全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：261— 264 2010年 3月
拟南芥干旱胁迫诱导型启动子 RD29B驱动
， AtCKX1基因植物表达载体的构建
高喜乐，吴 国江，李美茹
(中国科学院 华南植物园，广州 510650)
摘 要：从拟南芥基因组中分别克隆 AtCKX1基因和 RD29B基因 5，_侧翼 1705 bp启动子区域序列 ，生物信
息学表明，AtCKX1含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和细胞 分裂素的结合 位点；RD29B启动子片段中存在
ABA响应元件(ABA response element；ABRE)、Myb结合位点、TATA-盒、CAAT一盒等顺式作用元件。分别
将AtCKX1和 RD29B插入载体 pCAMBIA1390，构建了由 RD29B驱动的AtCKX1的植物双元表达载体
p139ORD29BA￡CKX1。
关键词 ：RD29B启动子 ；AtCKX1；表达载体构建
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2010)02—0261-04
Construction of plant expression vector harboring
AtCKX1 driven by drought-inducible promoter
of RD29B from Arabidopsis
GAO Xi—Le，WU Guo-Jiang，LI Mei-Ru
(South China Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：In this study，the cloning of AtCKX1 and 5 一flanking promoter sequence of drOught_inducibje RD29B from
Arabidopsis was reported．The 1 705 bp promoter sequence was analyzed bioinformatieally in the database of plant
cis-acting regulatory element(PlantCARE)．The result showed that there were several important cis-acting ele—
ments，including ABRE (ABA response element)，Myb binding site，TATA —box，CAAT—box，in the 1705一bp promot—
er region．The binary vector harboring AtCKX1 driven by RD29B promoter was further constructed to be used in
coming plant transgene．
Key words：RD29B promoter；AtCKX1；expression vector construction
AtCKX1是拟南芥中编码细胞分裂素氧化酶／
脱 氢 酶 (Cytokinin oxidase／dehydrogenase；CKX；
EC 1．5．99．12)的基因。CKX是一类以黄素腺嘌呤
二核苷酸(FAD)为辅基 ，以氧或人工合成的电子受
体为氢受体 ，催化裂解 细胞 分裂 素或其核苷腺 嘌呤
C6位上 的侧链 ，生成腺 嘌呤或腺 苷和醛类化合物 ，
不可逆地降解细胞分裂 素的酶(Galuszka等，200l；
Frebirtiva等 ，2004；Kopecny等 ，2005)。该酶在调
控细胞内或整 株细胞分裂 素水 平 中起着重要 的作
用 ，是 研 究 细 胞 分 裂 素 生 物 学 功 能 的重 要 手 段
(Houba—Herin等，1999；Morris等 ，1999；Werner
等，2001，2003，2006)。RD29B为拟南芥脱水诱 导
基因，编码亲水蛋 白。RD29B基因启动子序列中含
有一些应答逆境 的特殊元件，如逆境激素 ABA 响
收稿日期：2008-05—15 修回日期 ：2009—04—22
基金项 目：广东省科技计划项目(20O6B2O2010o9)；广东省自然科学基金(07118251)[Supported by the Science and Technology of Guangdong Province
(2006B20201009)；the Natural Science Foundation of Guangdong Province(07118251)]
作者简介：高喜乐(1983一)，男，河南洛阳人，硕士生，研究方向为植物耐逆基因工程。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：limr@scbg．ac．cn)
262 广 西 植 物 3O卷
应元件 (Yamaguchi—Shinozaki& Shinozaki，1 993；
Nakashima等，2006)，该启动子是目前常用的逆境
诱导型启动子，指导靶基因在特定环境条件下表达
产生基因产物。
低温、干旱和盐碱是影响植物生长发育的主要
的非生物胁迫因子，培育耐逆作物是提高作物产量
的重要途径。植物在遭遇环境胁迫时，表现为延缓
或停止生长(戴开结等，2006；韩玉杰等，2007)，植物
延缓生长的目的可能是为了更好地储蓄物质和能
量，以抵御逆境(Achard等，2006)。植物延缓生长
