全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Nov．２０１４,３４(６):７４２－７４６　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０６．００３
杨春生,卢永彬,林燕芳,等．广西毛竹种质资源AFLP分析[J]．广西植物,２０１４,３４(６):７４２－７４６
YangCS,LuYB,LinYF,etal．AFLPanalysisofgeneticrelationshipsamongPhyllostachysedulisgermplasmresourceinGuangxi[J]．Guihaia,２０１４,
３４(６):７４２－７４６
广西毛竹种质资源AFLP分析
杨春生１,卢永彬２,林燕芳２,唐绍清２,周海平３,李晓铁３∗
(１．广西桂林市森林病虫害防治检疫站,广西 桂林５４１００１;２．广西师范大学生命科学学院、珍稀濒危动植物生态与
环境保护省部共建教育部重点实验室,广西 桂林５４１００４;３．广西桂林市林业科学研究所,广西 桂林５４１００４)
摘　要:采用扩增片段长度多态性分子标记方法,对收集于广西的１１个种源３３份毛竹种质进行了分析.结
果表明:５对引物组合用于选择性扩增,共得到１９８条扩增带,其中多态性带４７条(２３．７４％);１１个毛竹种源间
的亲缘关系较近,但仍存在着一定的遗传变异,它们之间的遗传距离D在０．０００６~０．１３６９之间;UPGMA聚
类分析,可将供试的１１个毛竹种源分为４大类,其中昭平种源和南丹种源各为一类,与其它两类较易区分.
PCA分析结果与聚类分析结果相一致;Mantel检验结果表明毛竹各种源遗传距离与地理距离间相关性显著
(r＝０．５５５８,P＝０．０１６０).说明AFLP分子标记能将１１个种源３３份毛竹种质区分开,是毛竹种质资源鉴别
的有效手段和方法.
关键词:毛竹;种质资源;遗传关系;AFLP
中图分类号:Q９４９;S７９５　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０６Ｇ０７４２Ｇ０６
AFLPanalysisofgeneticrelationshipsamong
PhylostachysedulisgermplasmresourceinGuangxi
YANGChunＧSheng１,LUYongＧBin２,LINYanＧFang２,
TANGShaoＧQing２,ZHOUHaiＧPing３,LIXiaoＧTie３∗
(１．GuilinQuarantineOfficeforPreventingandControllingtheForestdiseasesandInsectPests,Guilin５４１００４,China;
２．MinistryofEducationKeyLaboratoryforEcologyofRareandEndangeredSpeciesandEnvironmental
Protection,CollegeofLifeSciences,GuangxiNormalUniversity,Guilin５４１００４,China;
３．GuilinResearchInstituteofForestry,Guilin５４１００４,China)
Abstract:ThirtyＧthreePhyllostachysedulisgermplasmsfrom１１provenancesinGuangxiwereanalyzedbyAFLP
markers．FivepairsofprimercombinationwereusedtoamplifythegenomicDNA．Atotalof１９８AFLPbandswere
obtained,４７(２３．７４％)ofthemwerepolymorphic．Thegeneticdistancebetweenthe１１provenancerangedfrom
０．０００６to０．１３６９．Thetestedgemplasmscanbedividedinto４categoriesbyUPGMAclusteringanalysis．Nandan
andZhaopingprovenanceswereclusteredintotwocategoriesrespectively．Theyweredistincttoothertwocategories．
PCAanalysisresultswereconsistentwiththeresultsofclusteranalysis．ManteltestresultsshowedthatthecorrelaＧ
tionsbetweengeneticdistanceandgeographicdistanceinP．edulisprovenancesourcesweresignificant(r＝０．５５５８,
P＝０．５５５８),andAFLPwasaneffectivemarkertoidentifygermplasmofP．edulis．
Keywords:Phyllostachysedulis;germplasmresource;geneticrelationship;AFLP
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ１８　　修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ１２
基金项目:广西区林业重大项目(桂林科字[２０１０]第８号;桂林科字[２００９]第１８号);广西科技攻关项目(桂科攻１１２３００４Ｇ５);桂林市科技攻关项
目(２０１００５０９).
作者简介:杨春生(１９６５Ｇ),男,广西恭城县人,高级工程师,主要从事毛竹种质资源研究,(EＧmail)glsfycs＠１６３．com.
