全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：７６－８１　　　　　　　　　　 ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．０１４
潘家强，侯学文．ＯｓＲＵＳ２．１酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：７６－８１
Ｐａｎ　ＪＱ，Ｈｏｕ　ＸＷ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＯｓＲＵＳ２．１ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１３，
３３（１）：７６－８１
ＯｓＲＵＳ２．１酵母双杂交猎物载体的构建及其
细胞毒性和自激活作用检测
潘家强１，侯学文１，２＊
（１．华南农业大学 生命科学学院 分子植物生理研究室，广州５１０６４２；２．华南农业大学
生命科学学院 植物功能基因组与生物技术重点实验室，广州５１０６４２）
摘　要：采用ＰＣＲ技术扩增水稻根ＵＶ－Ｂ敏感基因２．１（ＲＯＯＴ　ＵＶ－Ｂ　ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ２．１，ＲＵＳ２．１）四个不同
片段［ＯｓＲＵＳ２．１（１－１３１７），ＯｓＲＵＳ２．１（１－１３８），ＯｓＲＵＳ２．１（１３９－８７９），ＯｓＲＵＳ２．１（８８０－１３１７）］，连接到Ｔ载体
ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓｉｍｐｌｅ上，测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体ｐＧＡＤＴ７上。结果表明：四个ＯｓＲＵＳ２．１基因
片段的表达载体构建成功，读码框正确；分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞Ｙ１８７中，用ＬａｃＺ、
ＭＥＬ１活性检测法和营养缺陷型培养基ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ培养法进行自激活检测和毒性检测，结果表明构建的四
个ＯｓＲＵＳ２．１不同片段的猎物表达载体对酵母菌株Ｙ１８７均没有转录激活活性和毒害作用，可用于后续研究。
关键词：水稻根对ＵＶＢ敏感基因２．１；猎物载体；酵母双杂交；自激活；毒性检测
中图分类号：Ｑ７８２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－００７６－０６
＊ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＯｓＲＵＳ２．１ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｅｙ
ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ
ａｎｄ　ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＰＡＮ　Ｊｉａ－Ｑｉａｎｇ１，ＨＯＵ　Ｘｕｅ－Ｗｅｎ１，２＊
（１．Ｌａｂ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｕｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）ＲＯＯＴ　ＵＶ－Ｂ　ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ２．１（ＯｓＲＵＳ２．１），ＯｓＲＵＳ２．１（１－１３１７），
ＯｓＲＵＳ２．１（１－１３８），ＯｓＲＵＳ２．１（１３９－８７９），ＯｓＲＵＳ２．１（８８０－１３１７），ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｃｌｏｎｅｄ　ＯｓＲＵＳ２．１
ｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｌｉｇａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＭＤ１８－Ｔ－ｓｉｍｐｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉ－
ｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｔｏ　ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＧＡＤＴ７．Ｔｈｅ　ｆｏｕｒ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐＧＡＤＴ７ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　４
ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｐＧＡＤＴ７ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　Ｙ１８７ｙｅａｓｔ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ
ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｔｏ　ｈｏｓｔ　ｙｅａｓｔ　Ｙ１８７ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＬａｃＺ　ａｎｄ　ＭＥＬ１ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　ｉｎ　ａｕｘｏｔｒｏｐｈ　ｍｅｄｉｕｍ
ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｅｌｆ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｎｏｔ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｏ
ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎ　Ｙ１８７，ａｎｄ　ｔｈｅｙ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
＊ 收稿日期：２０１２－０８－２３　　修回日期：２０１２－１０－３０
基金项目：国家自然科学基金（３０９７１７０９）
作者简介：潘家强（１９８５－），男，湖北十堰市人，硕士研究生，研究方向为植物功能基因组与分子生物学，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｐｊｑ１９８５１２０３＠１６３．ｃｏｍ。
＊通讯作者：侯学文，博士，研究员，研究方向为植物抗逆生理与分子生物学，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｈｘｗ１９６９＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｅ　ＲＯＯＴ　ＵＶ－Ｂ　ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ　２．１（ＯｓＲＵＳ２．１）；ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒ；ｙｅａｓｔ　ｔｗｏ　ｈｙｂｒｉｄ；ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－
ｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　　ＵＶ－Ｂ是太阳辐射的组成部分，它能够穿过大
气层到达地表，但到达地表的 ＵＶ－Ｂ辐照强度与季
节、云层厚度以及大气层臭氧含量有关。近几十年
来，随着大气中臭氧含量逐渐下降导致到达地表的
ＵＶ－Ｂ强度有增强的趋势（任健等，２００５）。ＵＶ－Ｂ
对植物的生理效应根据ＵＶ－Ｂ辐射强度的不同具有
明显的双重效应，即在强度较高时（＞１μｍｏｌ·ｍ－
２
·ｓ－１）就作为逆境因子对植物造成伤害；在较低强
度下（＜１μｍｏｌ·ｍ－
２·ｓ－１）却是一个信号调控因子
参与 植 物 的 多 种 光 形 态 建 成 （Ｆｒｏｈｎｍｅｙｅｒ　＆
Ｓｔａｉｇｅｒ，２００３）。Ｂｒｏｗｎ　＆Ｊｅｎｋｉｎｓ（２００８）的研究表
明，在拟南芥中存在ＵＶＲ８依赖和ＵＶＲ８非依赖的
ＵＶ－Ｂ信号传导途径，近年来对 ＵＶＲ８依赖的 ＵＶ－
Ｂ信号传导途径研究取得了很大进展，相继发现这
一途径中的几个成员（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００５；Ｇｒｕｂｅｒ
ｅｔ　ａｌ．，２０１０），特别是确认 ＵＶＲ８就是 ＵＶ－Ｂ受体
（Ｒｉｚｚｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）及其感受 ＵＶ－Ｂ的机理（Ｗｕ
ｅｔ　ａｌ．，２０１２）。ＵＶＲ８非依赖的 ＵＶ－Ｂ信号传导途
径的研究进展较慢，对于这一途径涉及哪些基因，目
前尚不清楚。
ＲＯＯＴ　ＵＶ－Ｂ　ＳＥＮＳＩＴＩＶＥｓ（ＲＵＳｓ）是近年来
在拟南芥中发现的与极低强度ＵＶ－Ｂ信号传导有关
的基因（Ｔｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２００８），但它与目前已知的
ＵＶ－Ｂ信号传导途径的关系目前在进一步研究中。
ＲＵＳ的共同特点是具有一个功能未知的结构域
ＤＵＦ６４７，采用酵母双杂交技术表明ＡｔＲＵＳ１与Ａｔ－
ＲＵＳ２能通过该结构域互作（Ｌｅａｓｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００９）。
在拟南芥研究的基础上，经生物信息学分析发现水
稻基因组中也具有６个ＯｓＲＵＳ 基因。我们已用
ＯｓＲＵＳ１构建了酵母双杂交诱饵载体（潘家强等，
２０１２），并从水稻ｃＤＮＡ文库中筛选到了一些互作
基因，研究结果在进一步分析中。ＯｓＲＵＳ２．１开放
阅读框（ＯＲＦ）全长１　３１７ｂｐ，结构域ＤＵＦ６４７位于
１３８～８７９ｂｐ，为研究ＯｓＲＵＳ２．１是否能与ＯｓＲＵＳ１
互作以及它们之间通过哪一个结构域互作，我们在
已构建好的四个ＯｓＲＵＳ１不同片段酵母双杂交诱
饵载体的基础上，本文根据 ＯｓＲＵＳ２．１结构域
ＤＵＦ６４７的分布情况，构建了四个ＯｓＲＵＳ２．１不同
片段酵母双杂交猎物载体，并进行毒性及自激活检
测，以便用于后续的酵母双杂交技术实验。
１　材料与方法
１．１实验材料
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｒｉｓｉａｅ）Ｙ１８７菌株，
ｐＧＡＤＴ７ 质 粒，阳 性 对 照 质 粒 ｐＧＢＫＴ７－５３ 和
ｐＧＡＤＴ７－Ｔ，阴性对照质粒 ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ（美国
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司），大肠杆菌ＴＯＰ１０菌株及已克隆的
ＯｓＲＵＳ２．１ 基 因 ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－ＢａｍＨＩ－ＯｓＲＵＳ２．
１ｃＤＮＡ－１３１７－ＨｉｎｄＩＩＩ由本实验室保存；ＹＮＢ和蛋
白胨（Ｄｉｆｃｏ公司），ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ（美国 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公
司），酵母提取物（ＯＸＯＩＤ公司），ＤＮＡ限制性内切
酶和 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶（ＴａＫａＲａ公司），ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－
Ｎｅｏ　ＤＮＡ 聚合酶和 ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ 公司），
