全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７０９－７１４　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０６０２４
魏树强,钱永强,刘俊祥,等．多年生黑麦草再生体系的建立[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７０９－７１４
WeiSQ,QianYQ,LiuJX,etal．EstablishmentoftissueregenerationsystemofLoliumperenne[J]．Guihaia,２０１５,３５(５):７０９－７１４
多年生黑麦草再生体系的建立
魏树强,钱永强,刘俊祥,孙振元∗
(中国林业科学研究院 林业研究所/国家林业局林木培育重点实验室,北京１０００９１)
摘　要:以多年生黑麦草‘高帽２号’(Loliumperenne‘TopHat２’)颖果为外植体,分别研究了胚端半粒颖
果、纵切的胚端半粒颖果、胚端颖果小块、颖果小块这四种外植体处理方式与氯化汞、次氯酸钠两种表面灭菌
方法对其愈伤组诱导的影响;利用两因素(２,４ＧD和６ＧBA)随机区组试验设计研究了不同植物生长调节物质及
其浓度配比对外植体愈伤组织诱导的影响;利用三因素(NAA,６ＧBA和ZT)四水平正交试验设计研究了不同
植物生长调节物质及其浓度配比对不定芽诱导的影响;研究了０．１０mg􀅰LＧ１的NAA和IBA分别对不定根诱
导的影响.结果表明:相同条件下,以饱满胚端半粒颖果为外植体,７５％酒精表面灭菌１min后,再用含
１mL􀅰LＧ１Tween２０的次氯酸钠溶液(有效氯含量＞１０％)处理３０min,愈伤组织诱导率最高;适宜的愈伤组
织诱导培养基为 MS＋５mg􀅰LＧ１２,４ＧD＋０．０３mg􀅰LＧ１６ＧBA(pH＝５．８),诱导率达６８．７％,获得的高质量愈伤
组织;不定芽诱导培养基为 MS＋０．５mg􀅰LＧ１NAA、０．５mg􀅰 LＧ１６ＧBA ＋０．９mg􀅰LＧ１ZT,不定芽诱导率最
高,为５６％;不定根诱导培养基为１/２MS＋IBA培养基时,根系粗壮,诱导生根率为９０％.该研究建立了多年
生黑麦草高效组培再生体系,为高效基因工程育种的开展奠定了良好基础.
关键词:多年生黑麦草;组织培养;外植体;诱导;再生
中图分类号:Q９４３．１,S６８８．４　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７０９Ｇ０６
EstablishmentoftissueregenerationsystemofLoliumperenne
WEIShuＧQiang,QIANYongＧQiang,LIUJunＧXiang,SUNZhenＧYuan∗
(ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry/KeyLaboratoryofTreeBreeding
andCultivation,StateForestryAdministration,Beijing１０００９１,China)
Abstract:Thecaryopsisofperennialryegrass(Loliumperenne)cultivar‘TopHat２’wasusedasexplants．Firstly,
thispaperfocusedontheefectoffourwaysofexplantstreatments(embryoendhalfacaryopsis,slittingembryoend
halfacaryopsis,smalpiecesofembryoendforcaryopsis,smalpiecesofcaryopsis)andtwowaysofsurfacesteriliＧ
zationmethods(disinfectionwithsodiumhypochloritesolution,disinfectionwithmercuricchloride)oncalusinducＧ
tion;Secondly,westudiedtheefectsofdiferentplantgrowthregulators(２,４ＧDand６ＧBA)andtheirconcentrations
oncalusinductionbyrandomizedblockdesignoftwofactors;Thirdly,westudiedtheefectsofdiferentplant
growthregulators(NAA,６ＧBAandZT)andtheirconcentrationsonadventitiousbuddiferentiationbyorthogonal
testofthreefactorsandfourlevels;Atlast,weseparatelystudiedtheefectsof０．１０mg􀅰LＧ１NAAandIBAonadＧ
ventitiousrootinduction．Theresultswereasfolows:Underthesameconditions,explantsoffulendhalfacaryopＧ
sisembryosweresurfacesterilizedwith７５％alcoholfor１min,thentreatedwithsodiumhypochloritesolution
１mL􀅰LＧ１Tween２０(thechlorinecontent＞１０％)for３０min,therateofcalusinductionwerebetterthanthe
other’s;TheexplantsinoculatedonMSmediumwith５mg􀅰LＧ１２,４ＧDand０．０３mg􀅰LＧ１６ＧBA(pH＝５．８),providＧ
收稿日期:２０１４Ｇ０９Ｇ１８　　修回日期:２０１４Ｇ１２Ｇ１３
基金项目:国家“８６３”项目(２０１１AA１００２０９０２)
作者简介:魏树强(１９８３Ｇ),男,山东临沂人,博士研究生,主要从事园林植物抗逆分子育种工作,(EＧmail)weishuqiang２００８＠１６３．com.