∗通讯作者:李晓铁,教授级高级工程师,主要从事森林资源培育和技术推广工作,(EＧmail)lixiaotie１６８＠１２６．com.
　　毛竹(Phyllostachysedulis)属于禾本科(GraＧ
mineae)竹亚科 (Bambusoideae).毛竹材质好,用
途广,是最重要的经济竹种.在中国１９个省具有毛
竹的天然分布和人工栽培,共有３８６．８３万公顷(国
家林业局森林资源管理司,２０１０).广西的毛竹种植
面积２０万公顷以上,仅桂林市达到１２．９万公顷(桂
林市林业局,桂林市森林资源调查报告,２００９).由
于毛竹的栽培面积大,在长期的生产经营活动中产
生了一系列稳定的变异类型,目前报道的变型或栽
培型毛竹共有１２个(郭小勤等,２００９).在形态学
上,毛竹壁厚和生长高度遗传相对稳定(郭起荣等,
２００３),但毛竹不同种源的发笋数、鲜笋产量和质量、
新竹生长以及抗性等存在明显差异,且各种性状之
间往往相互影响与联系(陈存及等,２００１).毛竹以
无性繁育为主,相近品系间常因形态相似而难于区
分,要准确、细致地了解种群的遗传变异状况,仅仅
依赖表型性状是远远不够的,还必须进行更深层次
的区分差异(夏铭,１９９９).分子标记可以在 DNA
水平上对种群、种源进行遗传变异的分析,目前
RAPD、ISSR、SRAP、AFLP和SSR等分子标记已
经被应用于毛竹种群间分化、种质鉴别和种源内的
遗传多样性等分析(魏瑜,２００５;阮晓赛等,２００８;郭
起荣等,２０１０).
限制性扩增片段长度多态性(AFLP,amplified
fragmentlengthpolymorphism)是 在 RFLP 和
RAPD的基础上发展起来的一种分子标记方法,其
具有较高的可靠性、重复性和高效性,几乎可以检测
到整个基因组的遗传信息(房经贵等,２００１).我们
应用 AFLP分子标记分析了桂林市林业科学研究
所收集的１１个种源３３份毛竹种质样品,目的在于
研究分析其遗传关系,为毛竹种质资源的保存和利
用提供依据.
１　材料与方法
１．１材料
供试的毛竹种源来自桂林市林业科学研究所
２０１０年毛竹种质收集圃,每个种源３个样品共３３
份,各种质的种源信息见表１.
１．２DNA的提取
采集毛竹新长出叶片,装入具有硅胶的自封袋
中干燥后放入Ｇ２０℃冰箱中,采用CTAB法(Doyle
etal．,１９８７)进行基因组DNA提取.
１．３AFLP分析
酶切采用２０μL体系:２μLDNA(纯化),１０U
EcoRI,４UMseI和４μL１０×Tangobuffer,３７℃
２h接着６５℃２h条件下完成.加入４μL１０×T４
DNAbuffer,１UT４DNALigase,５pmolEcoRI接
头,１５pmolMseI接头,４０μL体系在２２℃连接３
h.用PrimerＧEcoRIＧA和PrimerＧMseIＧC进行预扩
增.选择性扩增体系２０μL:２μL１０×Taqbuffer
(withMg２＋),０．４μL１×dNTPs,０．１μL５０μmol/L
PrimerＧMseI＋３,０．１μL５０μmol/LPrimerＧEcoR＋
３,０．２μLTaq酶 ,５μL预扩稀释液.选择性扩增
PCR程序:９４℃３０s,６５℃３０s,７２℃２min,以后
每个循环退火温度降低０．７℃,共１３个循环;然后
９４℃３０s,５６℃３０s,７２℃２min,２３个循环.６％
变性聚丙烯酰胺胶电泳分离,银染显色.
１．４数据分析
将电泳图谱上清晰的条带记为“１”,同一位置没
有出现的带记为“０”,生成由“１”和“０”组成的原始矩
阵.利用Popgene３２(Yehetal．,１９９９)软件分析种
源间遗传距离 D(Nei,１９７２).用NTSYSＧpc２．１０e
(Rohlfetal．,２０００)软件计算 DICE相似性系数
(Neietal．,１９７９),进行不加权成对算术平均法
(UPGMA)聚类分析和主成分(PCA)分析.利用
IBDWS３．２３(IsolationByDistanceWebService)
(Jensenetal．,２００５)中的 Manteltest检验地理距
离和遗传距离的相关性.