ＤＳ２０００Ｍａｒｋｅｒ（东盛生物公司），ＤＮＡ胶回收试剂
盒（普博欣生物公司），２Ｘｐｏｗｅｒ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｍｉｘ（Ｍｉ－
ｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ公 司），Ｘ－β－ｇａｌ（ＢＢＬ 公 司），Ｘ－α－ｇａｌ
（ＧＯＬＤＢＩＯ公司）。
本实验所用的引物名称及引物序列：
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－１－Ｆ：５′－ＣＧＡＡＴＴＣＡＴ－
ＧＡＡＣＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧＡＴＡＣ －３′；
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－１３８－Ｒ：５′－ＡＧＧＡＴＣ－
ＣＴＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴ－３′；
ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－１３９－Ｆ：５′－ＧＧＡＡＴ－
ＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＣ －３′；
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－８７９－Ｒ：５′－ＴＧＧＡＴＣ－
ＣＧＧＡＡＡＣＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＴＴＧＡＴ－３′；
ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－８８０－Ｆ：５′－ＧＧＡＡＴ－
ＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＡＧＡＴＡＴＣＧ －３′；
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－１３１７－Ｒ：５′－ＣＧＧＡＴＣ－
ＣＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＧＣＴＧＡ －３′；
Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　５′ ＡＤ　ＬＤ－ｉｎｓｅｒｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍ－
ｐｌｉｍｅｒ： ５′－ＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣＡＣ－
ＣＡＡＡＣＣＣ －３′；
Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　３′ ＡＤ　ＬＤ－ｉｎｓｅｒｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍ－
ｐｌｉｍｅｒ：５′－ＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣ－
ＴＡＣＧＡＴＴ －３′。
１．２　ＯｓＲＵＳ２．１全长及片段克隆
以本实验室已克隆并测序的 ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－
ＢａｍＨＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＨｉｎｄＩＩＩ为模板，
７７１期　　　　潘家强等：ＯｓＲＵＳ２．１酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测
分 别 以 ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－１－Ｆ／ＯｓＲＵＳ２．１
ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－１３１７－Ｒ，ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－１－
Ｆ／ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－１３８－Ｒ，ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤ－
ＮＡ－ＥｃｏＲＩ－１３９－Ｆ／ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＢａｍＨＩ－８７９－Ｒ，
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－ＥｃｏＲＩ－８８０－Ｆ／ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－
ＢａｍＨＩ－１３１７－Ｒ为引物，采用高保真酶 ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－
Ｎｅｏ　ＤＮＡ 聚 合 酶 反 应 体 系，扩 增 获 得 Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ的四个不同片段。将这四个片段加
Ａ后与ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓｉｍｐｌｅ连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０
感受态，筛选获得阳性克隆，并经测序确认无突变。
１．３重组表达载体的构建与鉴定
将上述克隆并验证的ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－ＥｃｏＲＩ－１－Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ、ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－ＥｃｏＲＩ－１－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－ＥｃｏＲＩ－
