全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):４１４－４１８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．０２４
晏荣军,林溪,胡佳扬,等．螺旋藻有效成分超临界萃取与分离研究[J]．广西植物,２０１４,３４(３):４１４－４１８
YanRJ,LinX,HuJY,etal．StudyontheefectiveconstituentsofSpirulinaplatensiswithsupercriticalfluidextractionandseparation[J]．Guihaia,
２０１４,３４(３):４１４－４１８
螺旋藻有效成分超临界萃取与分离研究
晏荣军,林　溪,胡佳扬,裘俊红,陆向红
(浙江工业大学 化学工程与材料学院,杭州３１００１４)
摘　要:使用超临界CO２萃取技术对钝顶螺旋藻粉进行萃取与分离,结果表明:超临界CO２萃取的最优条件
为压力２０Mpa,夹带剂使用量１００mL/１００g,温度５０℃,萃取时间２h;利用凯氏定氮法及气相色谱法分别对
超临界萃取处理过的螺旋藻中蛋白质和多糖进行研究与分析,结果表明:螺旋藻粉中蛋白质含量为４９．３９％,
螺旋藻多糖中的单糖含量占多糖粗品的９．２５％,主要组成为鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等.
关键词:螺旋藻;超临界CO２萃取;蛋白质;多糖
中图分类号:Q９４６．３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０４１４Ｇ０５
StudyontheeffectiveconstituentsofSpirulinaplatensis
withsupercriticalfluidextractionandseparation
YANRongＧJun,LINXi,HUJiaＧYang,QIUJunＧHong,LUXiangＧHong
(CollegeofChemicalEngineeringandMaterials,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou３１００１４,China)
Abstract:TheefectiveconstituentsoftheSpirulinaplatensiscomponentswereanalysedandextractedusedthesuＧ
percriticalCO２extraction．TheoptimalconditionsofsupercriticalCO２wereasfolows:２０MPaasextractionpresＧ
sure,５０℃asextractiontemperature,１００mL/１００gasentrainer,２hasextractiontime．AndalsoanalysisonSpirＧ
ulinaproteinandpolysaccharidebyusingKjeldahlmethodandGasChromatography,theresultsshowedthattheproＧ
teincontentofSpirulinaplatensiswas４９．３９％,thecontentofSpirulinaplatensismonosaccharidesinthepolysacＧ
charidewas９．２５％．Mostofmonosaccharideswascomposedfromrhamnose,xylose,mannose,glucoseandgalactose．
Keywords:Spirulinaplatensis;supercriticalCO２extraction;protein;polysaccharide
　　螺旋藻在水产动物育苗和海水养殖中得到了广
泛使用(高天荣等,２００２),超临界CO２流体技术作
为一种替代传统萃取工艺的新技术,受到越来越多
的瞩目(Satoetal．,１９９４;Raoetal．,１９９２).利用
超临界CO２流体的萃取技术对螺旋藻进行分离提
取,具有高效、便捷等特点,有利于实现工业化、规模
化生产(李天祥等,２００２;徐海军,１９９４).该技术可
同时对螺旋藻多种成分进行分离和提取,而且在萃
取过程中无溶剂残留、无污染并很好防止物质被氧
化.螺旋藻含有极其丰富而均衡的营养成分,粗蛋
白含量高达干重的６０％~７０％(胡一兵等,２００２;俞
丽君等,１９９９).因此,对螺旋藻蛋白的研究与开发
具有重要意义.
本研究使用超临界CO２萃取技术对螺旋藻进
行萃取与分离,并结合凯氏定氮法及气相色谱法(章
银良等,１９９９;王勇等,１９９９;胡佳续等,２０１０),研究
螺旋藻的蛋白质及多糖组成,旨在为螺旋藻在养殖
饲料和食品开发应用及产业化提供依据和技术参考.
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ０９　　修回日期:２０１４Ｇ０１Ｇ１３
基金项目:浙江省大学生新苗计划项目(２０１２R４０３０４４);教育部留学回国人员科研启动基金.
作者简介:晏荣军(１９７６Ｇ),男,湖南岳阳人,博士后,讲师,从事水环境生物学研究,(EＧmail)yanrj＠zjut．edu．cn.