２　结果与分析
２．１种质多态性分析
从６４对引物组合中筛选５对引物(表２)用于
３３份广西毛竹种质进行分析,这５对引物共扩增出
了条带１９８条,其中多态性带为４７条,多态性位点
百分率为２３．７４％,平均每对引物产生条带３９．６条.
引物EcoRIＧAGG/MseIＧCTG扩增出的条带数最多
(４６条),引物EcoRIＧAAG/MseIＧCAA扩增到的条
带数最少(３６条).引物对EcoRIＧAAG/MseIＧCTG
扩增图谱见图１,从该图可看出某些种质有特异条
带或条带缺失.
２．２聚类分析和主成分坐标分析
１１个毛竹种源两两间的遗传距离 D(Nei’s,
１９７２)在０．０００６~０．１３６９之间(表３),平均遗传距
离是０．０７１９.其中资源县中峰乡八坊村(ZY)和兴
３４７６期　　　　　　　　　　　　 杨春生等:广西毛竹种质资源AFLP分析
表１　毛竹种源地理位置及形态性状
Table１　LocationofsampledPhyllostachysedulisprovenanceandtheircharacters
代号
Code
种源地点
Provenancesite
经度
Longitude
(E)
纬度
Latitude
(N)
海拔
Elevation
(m)
林分平均
立竹量
(株/亩)
Average
amount
ofbamboo
平均胸径
Average
DBH
(cm)
平均高
Average
height
(m)
平均枝下高
Average
clearheight
(m)
１１~１５
节长
Ziplength
(cm)
胸径９~１０cm
原竹６m高处
直径/竹壁
厚度
Diameterand
thickness(mm)
ND 南丹山口林场
ShankouForestfarm,NandanContury
１０７°３５′ ２４°５５′ ８９０ ２３３ １１．０ １４．５ ７．２ １１９．２ ６６/６．８
JX 金秀县忠良乡永和村
YongheVilage,ZhongliangTownship,
JinxiuContury
１１０°２２′ ２４°１０′ ６９０ ２９３ １０．１ １４．２ ８．０ １０７．９ ６２/５．４
RS 融水县香粉乡古都村
Gudu Vilage,Xiangfen Township,
RongshuiContury
１０９°１２′ ２５°１７′ ３２０ ２２７ １０．６ １３．６ ８．２ １３３．３ ６４/６．０
SJ 三江县和平乡大寨村
DazhaiVilage,HepingTownship,
SanjiangContury
１０９°３７′ ２５°３７′ ２４０ ２５５ ９．７ １２．７ ７．０ １２４．０ ６２/６．３
FC 富川县富阳乡涝溪村
LaoxiVilage,FuyangTownship,
FuchuanContury
１１１°１０′ ２４°４９′ ５４０ ２００ １０．６ １５．４ ７．６ １２９．６ ６２/６．２
ZP 昭平县文桥镇纸社村
ZhisheVilage,WenqiaoTown,
ZhaopingContury
１１０°４６′ ２４°１３′ １６０ ３６０ １０．５ １５．９ ９．３ １５５．７ ６５/６．３
XA 兴安县华江乡同仁村
TongrenVilage,HuajiangTownship,
XinganContury
１１０°２２′ ２５°３５′ ３４０ ２５３ １０．６ １５．２ ７．７ １１８．５ ６１/６．２
ZY 资源县中峰乡八坊村
BafangVilage,ZhongfengTownship,
ZiyuanContury
１１０°３８′ ２５°５１′ ４２０ ２８６ １１．０ １４．９ ８．２ １２４．５ ６５/６．３
LG 临桂县宛田乡洞头村
DongtouVilage,WantianTownship,
LinguiContury
１１０°０５′ ２５°３７′ ４２０ ２８０ １１．６ １６．２ ９．２ １３４．５ ６６/６．２
GC 恭城县西岭乡营盘村
Yingpan Vilage,Xiling Township,
GongchengContury
１１０°４０′ ２５°０５′ ３８０ ２２０ ９．６ １２．６ ７．２ １２４．４ ６０/６．１
LC 灵川县大境乡新寨村
Xinzhai Vilage,Dajing Township,
LingchuanContury
１１０°４３′ ２５°１２′ ８６０ ２１０ ９．４ １３．４ ６．６ １２８．４ ６２/６．０
表２　AFLP选择性扩增引物组合及扩增结果
Table２　Primercombinationandpolymorphism
resultsforAFLPanalysis
引物组合
Primercombination
扩增总
条带数
Totalnumber
ofbands
多态性
条带数
Numberof
polymorphic
bands
多态性
百分率
Percentageof
polymorphic
bands(％)
EcoRIＧAAG/MseIＧCTG ４１ １８ ４３．９０
EcoRIＧAAG/MseIＧCTA ３８ ７ １８．４２
EcoRIＧAGG/MseIＧCTG ４６ １４ ３０．４３
EcoRIＧACG/MseIＧCAT ３７ ７ １８．９２
EcoRIＧAAG/MseIＧCAA ３６ １ ２．７８
总和　Total １９８ ４７ ２３．７
平均　Average ３９．６ ９．４ —
安县华江乡同仁村(XA)毛竹种质之间的遗传距离最
小(０．０００６).昭平县文桥镇纸社村(ZP)和灵川县大
境乡新寨村(LC)之间的遗传距离最大(０．１３６９).