１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ和 ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓ－
ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ及空载
体ｐＧＡＤＴ７用ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ双酶切，经琼脂糖凝
胶电泳检测酶切正确后，按照常规分子生物学连接、
转 化、 筛 选， 获 得 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－
１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ －８７９－ＢａｍＨＩ 和 ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ四个重
组表达载体，分别采用双酶切鉴定及测序确认读码
框正确。
１．４重组载体转化酵母感受态及快速筛选
按Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司酵母双杂交手册（２００７）进行
酵母菌株Ｙ１８７感受态制备，以及阳性对照质粒、阴
性对照质粒、四个ＯｓＲＵＳ２．１猎物载体（ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ和 ｐＧＡＤ
Ｔ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ）的转
化，并在相应营养缺陷板上筛选。分别对在ＳＤ－
Ｌｅｕ－ＤＯ营养缺陷板上生长的含ＯｓＲＵＳ２．１猎物载
体的Ｙ１８７菌落进行快速ＰＣＲ筛选，方法如下：挑
取１个直径２～３ｍｍ转化酵母菌落于ＰＣＲ管中，
加入３０μＬ　０．２％ＳＤＳ，漩涡振荡器上振荡１５ｓ，然
后在ＰＣＲ仪上９０℃处理４ｍｉｎ后，１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１
离心１ｍｉｎ，以上清液作为ＰＣＲ反应模板。按１０
μＬ　ＰＣＲ反应体系加入０．２μＬ提取液作为模板，引
物选用通用筛选引物 Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　５′ＡＤ　ＬＤ－ｉｎｓｅｒｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍｐｌｉｍｅｒ／Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　３′ＡＤ　ＬＤ－ｉｎｓｅｒｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍｐｌｉｍｅｒ，以２ＸＰＣＲ　ｐｒｅｍｉｘ进行扩增，
琼脂糖凝胶电泳检测。
１．５重组蛋白毒性检测
按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的酵母双杂交手册（２００７）
进行，具体为将上述验证保存的四个分别含Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１猎物载体载体的Ｙ１８７划线于ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ
营养缺陷板，倒置放３０℃恒温箱培养３～４ｄ至菌
落长出后，挑一个较大的菌落（直径２～３ｍｍ）接种
于５０ｍＬ　ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ液体培养基中（氨苄青霉素为
２５μｇ／ｍＬ），３０℃，２５０ｒ·ｍｉｎ－
１过夜摇菌培养，第
二天检测培养物的ＯＤ６００。
１．６重组载体转录自激活活性的检测
按Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司酵母双杂交手册（２００７）进行。
取过夜摇菌培养的阳性菌株（含阳性互作质粒）、阴
性菌株，空载体ｐＧＡＤＴ７转化菌以及上述四种转化
酵母菌液２ｍＬ于离心管中，１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５
ｓ后弃上清，将离心管在液氮中速冻１０ｍｉｎ，取出使
其自然融解约１０ｍｉｎ，再重复操作一次，加入５０μＬ
现配的Ｚ／Ｘ－ｇａｌ液，３０℃静置存放８ｈ染色，以检测
报告基因ＬａｃＺ的表达情况。
分别将含上述 ４ 种 ＯｓＲＵＳ２．１ 猎物载体、
ｐＧＡＤＴ７空载体以及含阳性对照质粒和阴性对照
质粒的Ｙ１８７菌株，划线于涂有１００μＬ　Ｘ－α－ｇａｌ液
（４ｍｇ／ｍＬ）的直径１０ｃｍ的ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ板，３０℃
静置存放３ｄ，以检测报告基因ＭＥＬ１的表达情况。
２　结果与分析
２．１四个ＯｓＲＵＳ２．１表达载体的构建与验证
采用高保真酶ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　Ｎｅｏ反应体系分别扩
增获得了ＯｓＲＵＳ２．１的四个基因片段（图１）。将这
些片段与ｐＭＤ１８－Ｔ－Ｓｉｍｐｌｅ连接、转化，筛选获得阳
性克隆，测序确认序列完全正确。通过ＥｃｏＲ１和
ＢａｍＨ１依次将四个ＯｓＲＵＳ２．１装载到表达载体
ｐＧＡＤＴ７上，再分别采用ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１双酶切和
ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定，用ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１双酶切可以
