黄化、蕨叶并
伴有严重的畸形，最终扩散至整个植株。
3 结论与讨论
ZYMV已成为危害我国葫芦科作物生产最主要的病
毒之一，而加强检测、快速及时地鉴定田间ZYMV发生
情况是防治该种病毒的首要任务。湖南省为我国主要的
葫芦科作物生产区，其病毒病危害较为严重，因此建立
快速高效的ZYMV鉴定方法，对明确湖南省葫芦科作物
病毒病的危害程度必不可少。
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（责任编辑：成 平）
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