全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ　３２（１）：５３－５５　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２０１２ 年 １ 月 　
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０１．０１２
栲树叶片ＳＥＭ样品制备
胡华强１，２，胡晓颖１，孙　晔１，３＊
（１．中国科学院 华南植物园，广州５１０６５０；２．中国科学院 研究生院，北京１０００４９；３．中国科学院
华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室，广州５１０６５０）
摘　要：栲树叶片下表皮覆盖着一层密集的薄壁盾状毛影响了对其叶表面特征的观察。经ＦＡＡ固定→二甲
苯和丙酮的混合液（１∶１）浸泡→恒温金属浴加温→超声波（５０～６０Ｈｚ，９０Ｗ）振荡器→系列酒精浓度脱水处
理后，叶表面薄壁盾状毛脱落，在ＳＥＭ扫描电子显微镜下可观察到叶表皮形态结构（气孔器，细胞排列及近圆
形的毛基）。此方法操作简便、效果明显，并且安全和无污染。
关键词：栲树叶片；薄壁盾状毛；ＳＥＭ；样品制备
中图分类号：Ｑ３３６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０１－００５３－０３
＊ ＳＥＭ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ
ｏｆ　Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉ
ＨＵ　Ｈｕａ－Ｑｉａｎｇ１，２，ＨＵ　Ｘｉａｏ－Ｙｉｎｇ１，ＳＵＮ　Ｙｅ１，３＊
（１．Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６５０；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００４９；３．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，
Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｌｏｗｅｒ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉｉ（Ｆａｇａｃｅａｅ）ｃｏｖｅｒｅｄ　ｄｅｎｓｅｌｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｉｎ－ｗａｌｅｄ　ｐｅｌ－
ｔａｔｅ　ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ　ｇａｖｅ　ｒｉｓｅ　ｔｏ　ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｍｉｃｒｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｔｈｅ　ｔｈｉｎ－ｗａｌｅｄ　ｐｅｌ－
ｔａｔｅ　ｔｒｉｃｈｏｍｅ　ｗａｓ　ｓｈｅｄ　ｏｆｆ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＦＡＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　ａｎｄ　ａｃ－
ｅｔｏｎｅ（１∶１），ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｉｎ　ａｎ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｗａｖｅ　ｂａｔｈ（５０－６０Ｈｚ，９０Ｗ）ａｎｄ　ｒｉｎｓｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｈｏｗｎ　ｃｌｅａｒｌｙ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅ－
ｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＳＥＭ）．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｅａｓｙ　ｔｏ　ｏｐｅｒａｔｅ，ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｎｏｎ－
ｐｏｌｕｔｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ；ｔｈｉｎ－ｗａｌｅｄ　ｐｅｌｔａｔｅ　ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ；Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
　　栲树（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉｉ）属壳斗科（Ｆａｇａｃｅ－
ａｅ）栲属，是亚热带常绿阔叶林中的主要建群种和优