获得 ｐＧＡＤＴ７载体骨架及相应的插入片段；在
ｐＧＡＤＴ７多克隆位点两端均有一个 ＨｉｎｄＩＩＩ酶切
位点，因此用ＨｉｎｄＩＩＩ酶切就可以获得ｐＧＡＤＴ７载
体骨架及８００ｂｐ加上相应的插入片段的两个片段，
结果完全符合预期（图２）。用 Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　５′ＡＤ
ＬＤ－ｉｎｓｅｒｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍｐｌｉｍｅｒ为引物测序表明，四
个载体读码框正确，能表达出预期的蛋白，可以用于
８７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
下一步实验。
２．２酵母的转化及酵母菌落的ＰＣＲ鉴定结果
ｐＧＡＤＴ７ 空 载 体 和 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ、ＰＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－
１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ 和 ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ四个重
组载体转化的 Ｙ１８７酵母在ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ营养缺陷
板 上，以 及 ｐＧＡＤＴ７－Ｔ 与 ｐＧＢＫＴ７－５３ 和
ｐＧＡＤＴ７－Ｔ与ｐＧＢＫＴ７－Ｌａｍ 分别共转化的 Ｙ１８７
酵母在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－ＤＯ营养缺陷板上培养３ｄ后
即有数量不等的菌落长出，而未转化的Ｙ１８７却不
图１　四个ＯｓＲＵＳ２．１片段的ＰＣＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｍａｐ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ＯｓＲＵＳ２．１ＰＣＲ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
泳道３为ＤＳ２０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１为ＯｓＲＵＳ２．１（１～１３８）片段；
泳道２为ＯｓＲＵＳ２．１（１３９～８７９）片段；泳道４为ＯｓＲＵＳ２．１（８８０
～１３１７）片段；泳道５为ＯｓＲＵＳ２．１（１～１３１７）片段。
能在ＳＤ－Ｔｒｐ－ＤＯ，ＳＤ－Ｌｅｕ－ＤＯ，ＳＤ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－ＤＯ 营
养缺陷板上生长。挑取含ＯｓＲＵＳ２．１不同片段的
重组载体的四种转化酵母菌落进行快速ＰＣＲ筛选
鉴定，由于采用载体上的 Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　５′ＡＤ　ＬＤ－
ｉｎｓｅｒｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍｐｌｉｍｅｒ／Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　３′ＡＤ　ＬＤ－
ｉｎｓｅｒｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｍｐｌｉｍｅｒ通用引物，扩增获得的片
段比插入片段大约大２００ｂｐ（图３）。综合营养缺陷
板筛选及克隆ＰＣＲ结果说明构建的四种猎物载体
成功地转入酵母Ｙ１８７中。
２．３重组ＯｓＲＵＳ２．１表达载体对酵母菌株Ｙ１８７的
毒性检测
　　培养检测结果表明，含ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７在培养１６ｈ，
ＯＤ６００分别达到０．８０７、０．８７８，含ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７在培
图２　四种ＯｓＲＵＳ２．１猎物重组载体的酶切鉴定图谱
Ｆｉｇ．２　Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍａｐ　ｏｆ　４　ＯｓＲＵＳ２．１ｐｒｅｙ
ｖｅｃｔｏｒｓ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ
泳道５为ＤＳ２０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１，３，６和８为ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－
１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．
１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－
１３１７－ＢａｍＨＩ 和 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－
ＢａｍＨＩ被 ＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１ 酶切图谱；泳道 ２、４、７ 和 ９ 为
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２． １ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、 ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ和ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１
ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ被ＨｉｎｄⅢ酶切图谱。