∗通讯作者:孙振元,研究员,博士生导师,主要从事树木生理生态与园林植物分子育种等研究,(EＧmail)sunzy＠２６３．net.
edusarelativelyhighinductionrateof６８．７％andhighqualitycalus;Themosthighdiferentiationratewas５６％
whenadventitiousbudswereinoculatedinMSwith０．５mg􀅰LＧ１NAA,０．５mg􀅰LＧ１６ＧBAand０．９mg􀅰LＧ１ZT．The
bestrootingmediumwas１/２MS＋IBAwithnothingplantgrowthregulatorobtainingstoutroot,thentheregeneraＧ
tionratewas９０％．Thispaperhasestablishedeficienttissuecultureregenerationsystemforperennialryegrassand
laidagoodfoundationforconductinghighlyeficientgeneticengineering．
Keywords:Loliumperenne;tissueculture;explants;induction;regeneration
　　多年生黑麦草(Loliumperenne)是一种丛生型
多年生禾本科冷季型草坪草,其根系发达,分蘖力
强,地上生物量大,成坪速度快,生态适应性强(马博
英,２０１０),是困难立地草坪建立的先锋草种,在我国
南北方应用非常广泛,是城市绿化和运动场建设中
不可或缺的植被材料.近年来,受镉等重金属污染
的土壤面积急剧扩大,且污染程度日趋严重,选择重
金属高富集植物材料应用于污染土壤生物修复越来
越受到关注.多年生黑麦草对镉等重金属具有较强
的富集能力(刘俊祥等,２０１３),且可通过多次刈割实
现对重金属的转移,大大提高对污染土壤的修复效
率,极具开发应用潜力.结合基因工程等现代生物
技术培育镉等重金属高富集的多抗多年生黑麦草新
品种,对丰富重金属污染土壤修复植物材料、提高修
复效率具有重要意义.
建立高效组培再生体系,搭建有效的转化平台,
是实现多年生黑麦草转基因定向育种的重要途径.
迄今,有关多年生黑麦草再生体系建立方面已有研
究(冯霞等,２００４;陈季琴等,２００４;杜雪玲等,２００５;
李雪等,２００５;蔡能等,２００７;徐远东等,２００８),但主
要针对愈伤组织诱导或分化等几个关键环节影响因
素筛选与优化,仍存在胚性愈伤组织诱导率低,植株
再生效率不高等问题.基于此,本研究从外植体的
处理与消毒、愈伤组织诱导、分化和生根这一完整过
程来建立多年生黑麦草高效再生体系,为开展高效
基因工程育种,培育镉高富集植物新材料奠定良好
的基础.
１　材料与方法
１．１实验材料
多年生黑麦草栽培品种‘高帽２号’.
１．２方法
１．２．１外植体类型与表面灭菌方法　外植体类型:
Ⅰ:胚端半粒颖果;Ⅱ:纵切的胚端半粒颖果.胚端
半粒颖果经表面灭菌后,在超净台内无菌滤纸上被
纵切;Ⅲ:胚端颖果小块.胚端半粒颖果经表面灭菌
后,在超净台内无菌滤纸上被切成大小均匀的小块;
Ⅳ:颖果小块.颖果经表面灭菌后,在超净台内无菌
滤纸上被切成大小均匀的小块.