１　材料与方法
１．１超临界萃取最佳条件设计
称取钝顶螺旋藻粉(由浙江康普螺旋藻有限公
司提供)７５g,将其平均分成２份,用脱脂棉包好,再
用纱布包成半径约３cm、长１０cm的圆柱体状,放
入１L萃取缸,盖上堵头.先检查阀门并观察水槽,
确保正确后打开电源,打开仪表,等温度小于等于５
℃后运行设备.循环运行４５min后,加入夹带剂
８０％乙醇.稳定运行２h后,萃取结束,用２个锥形
瓶接收分离１,２出口的物质并记录好质量差.根据
萃取压力、温度、时间和夹带剂加入量对萃取的影
响,设计并在能达到的最佳提取工艺条件下得到萃
取物.
影响超临界萃取的主要因素是萃取压力、温度、
夹带剂加入量和时间.由于萃取达到一定时间后,
萃取率变化较小,本研究将温度设定为５０℃,萃取
时间设定为２h,设计了９组实验.见表１.
表１　萃取压力与夹带剂加入量对超临界萃取的影响
Table１　Relationshipbetweenextractionpressure
andentrainerofsupercriticalCO２
组别
Group
萃取压力
Extraction
pressure
(MPa)
夹带剂加入量
Addition
entrainer
(mL/１００g)
萃取温度
Extraction
pressure
(℃)
萃取时间
Extraction
time
(h)
１ １０ ５０ ５０ ２
２ １０ １００ ５０ ２
３ １０ １５０ ５０ ２
４ １５ ５０ ５０ ２
５ １５ １００ ５０ ２
６ １５ １５０ ５０ ２
７ ２０ ５０ ５０ ２
８ ２０ １００ ５０ ２
９ ２０ １５０ ５０ ２
１．２蛋白质含量测定
称取２g超临界萃取后萃取缸内的螺旋藻粉,
依次加入３０ mL 浓 H２SO４,０．３gCuSO４,３g
K２SO４,加热到３００℃直至炭化无泡沫后,降温到
１８０℃,分３次加入３０mLH２O２.再次加热到３００
℃,呈蓝绿色后,继续加热３０min,消解完全后,浓
硫酸将样品中的有机氮都转变成无机铵盐.取同样
质量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、过氧化氢为空白样.
应用凯氏定氮测定蛋白质含量.
用已知浓度的 HCL标准溶液进行滴定,依据
酸滴定量用下列公式计算含氮量及粗蛋白含量.
含氮量:N(％)＝
１．４０１×M
W
(V－V０)
粗蛋白含量:P(％)＝N(％)×C
式中,M 为标准摩尔浓度;W 为样品重量;V０为
空白样滴定标准酸消耗量;V 为样品滴定标准酸消
耗量;C 为粗蛋白转换系数.
取两组数据平均值,即螺旋藻的蛋白质含量.
１．３多糖提取与单糖成分分析
１．３．１提取工艺路线　工艺路线:超临界萃取物→加
９５％乙醇回流脱脂→热介质浸提→离心合并上清
液→残渣复提→离心合并上清液→减压浓缩→
sevage法去蛋白→糖溶液加乙醇至６０％~６５％,醇
沉过夜→离心收集沉淀→加水复溶→离心去除不溶
物→冻干得多糖粗品.
Sevage法(穆文静等,２０１１):正丁醇,氯仿混合
溶液(正丁醇∶氯仿＝１∶５)和样物提取液混合并且
震荡,不需加热,直到液面交界处无白色混悬.
１．３．２提取工艺条件　脱脂回流:８５℃,２h;料液比:
１∶２５;提取介质:稀盐酸,pH＝４;提取条件:７０℃,
４h;减压浓缩温度:４０℃;醇沉:置于４℃冰箱中.
１．３．３多糖中单糖成分分析
(１)多糖的水解:称取多糖样品１０mg,置于２０
mg水解管中,加入２０mL,２mol/L的三氟乙酸溶
液溶解,封管,１００℃水浴中水解８h,６０℃下减压
浓缩至干.
(２)单糖衍生物的制备:糖腈乙酰脂衍生:在蒸
干的多糖水解样品中加入１０mg肌醇作为内标、
１００mg盐酸羟胺、１０mg吡啶,在摇床上震荡５
min,使之完全溶解后９０℃水浴反应３０min,使单
糖还原成相应糖,取出后冷却至室温,加入１０mL
乙酸酐,混合均匀后９０℃水浴反应３０min,反应物
可直接进行气相色谱分析.