３３份毛竹种质之间的DICE相似性系数的变异
范围在０．９１８３~１．００００之间,UPGMA聚类结果可
将它们分为４类(图２).第I类只有南丹山口林场
(ND)毛竹,与其它种质遗传差异较大.第II类包括
金秀县忠良乡永和村(JX)、融水县香粉乡古都村
(RS)、三江县和平乡大寨村(SJ)、临桂县宛田乡洞头
村(LG)、兴安县华江乡同仁村(XA)和资源县中峰乡
八坊村(ZY).第III类为富川县富阳乡涝溪村(FC)、
恭城县西岭乡营盘村(GC)和灵川县大境乡新寨村
(LC),第III与第II类的遗传差异相对较小.第IV
只有昭平县文桥镇纸社村(ZP),它与其它３类的遗传
差异较大.
３３份毛竹主成分分析结果见图３,南丹山口林场
(ND)和昭平县文桥镇纸社村(ZP)的空间距离是最
远,各自为一类,与其它样品相比也极易区分.其它
２７份毛竹样品可以分为２类,但它们的空间距离较
近,难以区分.主成分分析结果与 UPGMA聚类分
析结果是一致的.
２．３相关性检验
对各种源地理距离与遗传距离相关性进行ManＧ
４４７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
表３　１１个种源遗传距离
Table３　Geneticdistancesof１１provenances
ND JX RS SJ FC ZP XA ZY LG GC LC
ND ∗∗∗∗∗
JX ０．１０７６ ∗∗∗∗∗
RS ０．１０７１ ０．００６２ ∗∗∗∗∗
SJ ０．１３０３ ０．０３９２ ０．０３１６ ∗∗∗∗∗
FC ０．１３２９ ０．０８３６ ０．０８９３ ０．０７７９ ∗∗∗∗∗
ZP ０．１１７５ ０．１２７９ ０．１３００ ０．１２８５ ０．１００６ ∗∗∗∗∗
XA ０．１１１６ ０．０２６２ ０．０３１５ ０．０２１７ ０．０５５８ ０．１１９１ ∗∗∗∗∗
ZY ０．１１２４ ０．０２６８ ０．０３２１ ０．０２１２ ０．０５５３ ０．１１９９ ０．０００６ ∗∗∗∗∗
LG ０．１１９０ ０．０３６６ ０．０４０７ ０．０１８２ ０．０６４１ ０．１１２５ ０．００７９ ０．００８５ ∗∗∗∗∗
GC ０．１０１１ ０．０７３２ ０．０７８８ ０．０６９９ ０．０３９９ ０．１１５１ ０．０４６９ ０．０４７５ ０．０５８７ ∗∗∗∗∗
LC ０．０９６０ ０．０８５５ ０．０８００ ０．０６９９ ０．０６１４ ０．１３６９ ０．０６８５ ０．０６９２ ０．０６５９ ０．０４２９ ∗∗∗∗∗
图１　３３份样品毛竹扩增产物的AFLP图谱
引物:EcoRIＧAAG/MseIＧCTG;箭头表示多态性条带.
Fig．１　AnAFLPfingerprintsof３３individuals　EcoRIＧ
AAG/MseIＧCTG;arrowsindicatethepolymorphicbands．
tel检验.图４结果显示,各种源地理距离与遗传距
离间呈显著的正相关性(r＝０．５５５８,P＝０．０１６０).