外植体类型的筛选试验利用次氯酸钠进行表面
灭菌,且选取愈伤组织诱导率最高和质量最好的前
两种外植体类型进行表面灭菌方法的筛选.
表面灭菌方法:氯化汞处理:外植体＋７５％酒精
１min,０．１％氯化汞处理的１５min;次氯酸钠处理:
外植体＋７５％酒精１min,１mL􀅰LＧ１的Tween２０＋
次氯酸钠溶液(有效氯含量大于１０％),３０min后,
在超净台内将胚端半粒颖果纵切.最后均用无菌水
冲洗５次.每个处理３个重复(d＝９０mm,培养
皿),每个重复５０个外植体.愈伤组织的诱导与分
化每个处理重复数和外植体数量均相同.
１．２．２愈伤组织的诱导　随机区组实验设计.设置
不同的２,４ＧD(２,４Ｇ二氯苯氧基乙酸)浓度(３、４、５、
６、７mg􀅰LＧ１)和６ＧBA(６Ｇ苄氨基腺嘌呤)浓度(０、
０．０３、０．１、０．３、０．６、１．０mg􀅰LＧ１),共３０个处理.
１．２．３不定芽的诱导　采用L１６(４３)正交表设计三因
素四水平正交实验(表１),NAA(萘乙酸)浓度为０、
０．３０、０．５０、１．００mg􀅰LＧ１,６ＧBA 浓度为０、０．５０、
１．００、２．００mg􀅰LＧ１,ZT(玉米素)浓度为０、０．３０、
０．６０、０．９０mg􀅰LＧ１,共１６个处理.
表１　L１６(４３)正交实验设计
Table１　OrthogonaldesignofL１６(４３)
试验号
TestNo．
植物生长调节物质
(Plantgrowthregulator)
NAA
(mg􀅰LＧ１)
６ＧBA
(mg􀅰LＧ１)
ZT
(mg􀅰LＧ１)
１ ０ ０ ０
２ ０．３０ ０．５０ ０．３０
３ ０．５０ １．００ ０．６０
４ １．００ ２．００ ０．９０
１．２．４不定芽的生根诱导　生根培养基设３个处理,
分别为１/２MS (MurashigeandSkoog)培养基、
１/２MS培养基＋０．１０mg􀅰LＧ１NAA、１/２MS培养基
＋０．１０mg􀅰LＧ１IBA(吲哚丁酸).每处理外植体为
１０个,共５个重复.接种后第３０天,观察并记录不
０１７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
定芽的生根情况.
１．２．５培养条件　各阶段所用基本培养基均以 MS
为基础,附加蔗糖３０g􀅰LＧ１和琼脂８g􀅰LＧ１,添加不
同种类和浓度的植物生长调节物质,pH６．０.外植
体处理与表面灭菌方法筛选试验所用培养基为在基
础培养基中添加最终浓度为４mg􀅰LＧ１２,４ＧD和
０．１mg􀅰LＧ１６ＧBA.继代培养基中植物生长调节物
质植物生长调节物质组成与愈伤组织诱导培养基相
同,其中６ＧBA浓度不变,２,４ＧD浓度减半,添加甘露
醇２５g􀅰LＧ１.培养室温度为２５℃,相对湿度为
６０％.愈伤组织的诱导与继代阶段均为完全黑暗培
养,分化阶段为光照培养,光照强度为２０００~３０００
１x,光照周期为１４h/d.
１．２．６统计与分析　(１)统计方法:愈伤诱导率＝(出
愈数/外植体数)×１００％;不定芽诱导率＝(产生不
定芽的愈伤组织数量/愈伤组织数量)×１００％;诱导
生根率＝[(生根苗数/再生苗数)×１００％].(２)分
析方法:利用Excel２００７进行数据整理、标准差的
计算,利用SPSS１３．０进行方差分析和Duncan多重
对比(P＜０．０５与P＜０．０１).