图３　转化ＯｓＲＵＳ２．１猎物重组载体的
酵母Ｙ１８７菌株的克隆ＰＣＲ筛选图谱
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍａｐ　ｏｆ　Ｙ１８７ｓｔｒａｉｎｓ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ＯｓＲＵＳ２．１ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ
泳道３为 ＤＳ２０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１，２，４和５分别为ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－
ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１
ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ 和 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－
１３１７－ＢａｍＨＩ　Ｙ１８７克隆ＰＣＲ筛选。
养１８ｈ，ＯＤ６００分别达到１．１３１、０．８２７，含ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的Ｙ１８７在
培养１９ｈ，ＯＤ６００达到０．８６６，均超过０．８的判断标准，
说明重组蛋白对酵母Ｙ１８７生长无毒性，可用于下一
步的蛋白相互作用研究。
９７１期　　　　潘家强等：ＯｓＲＵＳ２．１酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测
图４　四种ＯｓＲＵＳ２．１重组猎物载体对Ｙ１８７
的自激活活性检测 （ＬａｃＺ法）
Ｆｉｇ．４　Ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　４　ＯｓＲＵＳ２．１
ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｙ１８７（ＬａｃＺ　ｍｅｔｈｏｄ）
１为阳性对照；２为阴性对照；３为转化有ｐＧＡＤＴ７空载体的
Ｙ１８７；４为含ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ
的 Ｙ１８７；５ 为含 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－
ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７；６为含 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤ－
ＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的Ｙ１８７；７为含ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１
ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的Ｙ１８７；１为蓝色，其余均为白色。
２．４重组ＯｓＲＵＳ２．１表达载体对酵母菌株Ｙ１８７的
自激活活性检测
　　β－半乳糖苷酶显色法的结果表明，含ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－
ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ和 ｐＧＡＤ
Ｔ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７
经８ｈ染色均未变蓝，而阳性对照在５ｈ就变蓝（图
４），说明这四个基因片段均不会对酵母Ｙ１８７产生自
激活作用，可用于以后的蛋白互作研究。
　　Ｘ－α－ｇａｌ平板显色法检测结果表明，含ｐＧＡＤＴ７－
空 载 体、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－
ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－１３８－
ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－８７９－
ＢａｍＨＩ、ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－
ＢａｍＨＩ和阴性对照的Ｙ１８７划线菌落培养３ｄ后都
图５　四种ＯｓＲＵＳ２．１猎物载体对Ｙ１８７的自激活活性检测（ＭＥＬ１法）
Ｆｉｇ．５　Ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　４　ＯｓＲＵＳ２．１ｐｒｅｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｙ１８７（ＭＥＬ１ｍｅｔｈｏｄ）
１为阳性对照；２为阴性对照；３为含空载体ｐＧＡＤＴ７的 Ｙ１８７；４为含ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７；５为含
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７；６为含ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的 Ｙ１８７；７为含
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ的Ｙ１８７；１为蓝色，其余均为白色。
未变蓝，为正常白色菌落，而阳性对照菌落则变蓝
（图５），进一步说明这四个基因片段均不会对酵母
Ｙ１８７产生自激活作用，可用于以后的酵母双杂交蛋
白互作验证。
３　结论与讨论
酵母双杂交技术既是筛选与目标蛋白具有相互
作用能力未知蛋白的高通量技术，也可用于检验两
个已知蛋白间是否具有相互作用，自Ｆｉｅｌｄｓ　＆Ｓｏｎｇ
（１９８９）提出此方法以来，这一技术在研究蛋白互作
领域发挥了重要作用。ＲＵＳ是近年来发现的与植