势种，广泛分布于我国亚热带区域，具有重要的经济
与生态价值（吴征镒，１９８０；闫淑君等，２００２；宋萍等，
２００３）。栲树林是我国常绿阔叶林的主要类型，对于
以栲树为建群种的群落结构以及遗传多样性方面已
开展了较为深入的研究（刘智慧，１９９０；徐立安等，
２００１；Ｚｈｕ等，２００２；叶万辉等，２００４），但对于栲树叶
表皮特征的研究却鲜有报道。研究栲树叶表皮结构
特征，对栲树植物分类以及阐释栲树群落生态和群
体分布的格局具有重要意义。
扫描电子显微镜（ＳＥＭ）技术目前已广泛应用
＊ 收稿日期：２０１１－０５－０９　　修回日期：２０１１－０９－１７
基金项目：国家自然科学基金（３０８７１９５９）；中国科学院生命科学领域基础前沿研究专项（ＫＳＣＸ２－ＥＷ－Ｊ－２８）；中国科学院仪器设备功能开发技术创新
项目（ｙｇ２０１００７９）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（３０８７１９５９）；Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＫＳＣＸ２－ＥＷ－Ｊ－２８）］
作者简介：胡华强（１９８３－），男，河北邯郸市人，硕士，从事植物学研究工作，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｈｕｈｑ０５＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ。
＊通讯作者：孙晔，男，甘肃永昌县人，博士，从事进化植物学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｓｕｎ－ｙｅ＠ｓｃｂｇ．ａｃ．ｃｎ。
于植物比较形态学研究，但由于新鲜的栲树叶下表
皮覆盖着一层薄壁盾状毛，这些薄壁盾状毛密集分
布在角质层上，制片中难以剥离，因而无法观察栲树
叶下表皮的形态特征，如气孔器的形状，表面是否光
滑，表皮细胞的垂周细胞壁的轮廓等（Ｊｏｎｅｓ，１９８６；
Ｌｉｕ等，２００９）。为了去除表皮薄壁盾状毛，同时又
不影响叶表面形态结构，经过几个月方法摸索，我们
筛选出了一种非常好的处理方法，在此做一介绍。
１　材料和方法
取新鲜植物叶片放于ＦＡＡ固定液（每１００ｍＬ
固定液中含７０％酒精９０ｍＬ、５ｍＬ冰醋酸、５ｍＬ
甲醛）保存。将叶片切小，长宽１～０．８ｃｍ（５～８
片），放入５ｍＬ的离心管中，加入二甲苯和丙酮的
混合液（１∶１），放置于ＪＳ－４００Ａ恒温金属浴中定温
至７０℃，加热２４～２８ｈ，然后放入１５１０ＢＲＡＮＳＯＮ
中超声波（５０～６０Ｈｚ，９０Ｗ）振荡２ｈ。再依次用
３０％、５０％、７０％、８０％、９０％的乙醇进行逐级脱水。
其中用３０％、５０％乙醇脱水每次２０ｍｉｎ，加入７０％
乙醇置于１５１０ＢＲＡＮＳＯＮ中超声波（５０～６０Ｈｚ，
９０Ｗ）振荡１ｈ，８０％、９０％的乙醇脱水时间为２０
ｍｉｎ。然后用无水乙醇脱水３次，每次１０ｍｉｎ，更换
叔丁醇３次，每次１０ｍｉｎ，最后放入－２０℃冰箱内２ｈ
以上。将样品取出后放入ＪＦＤ－３１０中进行临界点干
燥，干燥后用双面胶贴在样品台上，用ＪＦＣ－１６００离子
溅射镀金膜１０ｎｍ，利用ＪＳＭ－６３６０ＬＶ扫描电子显微
镜进行观察并拍照。以未经处理的叶片作对照。
２　结果与分析
用此方法处理后，栲树叶表面的绝大部分表皮
毛脱落，叶表面清洁，表皮细胞排列清晰，气孔器上
保卫细胞和副卫细胞形状非常明显，且能看见近圆
形的表皮毛脱落后所形成的毛基（图版Ⅰ：１，２）。为
了证明上述方法结果比较理想，我们用离析液（１０％
铬酸∶１０％硝酸＝１∶１）进行表皮剥离发现，叶表皮
正反两面都无法观察到叶表皮形态结构（图版Ⅰ：３，
４）。通过调节恒温金属浴温度和加热时间及超声波
震荡时间的方法进行多次实验，发现叶表皮形态仍
留有大量表皮毛（图版Ⅰ：５，６）。因此，这些方法都
无法用ＳＥＭ 对栲树叶表皮形态结构进行观察和
拍照。
３　结论与讨论
薄壁盾状毛紧密地附着在栲树叶片下表皮且难
以去除（图版Ⅰ：７，８），目前尚无报道说明如何去除
表皮毛以便于通过扫描电子显微镜观察叶表皮的结
构。用常规弱酸弱碱液进行处理后，薄壁盾状毛与
叶表皮不能分开，仍然难以达到预期的效果。通过
多次对比试验发现，在进行二甲苯和丙酮混合液（１
∶１）浸泡，提高温度和加热时间以及延长在水浴超
声波振荡器的时间可以有效地去除叶表皮的薄壁盾
状毛。关键技术是要掌握好二甲苯和丙酮混合液（１
∶１）浸泡的时间和温度，时间过短或温度过低会使
薄壁盾状毛无法脱去，时间过长或温度过高易破坏
细胞结构。本研究发现，浸泡温度控制在７０℃，时
间为２４～２８ｈ时去除叶表皮薄壁盾状毛的效果最
佳。利用水浴超声波振荡器可以起到清洗、分散作
用，掌握适当的时间，防止叶表皮细胞结构的破碎。
总之，此方法具有操作简单、处理时间短、化学试剂
用量少、安全无污染等优点。栲树叶片经此方法处理
后利用扫描电子显微镜可非常清晰地观察到叶表皮
微形态特征，可为需要做类似实验的植物学工作者提
供有益的参考。
参考文献：
刘智慧．１９９０．四川省缙云山栲树种群结构和动态的初步研究
［Ｊ］．植物生态学与地植物学学报，１４（２）：１２０－１２８