２　结果与分析
２．１外植体的类型与表面灭菌法对愈伤组织诱导的
影响
２．１．１外植体类型对愈伤组织诱导率的影响　经次
氯酸钠处理后的胚端半粒颖果、纵切的胚端半粒颖
果、胚端颖果小块、颖果小块这四类外植体中,胚端
半粒颖果的愈伤组织诱导率最高,为６０％,它与其
他三类外植体在愈伤组织诱导率上的差异均达到显
著性水平(图１),获得了致密、淡黄色愈伤组织.
２．１．２外植体不同表面灭菌法对愈伤组织诱导率的
影响　图２显示,无论是以胚端半粒颖果,还是以纵
切的胚端半粒颖果为外植体,次氯酸钠处理下外植
体的愈伤组织诱导率均高氯化汞处理下的外植体,
而且差异达显著水平(P＜０．０１),所以下面的实验
均采用次氯酸钠进行外植体的表面灭菌处理.
２．２２,４ＧD和６ＧBA对外植体愈伤组织诱导的影响
以多年生黑麦草饱满胚端半粒颖果为外植体
(图３:A),进行愈伤组织诱导(表２).表２表明,２,
４ＧD对愈伤组织诱导率的影响均达到了极显著性水
平,但两者的交互效应的影响未达到显著性水平.
当２,４ＧD浓度为５．００mg􀅰LＧ１时有最大平均愈伤组
图１　多年生黑麦草外植体处理方式对其愈伤组织诱
导的影响　１．胚端半粒颖果;２．纵切的胚端半粒颖果;３．胚
端颖果小块;４．颖果小块.不同的大写字母和小写字母分别表
示在P＜０．０１和P＜０．０５水平差异显著.
Fig．１　Efectsofdiferenttreatmentwaysofexplantsto
calusinductionforperennialryegrass　１．Embryoendof
halfcaryopsis;２．Slittingembryoendofhalfcaryopsis;３．Smal
piecesofembryoendforcaryopsis;４．Smalpiecesofcaryopsis．DifＧ
ferentlittleandcapitallettersmeansignificantdiferencesatP＜
０．０５andP＜０．０１level,respectively．
图２　不同外植体表面灭菌方法对多年生黑麦草愈伤
组织诱导率的影响　１．胚端半粒颖果(氯化汞消毒处理);
２．胚端半粒颖果(次氯酸钠消毒处理);３．纵切的胚端半粒颖果
(氯化汞消毒处理);４．纵切的胚端半粒颖果(次氯酸钠消毒处
理).不同的大写字母和小写字母分别表示在P＜０．０１和P＜
０．０５水平差异显著.
Fig．２　Efectsofdiferentwaysofsurfacesterilizationto
calasinductionpercentageforexplantsofperennial
ryegrass　１．Embryoendofhalfcaryopsis(Disinfectionwith
HgCl２);２．Embryoendofhalfcaryopsis (Disinfection with
NaClO);３．Slittingembryoendofhalfcaryopsis(Disinfectionwith
HgCl２);４．Slittingembryoendofhalfcaryopsis(Disinfectionwith
NaClO)．Diferentsmal and capitalletters mean significant
diferencesatP＜０．０５andP＜０．０１levels,respectively．
织诱导率;当６ＧBA浓度为０．００mg􀅰LＧ１时有最大
平均愈伤组织诱导率(表３),但在此浓度水平下所
诱导所得的愈伤组织质量不高.因此愈伤组织诱导
１１７５期　　　　　　　　　　　　魏树强等:多年生黑麦草再生体系的建立
图３　多年生黑麦草外植体与愈伤组织、不定芽、不定根的诱导　A．外植体;B．愈伤组织诱导获得的淡黄的、致密愈伤组织;
C．诱导获得的不定芽;D．多年生黑麦草的再生植株.