可能与植物体内激素水平的改变(如降低细胞分裂
素水平)有关。干旱或热胁迫均有上调 CKX1表达
的作用(Werner等，2006)，胁迫下高水平 CKXI表
达是否是引起细胞内细胞分裂素水平下降的主要原
因，目前还不清楚。另一方面 ，超表达 AtCKX1的
植株均表现 了具有发 达的根系 (Werner等 ，200l，
2003)。一般而言，发达根系的植物比弱根系具有更
高抵抗营养、干旱胁迫的能力。超表达AtCKX1植
株是否意味着具有高抗逆性，目前还未见有这方面
的研究报道。综上所述 ，在逆境 时调控植物体内编
码 CKX基因的表达，提高根系的生长和进一步延
缓地上枝条的生长速率可能对提高植株的抗旱性有
着积极的作用。
本文构建了 RD29B启动子驱动的 AtCKX1基
因的植物双元表达载体，为研究 AtCKX1在逆境条
件下调控转基因株耐逆性中的作用 ，尔后利用该策
略改 良作物抗逆性积累了基础。
1 材料与方法
1．1植物材料
拟南芥 (Arabidopsis thaliana)生态 型 Columbia
种子为本实验室保存。种子消毒后接种于 1／2MS培
养基上 ，放在温度 22℃、光 照度为 150#mol·m ·
s 的培养箱中培养。1个月后，取叶片提取DNA。
1．2载体、工具酶、试剂盒及其来源
pCAMBIA1390载体和大肠杆菌 DH5a为本实
验室保存。pMD—T载体、限制性内切酶、Taq酶、
T4连接酶及相关试剂盒和试剂购自宝生物工程有
限公司。
1．3引物设计与合成
根据 AtCKX1基 因序列 (GeneBank Accession
No．NM
一 129714)设计一对特定引物，AtCKX1 F：5
ATT GGA TCC(BarnHI)ATG GGA TTG ACC
TCA TCC TTA CGG TTC C 3 ；AtCKX1 R：5
AAT GAA TTC(EcoRI)TTA TAC AGT TCT
AGG TTT CGG CAG 3 ；根据 RD29B启动子序列
(GeneBank Accession No．D13044)，设计一对引物，
PF：5 TTA GTC GAC(SalI)GCG GAA GCT
TCA TTT TCT GCT ACA G 3 ；PR：5 AAA
GGA TCC(BarnHI)TTT CCA AAG CTG TGT
TTT CTC TTT TTC 3 。引物合成委托广州英韦
创津生物科技有限公司。
1．4拟南芥基因组 DNA的提取
采用 CTAB方法(Muhammad等，1994)从拟南
芥叶片中提取总DNA。
1．5 AtCKX1基因和 RD29B启动子片段的克隆、检
测及测序
通过 PCR方法从拟南芥基因组 DNA分别扩增
AtCKX1基因和RD29B启动子片段。PCR反应条件
均为：94℃下变性 3 min，然后按 94℃ 30 S、55℃ 1
min、72℃ 2 min进行 35轮的循环反应 ，最后在 72℃
下延伸 10 min。取 10 L反应液，加入 1 L DNA上
样缓冲液，进行 1 琼脂糖凝胶电泳检测。将 PCR
产物分别克隆到 pMD 18-T载体上，通过 PCR检测
获得阳性克隆。阳性克隆送广州英韦创津生物科技
有限公司测序分析 ，获得 AtCKX1序列 和 RD29B
启动子序列。
蹦 I m BarnHI ~om(gw bp) 8~oRI
i 望 盟2婴! 照曼i !g } AtCiC(I犯235 l
m ／ 砌
i 二==二 ，』
图 1 植物表达载体 p1390RD29BAtCKX1构建的示意图
Fig．1 Construction map of plant expression
vector pl390RD29BAtCKXl
HygR：潮霉素基因；T：终止子。
I．6双元表达载体 的构建及检测
以 pCAMBIA1390为基本植 物表达载体 ，先将
AtCKX1引入载体中的 BamHI和 EcoRI位点。由于
AtCKX1序列的 934 bp处有一个 EcoRI位点(图 1)，
2期 高喜乐等：拟南芥干旱胁迫诱导型启动子 RD29B驱动AtCKX1基因植物表达载体的构建 263
采用分段的方法将 AtCKX1序 列完整插 入 BamHI
和 Ec0RI位点。首先用 BamHI和 EcDR1分别双酶切
质粒 pCAMBIAl390和 含有 AtCKXl片 段 的 pMD
l8一T(pMD 18一T-AtCKX1)，回 收 酶 切 片 段 ，将
AtCKX1部分片段(934 bp)与载体 pCAMBIAI390大
片段 连 接，构建 载 体 p1390AtCKX1934。随后采 用
EcoR1分别酶切该 载体和 pMD 18-T-AtCKX1，回收
目标片段后 ，将 AtCKX1部分片段 (1 301 bp)插入载
体 p1390AtCKX1934。通过 PCR方法选择正确插入
AtCKX1序 列 的 载 体 (p1390AtCKX1)。接 着 将
RD29B启动子序列插 入载体 p1390AtCKX1的 SalI
和BamHI位点之间，构建含 RD29B：AtCKX1融合
基因的植物表达载体 p1390RD29BAtCKX1(图 1)。
将该载体送广州 英韦创津 生物科 技有 限公司测序
分析。
2kb
1 kb
M 2
2．235kb
1．705kb
图 2 琼脂糖电泳检测 PCR扩增片段
Fig．2 Agrose gel of electrophoresis of PCR products
M：DL2000 marker；1：以 AtCKX F＼AtCKX R为引物的 PCR
扩增产物；2：以 PF＼PR为引物的PCR扩增产物。