宋萍，洪伟，吴承祯等．２００３．中亚热带丝栗栲次生林群落高度
级结构分析［Ｊ］．应用与环境生物学报，９（５）：４６０－４６４
徐立安，李新军，潘惠新，等．２００１．用ＳＳＲ研究栲树群体遗传
结构［Ｊ］．植物学报，４３（４）：４０９－４１２
闫淑君，洪伟，吴承祯等．２００２．丝栗栲种群生命过程及谱分析
［Ｊ］．应用与环境生物学报，８（４）：３５１－３５５
叶万辉，练琚蕍，曹洪麟．２００４．中国栲属植物建群种地理分布
与替代规律分析［Ａ］．见：中国科学院生物多样性委员会．中
国生物多样性保护与研究进展第五届全国生物多样性保护与
持续利用研讨会论文集［Ｃ］．２８１－２８７
吴征镒．１９８０．中国植被［Ｍ］．北京：科学出版社：５４－５７
Ｊｏｎｅｓ　ＪＨ．１９８６．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｇａｃｅａｅ：Ｔｈｅ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｆｌ－
ｌｉａｒ　ｆｅａｔｕｒｅ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｍｏ　Ｂｏｔ　Ｇａｒｄ，７３（２）：２２８－２７５
Ｌｉｕ　ＭＱ，Ｄｅｎｇ　Ｍ，Ｚｈｏｕ　ＺＫ．２００９．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ａｎｄ　ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｍ－
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ，Ｃａｓｔａｎｅ
ａｎｄ　Ｃｈｒｙｓｏｌｅｐｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｙｓｔ　Ｅｖｏｌ，２８３（１）：１１１－１２３
Ｚｈｕ　ＱＨ（朱其惠），Ｐａｎ　ＨＸ（潘慧新），Ｚｈｕｇｅ　Ｑ（诸葛强），ｅｔ　ａｌ．
２００２．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃａｓ－
ｔａｎｏｐｓｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉｉ　ｂｙ　ＲＡＰＤｓ（栲树天然群体遗传结构的ＲＡＰＤ
分析）［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｏｔ　Ｓｉｎ（植物学报），４４（１１）：１　３２１－１　３２６
４５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３２卷
图版Ⅰ　扫描电镜下栲树叶表皮照片　１，２．７０℃恒温２４ｈ及超声波震荡２ｈ后栲树叶片下表皮照片；３，４．离析液（１０％铬酸∶１０％硝
酸＝１∶１）进行表皮剥离后栲树叶片下表皮照片；５，６．分别为７０℃恒温５ｈ及超声波震荡１０ｍｉｎ，７０℃恒温１０ｈ及超声波震荡３０ｍｉｎ后栲树
叶片下表皮照片；７，８．未经处理的叶片下表皮照片。
ＰｌａｔｅⅠ　Ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｏｆ　Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ　ｆａｒｇｅｓｉｉ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　１，２．Ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｈｅａｔ－
ｉｎｇ　ｆｏｒ　２４ｈａｔ　７０℃ａｎｄ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｆｏｒ　２ｈｉｎ　ａ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｗａｖｅ　ｂａｔｈ；３，４．Ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０％ｃｈｒｏｍｉｃ　ａｃｉｄ∶１０％Ｎｉｔｒｉｃ
ａｃｉｄ＝１∶１）；５，６．Ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｆｏｒ　５ｈａｔ　７０℃ａｎｄ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｆｏｒ　１０ｍｉｎ，ａｎｄ　ｈｅａｔｉｎｇ　ｆｏｒ　１０ｈａｔ　７０℃ａｎｄ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｆｏｒ　３０ｍｉｎ，ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；７，８．Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ｌｅａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ．
５５１期　　　　　　　　　 　　　　胡华强等：栲树叶片ＳＥＭ样品制备