(３)气相色谱分析:色谱条件(Chanegrihetal．,
１９９２):RtxＧ１石英毛细管柱(３０m×０．２５mm,美国
Restek公司);进样口温度２５０℃;柱箱起始温度６０
℃,１５℃/min至１８０℃,保持２min,３℃/min至
２４０℃,保持１５min;载气为高纯氮,流速３０mL/
min;FID检测器,温度２５０℃.
根据结果绘制色谱曲线,并与鼠李糖、半乳糖、
阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、肌醇的标准曲线做
对比,分析单糖的成分.
(４)糖腈乙酰酯衍生法测定水解单糖含量:根据
标准样品的色谱曲线,得各种单糖的相对质量矫正
５１４３期　　　　　　　　　晏荣军等:螺旋藻有效成分超临界萃取与分离研究
因子,按下式计算:Fi＝(As×Wi)/(Ai×Ws).
式中,Fi为单糖的校正因子;Ai,Wi分别为单
糖的峰面积和质量;As,Ws分别为内标物的峰面积
和质量.
２　结果与分析
２．１超临界萃取
准确称取分离１与分离２接收的物质,研究结
果见表２.
表２　分离１与分离２接收量
Table２　Receivedquantityofseparation１andseparation２
组别
Group
分离１接收量
Separation１
(g)
分离２接收量
Separation２
(g)
总接收量
Totalreceivedquantity
(g)
１ ０．９３ １．３ ２．２３
２ １．０７ １．４９ ２．５６
３ １．０８ １．５３ ２．６１
４ ２．１６ ２．５１ ４．６３
５ ２．３９ ２．８０ ５．１９
６ ２．４４ ２．８１ ５．２５
７ ３．０８ ３．７７ ６．８５
８ ３．４１ ４．０２ ７．４３
９ ３．４３ ４．０８ ７．５１
图１　萃取压力－总接收量
Fig．１　Relationshipbetweenextraction
pressureandreceivingamount
　　对比萃取压力与总接收量,结果如图１.图１
结果表明,随着萃取压力的加大与夹带剂加入量的
增加,分离１和分离２的接收量都有所增加,当萃取
压力达到２０MPa时分离所得产物最多,此时夹带
剂加入量为１００、１５０mL/１００g条件下所得产物质
量接近.
萃取压力是超临界CO２萃取的最重要的工艺
参数之一,在温度恒定时,压力增大,超临界CO２密
度增大,从而使其溶解能力增大.当压力增大到一
定程度时,溶解能力增加缓慢.因此,压力并非越大
越好,需要根据萃取物质的不同和机器的运行状况
来设定.综合研究结果选定超临界CO２最优萃取
条件为压力２０MPa,夹带剂加入量１００mL/１００g,
温度５０℃,时间２h.
２．２蛋白质含量测定
２．２．１加液速率测定　根据凯氏定氮仪的加液时间及
加液量,计算加液速率(陈钧辉等,２００３)(表３).
表３　凯氏定氮仪加液速率
Table３　LiquidfilingrateofKieldahlAzotometer
加液类型
Typeof
Liquidfiling
加液量
Contentof
Liquidfiling
(mL)
加液时间
Timeof
Liquidfiling
(s)
加液速率
Liquidfilingrate
(mL/s)
碱液Alkalilye ２２ ５ ４．４
酸液Acidliquor ３６．５ ５ ７．３
　　上机后蒸馏前,需加入１１４mL氢氧化钠和３０
mL硼酸,根据加液速率,设定加液时间为碱液２６
s,酸液５s.完成蒸馏后,得到硼酸吸收液.
２．２．２定氮结果　取粗蛋白系数为６．２５,根据公式计
算螺旋藻中蛋白质含量.消解方法的选择,对螺旋
藻中蛋白质含量的测定影响较大,经多次实验得２g
螺旋藻粉中加入３０mLH２SO４,０．３gCuSO４,３g
K２SO４,３０mLH２O２为最优,且温度需严格按照消
解方法进行调节.两次定氮的结果如表４,P(％)取
两次结果的平均值,测定螺旋藻的蛋白质含量为
４９．３９％.