2 结果与分析
2．1 AtCKX1和 RD29B基因启动子片段克隆与分析
以拟南芥基因组 DNA为模板 ，分别 以 AtCKX
F＼AtCKX R，PF＼PR 为引物进行 PCR扩增 ，分别
得到一个大片段 (>2 kb)和一个小片段 (> 1．5 kb)
(图 2)。将此二片段分别 回收后重组到 pMD 18一T
载体上(重组载体分别命名为 pMD 18一T—AtCKX1
和 pMD 18一T—RD29B)。测序结果经 BLAST分析
表明，大片段为 AtCKX1的 DNA 序 列，大小 2235
bp，该序列进一步经 NCBI保守结构域分析，发现有
二个结构域，一个为 FAD结合位点，另一个为细胞
分裂素结合位点；小片段为 RD29B的启动子片段，
大小为 1705 bp。将这 1705 bp序列在 国际植物顺
式作用元件数据库 PlantCARE中进行生物信息学
分析，搜 寻结 果 表 明 ，分 别 在该 启 动 子 序列一575—
579、一654-658、一l587-159l处有典型的 TATA—box；一
644—648、一1372一-1376处 有 典 型 的 CCAAT—box；一
1491—1497片有一 ABA 响应元件 ABRE，核心序列
为 ACGTGGC；一1472—1477处有 一 Myb结合位点，
核心序歹U为 CAACTG。
2．2 RD29B：AtC 1融合基因的构建
克隆的 AtCKX1序列经 BioEdit软件分析，发
现在 934 bp处有一个 EcoRI酶位点 (图 1)通过分
段的 方 法 将 AtCKX1序 列 完 整 插 入 pCAM—
BIA1390 的 BamHI和 EcoRI位 点 之 间。以
AtCKX1F 和 A CKX1R 为 引 物 对 含 有
pl390AtCKX1载体 的转化子进行 PCR检测 ，只有
正确连接的载体 ，才能扩增出特异的 AtCKX1的片
段 ，图 3 PCR实验 结 果表 明“1”是 含有 正确插 入
AtCKX1完全序列的载体(p1390AtCKX1)。
2k
图 3 PCR检测 p1390AtCKX1载体
Fig．3 Detection of p1390AtCKX1 by PCR using
AtCKX1 F and AtCKX1 R as primers
M ：x／Hind III marker；1：pl 390AtCKX1、 ector。
将 RD29B启动子片段插入 p1390AtCKX1载体
的 SnzI 和 BamHI 位 点 间，构 建 载 体
p1390RD29BAtCKX1。因在 AtCKX1DNA 的 934 bp
处有一个EcoRI位点，RD29B启动子片段长1705 bp，
用 SalI和 EcoRI双酶切 RD29BAtCKX1，可切 下三
个不 同大小的片段(图 1，图 4)：2 639 bp为 RD29B
启动子 1705 bp加上一段 AtCKX1(934 bp)，一段
A￡CKX1(1301 bp)和 pCAMBIA1390(8860 bp)，
说明该载体是含有 pl390RD29B：AtCKX1融合基
因的植 物 表达 载 体 。测 序 结 果 也 表 明连 接 完全
正确 。
264 广 西 植 物 3O卷
3 讨论
细胞分裂素在植物生长发育、形态建成、叶片衰
老、养分运输、细胞分裂、逆境响应等方面起着重要
的调控作用(Mok DW 6-Mok MC，2001)。细胞分
裂素氧化酶／脱氢酶是 目前 唯一发现的不可逆地降
解细胞分裂素、调控组织器官细胞分裂素水平的一
个重要酶 ，因此 ，该酶是研究细胞分裂素生物学功能
的重要工具 。该酶在植物 中含量很低 ，40 kg的玉
米粒才能制备微克水平的酶蛋白，酶活性具有组织
2．3kb
8．8kb
2．6kb
1．3kb
图 4 SalI和 EcoRI双酶切检测
pI390RD29BAtCKXI载体
Fig．4 Analysis of pl390RD29BAtCKXI by
double digestion with Sal I and Eco RI
M：X／Hind III marker；1：digested pl390AtCKX1。
特异性，其基因受发育调控 ，同时 ，受细胞分裂素、非
生物或生胁迫因子的诱导(Werner等 ，2006)。采用
非组成型启动子，使细胞分裂素氧化酶／脱氢酶基 因
在特定时期或组织部位中表达是研究和利用细胞分
裂素氧化酶／脱氢酶基因功能和基 因资源的重要手
段。拟南芥 RD29B基因的启动子被证明是干旱和
高盐诱 导型启 动子 (Yarnaguchi—Shinozaki& Shi—
nozaki，1993；Nakashima等，2006)，在逆境 时可驱
使靶基因的表达，有利于研究或发挥靶基因在逆境
条件下的作用，而避免大量的靶基因产物对正常生
长条件下转基因植物的负面影响。构建 RD29B启
动子驱动 的 AtCKX1基 因 的植 物双元 表达 载 体
p1390RD29BAtCKX1(图 4)，为研究在逆境条件 下
细胞分裂素氧化酶／脱氢酶基因在调控转基因株耐
逆性中的作用打下基础。
参考文献 ：
Aehard P，Cheng H，de Grauwe L，eta1．2006．Integration of plant
responses to environmentally activated phytohormonal signals
[J]．Science，311(5757)：91—94
Dai (戴开结)，He F(何方)，Shen Y)((沈有信)，et a1．2006．
Biomass and its alocation of Pinus yunnanensis seedlings under