物极低强度ＵＶ－Ｂ下光形态建成有关的基因，但目
前对其信号传导途径尚缺乏认识（Ｔｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，
２００８；Ｌｅａｓｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００９）。笔者采用酵母双杂交
技术研究ＯｓＲＵＳ１和ＯｓＲＵＳ２的互作情况，以进一
步了解这一信号传导途径的分子机制。笔者在前期
工作中，已根据ＯｓＲＵＳ１的ＤＵＦ６４７的分布情况构
建了ＯｓＲＵＳ１四个不同片段的诱饵载体，并进行表
达蛋白毒性及自激活活性检测（潘家强等，２０１２）。
　　本研究根据ＯｓＲＵＳ２．１的ＤＵＦ６４７分布情况，构
建 ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３８－ＢａｍＨＩ、
０８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１３９－ＯｓＲＵＳ２．１ ｃＤＮＡ－８７９－ＢａｍＨ１，
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－８８０－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－Ｂａｍ 和
ｐＧＡＤＴ７－ＥｃｏＲＩ－１－ＯｓＲＵＳ２．１ｃＤＮＡ－１３１７－ＢａｍＨＩ四
种猎物蛋白表达载体，这些工作将为下一步研究Ｏｓ－
ＲＵＳ１和ＯｓＲＵＳ２是否具有相互作用以及通过什么区
域互作奠定基础。由于某些蛋白的表达可能对酵母
细胞产生毒害作用，使其不能在选择培养基上生长；
以及一些蛋白含有酸性氨基酸区域或者能够与酵母
宿主转录激活因子结合，从而直接激活报告基因的表
达。因此在筛选前需验证诱饵载体的毒性与自身激
活作用，用以排除假阳性和假阴性的相互作用。本研
究采用含上述重组猎物表达载体的Ｙ１８７摇菌培养，
ＯＤ６００全部能在１９ｈ以内达到０．８，说明表达的Ｏｓ－
ＲＵＳ２．１及其片段对酵母的生长无毒性；对ＬａｃＺ和
ＭＥＬ１报告基因活性染色表明，ＯｓＲＵＳ２．１及其片段
也不能激活酵母的转录系统。综上所述，构建的四个
ＯｓＲＵＳ２．１猎物蛋白表达载体表达的融合蛋白对宿
主菌Ｙ１８７无毒性，且无自激活作用，可应用于后续的
酵母双杂交实验。
参考文献：
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Ｗｕ　Ｄ，Ｈｕ　Ｑ，Ｙａｎ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．２０１２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－Ｂ
ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ　ｂｙ　ＵＶＲ８［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，４８４：
檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽檽
２１４－２１９
（上接第４５页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｇｅ　４５）
　　本种与荔波报春苣苔Ｐｒｉｍｕｌｉｎａ　ｌｉｂｏｅｎｓｉｓ（Ｗ．Ｔ．
Ｗａｎｇ　＆Ｄ．Ｙ．Ｃｈｅｎ）Ｍｉｃｈ．Ｍｌｅｒ　＆ Ａ．Ｗｅｂｅｒ和桂
林报春苣苔Ｐ．ｇｕｅｉｌｉｎｅｎｓｉｓ（Ｗ．Ｔ．Ｗａｎｇ）Ｙ．Ｚ．Ｗａｎｇ
在亲缘关系上相接近，但叶两面均具直立柔毛，叶上
面呈显著泡状，具较多花序，（１）２～９条，花序梗较长，
（４．０）８．５～１５ｃｍ，苞片线形或线状披针形，大小为７
ｍｍ×１ｍｍ，花大，长４．２～５．３ｃｍ，粉紫色，退化雄蕊
较长，１３～１５ｍｍ，花期１１月，可以区别（表１）。
致谢　承蒙林文宏先生为本文绘图，在此表示衷
心的谢意！
参考文献：
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［Ｍ］／／Ｗｕ　ＺＹ，Ｒａｖｅｎ　ＰＨ．Ｆｌｏｒａ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ
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Ｗｕ　ＷＨ，Ｘｕ　ＷＢ，Ｎｏｎｇ　ＤＸ，ｅｔ　ａｌ．２０１１．Ｃｈｉｒｉｔａ　ｎｉｎｇｍｉｎｇｅｎｓｉｓ
（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ），ａ　ｎｅｗ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｂｏｔ
Ｆｅｎｎ，４８：４２２－４２４
Ｘｕ　ＷＢ，Ｌｉｕ　Ｙ，Ｇａｏ　ＨＳ．２０１０．Ｃｈｉｒｉｔｏｐｓｉｓ　ｊｉｎｇｘｉｅｎｓｉｓ，ａ　Ｎｅｗ
Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｋａｒｓｔ　Ｃａｖｅ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．
Ｎｏｖｏｎ，１９：５５９－５６１
Ｘｕ　ＷＢ，Ｈｕａｎｇ　ＹＳ，Ｗｕ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．２０１１．Ｃｈｉｒｉｔａ　ｌｕｏｃｈｅｎｇｅｎｓｉｓ
（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ），ａ　ｎｅｗ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｌｉｍｅｓｔｏｎｅ　ａｒｅａｓ　ｉｎ　ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｂｒｉｔｏｎｉａ，６３（２）：３１４－３１７
１８１期　　　　潘家强等：ＯｓＲＵＳ２．１酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测