表４　螺旋藻中的蛋白质含量
Table４　ProteinlevelofSpirulinaplatensis
组别
Group
V
(mL)
V０
(mL)
M
(mol/L)
W
(g)
N
(％)
P
(％)
１ １０１．０ ０．１ ０．１ ２ ７．０６８ ４４．１８
２ １２４．８ ０．１ ０．１ ２ ８．７３５ ５４．６０
２．３多糖成分分析
２．３．１多糖粗品提取　由于超临界萃取物质量有限,
先使用螺旋藻粉取得最佳测试条件,步骤中的
Sevage法重复去蛋白会导致多糖的大量损失.利
用藻粉实验中第一次用７g藻粉,去蛋白次数为５
次,收集到多糖粗品仅４mg;第二次用１２．５g藻粉,
去蛋白次数为３次,收集到多糖粗品约５０６mg.若
再减少次数,去蛋白效果就会降低,故得出Sevage
法去蛋白,较优次数为３次.因为螺旋藻多糖中含
有硫酸根基团,故碱提易使其脱落;而水提和稀酸提
６１４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
取所得多糖色泽相对很好,且操作过程较易控制,在
pH值为４,料液比１∶２５,浸取时间４．０h,浸取温度
７０℃的工艺条件下,对螺旋藻多糖进行提取.取萃
取压力２０MPa,夹带剂加入量为１００mL/１００g条
件下的分离１的超临界萃取物３．４１g,提取得多糖
粗品７３．８０mg.
２．３．２气相色谱分析　单糖标准样品糖腈乙酰酯衍
生物气相色谱图见图２.图２出现七个吸收峰,从
左往右分别为鼠李唐、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄
糖、半乳糖、肌醇,其中肌醇为内标物.６种单糖的
相对质量校正因子见表５.
图２　单糖标准样品糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图
Fig．２　GaschromatogramofglycＧnitrilederivatization
表５　标准单糖的保留时间和相对质量校正因子
Table５　Retentiontimeandcorrectionfactor
ofstandardmonosaccharide
单糖
Standard
monosaccharide
保留时间
Retentiontime
(s)
相对质量校正因子
Relativecalibration
factor
鼠李糖 Rhamnose １８．０１４ １．７５５
阿拉伯糖 Arabinose １８．２９７ １．９６０
木糖 Xylopyranose １８．４６３ ２．９３３
甘露糖 Mannose ２３．００５ １．５４７
葡萄糖 Glucose ２３．２４４ １．９８８
半乳糖 Galactose ２３．９０９ １．９６３
肌醇Inositol ２６．６７１ １．０００
　　将螺旋藻多糖样品的气相色谱曲线与标准品的
曲线做比较见图３.
经内标法测定后,测得鼠李糖、木糖、甘露糖、葡
萄糖、半乳糖质量分别为０．８５４、１．８９４、０．７５６、０．５３４、
２．７８７mg.单糖总量为６．８２５mg,占多糖粗品的
９．２５％.选用的糖腈乙酰酯衍生后,色谱峰并未产
生异构峰,每个单糖都能找到对应的色谱峰,且无需
后续处理过程,直接色谱进样分析,从而保证定性、
图３　单糖标准样品和螺旋多糖样品的糖腈乙酰酯衍
生物气相色谱图　b为螺旋藻多糖样品的色谱曲线,参照标
准曲线a,判断结果b１鼠李糖;b２木糖;b３甘露糖;b４葡萄糖;
b５半乳糖;b６肌醇.
Fig．３　GaschromatogramofglycＧnitrilederivatizaＧ
tionofstandardmonosaccharideandSpirulinaplatＧ
ensispolysaccharide　bshowedchromatogram curveof
Spriulina polysaccharidesamplesaccordingtothestandard
curveofa,theresultofgaschromatogramofglycＧnitrilederivatＧ
ization:b１Rhamnose;b２Xylopyranose;b３ Mannose;b４ GluＧ
cose;b５Galactose;b６Inositol．
定量的准确性.结果表明螺旋藻多糖的单糖组成以
木糖和半乳糖为主.
参考殷钢等(１９９９)的研究结果,测得的单糖含
量有所偏低,可能的原因一方面是由于螺旋藻多糖
提取不够充分,使用sevage法去蛋白时多糖损失过
高;另一方面跟螺旋藻多糖水解不完全有关.
３　结论
(１)使用超临界CO２萃取技术对钝顶螺旋藻粉
进行萃取与分离.筛选超临界CO２萃取的最优条
件为压力２０Mpa,夹带剂使用量１００mL/１００g,温
度５０℃,萃取时间２h;
(２)利用凯氏定氮法及气相色谱法分别对螺旋
藻超临界萃取产物中蛋白质和多糖进行研究与分
析.研究结果表明螺旋藻粉中蛋白质含量为
４９．３９％,螺旋藻多糖中的单糖组成为鼠李糖、木糖、
甘露糖、葡萄糖、半乳糖,质量占多糖粗品的９．２５％.
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８１４ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