phosphorus deficiency(低磷胁 迫下云南松幼苗的生物量及其
分配)[J]．Guihaia(广西植物)，26(2)：183—186
Fr6bortovd J，Fraaije MW，Galuszka P，et a1．2004．Catalytie reac‘
tions of cytokinin dehydrogenase preferences for quinines as e‘
lectron acceptorsrJ]．Biochem J，380(Pt1)：121—130
Galuszka P，Fr6bort I，Sebela M，et a1．2001．Cytokinin oxidase or
dehydrogenase mechanism of cytokinn degradation in cereals
EJ]．Eur J Biochem，268(2)：450-461
Han YJ(韩 玉杰 )，Xu ZF(徐 志 防)，Ye WH(叶 万辉 )，et a1．
2007．Characteristics of chlorophyl fluorescence and comparison
of drought resistance among different species of karst plants(不
同类型喀斯特植物 的荧光特 征及 抗旱性 比较)I-J]．Guihaia
(广西植物)，27(6)：918～922
Houba-Herin N，Pethe C，d’Alayer J，el a1．1999．Cytokinin oxi—
dase from Zea mays：purification．cDNA cloning and expression
in moss protoplastsrJ]．Plant J，17(6)：615—626
Kopeeny D，Pethe C，Sebela M ，et a1．2005．High—level expres—
sion and characterizati0n of Zea mays cytokinin oxidase／de-
hydrogenase in Yarrowia lipolytica[J]．Biochimie，87(1】)：
l 011— 1 O22
Mok DW，Mok MC．2001．Cytokinin metabolism and action~J-]．
AnnRev Plant Physiol Plant Mol Bid ，52：89— 118
Morris R0，Bilyeu KD，Laskey JG。et a1．1999．Isolation of a gene
encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize[J]．Bio—
themBiophys Res Cornmun，255(2)：328—333
M uhammad AL，Ye GN，W eeden NF，eta1．1994．A simple and efi—
cient method for DNA extraction from grapevine cultivars，V／tis
species and Ampelopsis[J3．Plant Mol Biol Rep，12(1)：6—13
Nakashima K，Fujita Y，Katsura K，et a1．2006．Transcriptional
regulation of ABI3一and ABA-responsive genes including RD29B
and RD29A in seeds．germinating embryos。and seedlings Of Ar—
abidopsis[J]．PlantMol Bio，60(1)：51—68
W erner T，Kollmer I，Bartrina 1。et a1．2006．New insights into the
biology of cytokinin degradation[J,]．Plant Biol，8(3)：37 2[-381
W erner T，M otyka V，Laucou V，et a1． 2003． Cytokinin-deficient
transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental al-
terations indicating opposite functions of cytokinins in the regu—
lation of shoot and rot meristem activity[J]．Plant Cel，15
(11)：2 532—2 550
W erner T，M otyka V ，Strnad M ，et a1． 2001． Regulation of
plant growth by cytokinin[J]．Proc Natl Acad Sci，98(18)：
10 487— 1O 492
Yamaguchi-Shinozaki K ，Shinozaki K． 1993． Characterization of
the expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabi—
dopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants
[J]．Mol Gen Genet，236(2—3)：331—340