Fig．３　Explantsofperennialryegrassanditscalusinduction,diferentiationandregeneration　A．Explants;B．Dense,yelowishcalus
obtainingfromcalusinduction;C．Adventitiousbudsobtainingfrominductionofadventitiousbuds;D．Regenerationplantofperennialryegrass．
表２　２,４ＧD、６ＧBA两因素随机区组实验方差分析表
Table２　TwoＧfactorrandomizedblockexperiment
analysisofvariancetablefor２,４ＧDand６ＧBA
变因
Variable
平方和
SS
自由度
Df
均方
MS F P
区组Block １７８５５３．１９８ １ １７８５５３．１９８４９３５．２０５ ０．００
处理 Treatment １６１１９．７４１ ２９ ５５５．８５３ １５．３６４ ０．００
２,４ＧD １６３６．９６３ ４ ４０９．２４１ １１．３１１ ０．００
６ＧBA １２６２５．８４０ ５ ２５２５．１６８ ６９．７９６ ０．００
NAA×６ＧBA ７４７．０３７ ２０ ３７．３５２ １．０３２ ０．４４
剩余RSS ２８２２．０００ ７８ ３６．１７９
表３　不同浓度水平下２,４ＧD、６ＧBA对愈伤
组织诱导率的显著性分析
Table３　Analysisofsignificantlevelsofcalusinduction
rateindifferentconcentrationlevelsfor２,４ＧDand６ＧBA
植物生长调节
物质种类
Typesofplant
growthregulators
浓度水平
Concentration
(mg􀅰LＧ１)
平均愈伤组织诱导率
Averagecalus
inductionrate
(％)
２,４ＧD ３．００ ３５．３３±３．３４Aa
４．００ ４１．００±１．００Bb
５．００ ４７．２２±７．８５Cd
６．００ ４５．２８±２．２６Cd
７．００ ４２．４４±３．００BCbc
６ＧBA ０．００ ５９．１３±２．００Ee
０．０３ ５３．００±１．５４Dd
０．１０ ４３．１３±１．５６Cc
０．３０ ３９．５３±２．０９Cc
０．５０ ３２．２７±１．５４Bb
０．７０ ２６．４７±１．２１Aa
　注:不同大写和小写字母分别表示在P＜０．０１和P＜０．０５水平差异显著.
　Note:DifferentsmalandcapitallettersmeansignificantdifferencesatP＜
０．０５andP＜０．０１level,respectively．
最佳植物生长调节物质组合为５．００mg􀅰LＧ１的２,４Ｇ
D和０．０３mg􀅰LＧ１的６ＧBA,获得淡黄色、致密的愈伤
组织(图３ＧB),此时愈伤组织诱导率为６８．７％.
２．３三种生长调节物质对愈伤组织不定芽诱导率的
影响
诱导的愈伤组织经两次继代培养,进行不定芽
的诱导实验(表４),表４显示,当NAA、６ＧBA、ZT浓
度分别为０．５０mg􀅰LＧ１、０．５０mg􀅰LＧ１、０．９０mg􀅰
LＧ１或者０．５０mg􀅰LＧ１、２．００mg􀅰LＧ１、０．３０mg􀅰LＧ１
时平均不定芽诱导率最大,为５６％(表４).