３　讨论与结论
研究种质资源多样性、遗传背景、遗传结构及亲
缘关系,可以为种质资源的保护开发提供依据,进而
制定出合理开发利用方案,这需要一种甚至多种可
图２　基于DICE相似性系数构建的UPGMA聚类分枝图
Fig．２　UPGMAphenogrambasedon
DICEsimilaritycoefficient
靠的、鉴别力强的分类鉴定手段(唐美琼等,２０１２).
本研究中采用AFLP标记,筛选出５对组合引物扩
增分析得到了清晰的AFLP图谱,可读出各样品的
共有条带、特异性带或特异性缺失条带,表明AFLP
标记是研究毛竹种质的有效方法之一,与阮晓赛等
(２００８)和李潞滨等(２００８)得出的 AFLP有较强的
分辨能力的结果一致.
张守锋等(２００７)应用RAPD标记对毛竹的研
究结果,１８个毛竹种群间遗传距离在０．０８０７~
０．５０３１之间;魏瑜(２００５)利用RAPD标记的研究结
５４７６期　　　　　　　　　　　　 杨春生等:广西毛竹种质资源AFLP分析
图３　基于DICE相似性系数构建的PCA坐标图
I类只含ND,II类包括JX、RS、SJ、LG、XA和ZY,
III类包括FC、GC和LC,IV类只含ZP.
Fig．３　PCAcoordinategraphsbasedon
DICEsimilaritycoeficient
图４　１１个毛竹种源的遗传距离与地理距离的线性关系
Fig．４　Plotofgeographicaldistanceagainstgeneticdistance
for１１provenancesofPhyllostachysedulis
果,毛竹种源间的遗传距离较小(０．００６４~０．０９５
３);阮晓赛等(２００８)利用 AFLP和ISSR标记研究
了１７个自然分布种源,它们的遗传距离在０．０２００~
０．１８２０之间,其平均值为０．０６７０;董文娟(２０１１)利
用SSR标记研究１７个毛竹种源,其遗传距离介于
０．００００~０．７５４０ 之间;郭起荣等 (２０１０)利用
SRAP、AFLP和ISSR标记分析毛竹种质,发现不
同的分子标记得出的遗传距离存在较大差距.本研
究利用AFLP分子标记对广西１１个毛竹种源毛竹
的研究结果,种源间的遗传距离在０．０００６~０．１３６９
之间,与以上研究结果相比较,广西毛竹种间的遗传
变异程度较小.
通过聚类分析和主成分分析,结果可将１１个种
源分为４类:地理距离较远的南丹山口林场(ND)和
昭平县文桥镇纸社村(ZP)毛竹各自为类,两者与其
它种源种质区分明显;而另外９个种源可分为２类,
但各种源种质间的遗传距离相对较小.２０１０－２０１２
年,我们对广西各毛竹地理种质进行了全面的形态
性状调查分析,结果表明,昭平县文桥镇纸社村分布
的毛竹种质资源的平均立竹量、竹高、枝下高和节长
均较大,与其它栽培地的毛竹种源种质的形态特征
相比具有明显差异.遗传分析结果显示昭平毛竹种
源与其它种源的遗传距离在０．１００６~０．１３６９之间,
其平均值(０．１２０８)远高于所有种源的平均遗传距
离(０．０７１９).但各种源地区的气象因子也会影响
种源种质的分布和生长(施建敏等,２００７),其中气温
主要决定毛竹分布,湿度、雨量主要决定毛竹生长
(刘世东等,１９９２),昭平毛竹种源种质形态学上的差
异性,可能是遗传因素与栽培地的生境因子共同作
用的结果,也有可能是从外省引种而来,这个问题还
需要考证.聚类结果和PCA分析结果体现出了一
定的地域特征,一般同一种源的各种质最先聚合在
一起,较近种源先聚集,但也未完全按分布的地理位
置进行先后聚类.毛竹是以无性繁殖为主的植物,
传统的栽培方式主要是移竹造林,人们常从较近距
离的种源移植,因此较近的地理种源间往往有较近
的遗传关系,但也有可能有较远距离的移植.各种
源间地理距离与遗传距离相关性 Mantel检测结果
进一步说明了这种关系,种源间地理距离与遗传距
离具有显著的相关性(r＝０．５５５８,P＝０．０１６０).
参考文献:
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６４７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