表４　L１６(４３)正交实验结果
Table４　OrthogonalexperimentresultsofL１６(４３)
试验号
Test
No．
NAA
(mg􀅰LＧ１)
６ＧBA
(mg􀅰LＧ１)
ZT
(mg􀅰LＧ１))
不定芽平均
诱导率
Averageshoot
inductionrate
(％)
１ ０ ０ ０ １１
２ ０ ０．５ ０．３ ２６
３ ０ １．０ ０．６ ２６
４ ０ ２．０ ０．９ ３６
５ ０．３ ０ ０．３ １６
６ ０．３ ０．５ ０ ６
７ ０．３ １．０ ０．９ １６
８ ０．３ ２．０ ０．６ １６
９ ０．５ ０ ０．６ ３６
１０ ０．５ ０．５ ０．９ ５６
１１ ０．５ １．０ ０ ４６
１２ ０．５ ２．０ ０．３ ５６
１３ １．０ ０ ０．９ １６
１４ １．０ ０．５ ０．６ ２６
１５ １．０ １．０ ０．３ １
１６ １．０ ２．０ ０ ２６
　　比较三种植物生长调节物质各浓度水平下的平
均分化率(表５)可知,NAA、６ＧBA、ZT各浓度水平
下的不定芽诱导率按极差大小排序分别为NAA、６Ｇ
BA与ZT,这说明NAA浓度水平对不定芽诱导率
影响最大;０．５ mg􀅰LＧ１的 NAA、０．５ mg􀅰LＧ１
的６ＧBA和０．９mg􀅰LＧ１的ZT下平均不定芽诱导率最
２１７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
表５　NAA、６ＧBA和ZT在四种浓度水平下
的平均不定芽诱导率
Table５　Averagediferentiationratefordventitiousbuds
atfourdiferentconcentrationlevelsofNAA,and６ＧBA
植物生长调节
物质种类
Typesofplant
growthregulators
浓度水平
Concentration
(mg􀅰LＧ１)
不定芽诱导率
Averageshoot
inductionrate
(％)
极差
Range
(％)
NAA ０ ２４．８ １１．３
０．３０ １３．５
０．５０ ４８．５
１．００ １７．３
６ＧBA ０ １９．８ ８．７
０．５０ ２８．５
１．００ ２２．３
２．００ ２３．５
ZT ０ ２２．３ ８．７
０．３０ ２４．８
０．６０ ２６．０
０．９０ ３１．０
图４　不同植物生长调节物质对不定芽的诱导生根率
的影响　不同的小写字母表示在P＜０．０５水平差异显著.
Fig．４　Efectsofdiferentplantgrowthregulatorson
therootinductionofadventitiousbuds　Diferentsmal
lettersmeansignificantdiferencesatP＜０．０５level．
大,结合表４实验结果可知,最佳植物生长调节物质
的浓度水平组合为０．５mg􀅰LＧ１的NAA、０．５mg􀅰
LＧ１的６ＧBA和０．９mg􀅰LＧ１的ZT.
２．４两种生长调节物质对不定芽诱导生根的影响
多年生黑麦草不定芽的生根诱导较容易,各培
养条件下其诱导生根率均在９０％以上(图４),其中
以不添加任何植物生长调节物质的１/２MS培养基
最高(P＞０．０５).调查过程还发现,植物生长调节
物质影响不定根生根质量,含IBA的诱导生根培养
基中小苗生有短粗根,含 NAA的生根培养基不定
根根系多但相对细弱,而不含植物生长调节物质的
培养基诱导产生的不定根数量较少、根系细弱.
不定芽转至生根培养基中１周后开始生根,３０
d即可完成生根过程,不定芽的诱导生根率均在
９０％以上.当再生植株高度大于６cm时,在玻璃温
室(温度２５℃,湿度７５％)中打开培养瓶,经过３~４
d炼苗后,将再生植株根部附着的培养基洗净并移
栽到基质(珍珠岩∶草炭土＝１∶１)中,用塑料膜覆
盖保湿１０d后,揭开塑料膜,成活率在９０％以上.
３　讨论与结论
３．１外植体表面灭菌方法和类型对愈伤组织诱导率
的影响
多年生黑麦草外植体表面灭菌常用的试剂有氯
化汞和次氯酸钠.氯化汞表面灭菌时间短,次氯酸
钠没有毒性,各具自己的特点.在本试验中,氯化汞
处理降低了愈伤组织诱导率,这可能是有毒汞离子
对植物造成了微量的毒害作用.
多年生黑麦草建立组织培养体系采用的外植体
有茎尖分生组织(Daleetal．,１９７７)、未成熟花序
(CreemersＧMolenaaretal．,１９８９)、成熟胚(林海,
２００５)、花药 (Olesenetal．,１９８８,Boppenmeier,
１９８９)、营养分生组织(PerezＧVicente,１９９３)、完整成
熟种子(Zengetal．,２００９)、成熟种子的一部分,包
括成熟胚、下胚轴、纵切的半粒成熟种子(杨茹等,
２００８)、含胚的半粒成熟种子(蔡能,２００７),也有采用
幼苗芽尖、根尖(杨茹,２００８)、幼穗、生长点(余斌,
２００９)等材料.然而,胚根、胚轴(陈季琴,２００５)、芽
尖、根尖(杨茹,２００８)不适合作为多年生黑麦草愈伤
诱导的外植体,李雪等(２００８)发现利用成熟胚作为
外植体时愈伤诱导率和胚性愈伤诱导率均要明显高
于成熟种子,但早有研究表明利用成熟种子做外植
体也能取得较高的愈伤组织诱导率(冯霞等,２００４).
直接用成熟种子做外植体愈伤组织诱导率相对较
低,将种子纵向切开后再进行接种可以增加愈伤诱
导率(Bradley,２００１),通过纵切、横切等手段可提高
愈伤组织诱导率,这可能是因为划破种皮,促进了对
植物生长调节物质的吸收(杨茹,２００８).
３．２不同生长调节物质对愈伤组织诱导和分化的影响
植物生长调节物质的种类与浓度在很大程度上
决定了愈伤组织的质量、诱导率与分化率.２,４ＧD
对禾本科植物愈伤组织诱导率和质量有显著影响,
愈伤组织诱导率在一定浓度范围内与２,４ＧD的浓度
３１７５期　　　　　　　　　　　　魏树强等:多年生黑麦草再生体系的建立
呈正相关(李蔚等,２０１２),但过高的浓度会降低愈伤
组织质量(麻冬梅等,２０１４),影响后期愈伤组织的分
化(杨茹,２００８),所以过高或过低的浓度都是不可行
的,本研究也发现了这一规律.
植物细胞分裂素作为植物生长调节物质能够直
接调控基因的活性、翻译与蛋白质的磷酸化.６ＧBA
作为一种高效的细胞分裂素,在已有２,４ＧD的诱导
培养基中加入少量的６ＧBA能对愈伤组织质量产生
积极的作用,高浓度的６ＧBA则会抑制愈伤组织诱
导,本研究中６ＧBA的浓度以０．１mg􀅰LＧ１佳,这与
杜雪玲(２００５)、杨茹等(２００８)的研究相同.
２,４ＧD由于强烈抑制芽的形成,因而在愈伤组
织分化培养中常用的生长素为NAA,细胞分裂素为
６ＧBA、ZT、KT(激动素)和TDZ(噻苯隆).NAA常
与细胞分裂素组合使用,０．３mg􀅰LＧ１的NAA和０．４
mg􀅰LＧ１的ZT组合使用时最高愈伤组织分化率可
达９０％(李雪,２００８).细胞分裂素既可以单独使
用,也可彼此间组合使用.单独使用１mg􀅰LＧ１的
６ＧBA最高愈伤组织诱导率可达８７．５％,０．３mg􀅰
LＧ１TDZ和０．７mg􀅰LＧ１６ＧBA组合使用愈伤组织分
化率最高为３１．７％.从总体上看,生长素与细胞分
裂素组合使用的效果要优于单独使用细胞分裂素,
低浓度的生长素和较高浓度的细胞分裂素的组合更
有利于愈伤组织的分化,这与本实验的结果相同.
３．３外源物质对多年生黑麦草不定芽生根的影响
多年生黑麦草组培苗的生根诱导较为容易
(Bradleyetal．,２００１;冯 霞 等,２００４;姜 素 云,
２００５;),但适宜植物生长调节物质种类和浓度对多
年生黑麦草不定芽生根诱导有着积极的影响.尽管
不同植物生长调节物质在诱导生根率方面差异不显
著,但在生根质量上有所不同,添加IBA的诱导生
根培养基中小苗生有短粗根,添加 NAA的根系虽
多但相对细弱,而不添加任何植物生长调节物质的
则根系数量较少、无短粗根出现(冯霞等,２００４).在
含０．１mg􀅰LＧ１IBA的１/２MS培养基中诱导率最
高,而IBA过高的浓度会抑制多年其生根诱导(姜
素云,２００５).此外,在生根诱导培养基中添加活性
碳,在生根速度、根的大小、状态方面可明显促进多
年生黑麦草不定根的生长(杨茹等,２００８).
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４１７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