全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(2)：164— 166 2008年 3月
冰冻切片法在植物微管骨架研究中的应用
张新成 ，李志刚 ，李素丽 ，林 丽 一，杨丽涛 ，李杨瑞2
(1．广西大学 农学院，南宁 530005；2．广西农业科学院，南宁 530007)
摘 要：介绍了冰冻切片法研究植物微管骨架的一般程序和技术上的一些改进 ，结果证明，改进的冰冻切片
技术，可以对植物不同类型的细胞进行很好的标记。实验结果表明，甘蔗正在迅速伸长的幼叶分布的微管类
型主要是与细胞伸长轴方向垂直的周质微管，幼叶基部尤其是第三幼叶基部分布的主要是与细胞伸长轴方向
平行的周质微管。表明冰冻切片法在植物微管骨架的研究中具有广阔的应用前景。
关键词：冰冻切片法；植物微管骨架；荧光显微镜；免疫荧光标记 ；甘蔗
中图分类号 ：Q944．66 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2008)02-0164-03
Cryosectioning method for the observation of
microtubule cytoskeleton in plant cells
ZHANG Xin-Cheng ，LI Zhi—Gang ，LI Su—Li ，
LIN LiI，一，YANG Li一，] 01，LI Yang-Rui2
(1．College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530005，China；2．Guangxi
Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China)
Abstract：Plant Microtubule cytoskeletons have long been known tO play a key role in plant morphogenesis．The gen—
eral procedures and some improvements of cryosectioning method for the plant microtubule were detailed here．After
fixation，microtubule arrays in various cells could be stained by using improved cryosection method．Transverse corti—
cal microtubules tO the axis of cells were the main microtubule arrays in the elongating young leaves，and longitudinal
arrays t0 the long axis of the cells in the primordium，especialy at the base of the third young leaf．The results indi—
cate that the cryosectioning method is useful for investigating plant microtubule cytoskeleton．
Key words：cryosectioning method；plant microtubule cytoskeleton；fluorescence microscopy Immunofluorescence
staining；sugarcane(Saccharum officinarum)
微管 (microtubule，MT)是真核生物细胞 中的
主要骨架成分之一，在植物的生长、发育等生命过程
中起非常重要 的作 用 (Cyr，1994)。微 管除具有支
持、胞内物质运输、参与有丝分裂活动外，还在植物
与环境、激素、病原菌等信号转导途径中发挥重要作
用(Liu& Lu，2000；Blancaflor等，2001；Genre&
Bonfante，2002；陈志玲等，2003)。因此，对植物细
胞微管骨架的研究已成为植物细胞生物学的一个重
要内容，而且研究内容也越来越深入。
Lloyd等(1979)和 Wick等(1981)最早建立了
整体细胞的免疫荧光标记方法，至今仍被许多研究
者采用 ，但是该方法主要适用于单细胞及幼嫩的组
织细胞微管的定位。后来，为了在组织水平上研究
微管骨架在不同类型细胞中的分布，出现了异丁烯
酸树脂包埋切片法、BMM半薄切片法、PEG切片法
和 Steedman’S wax切片法等(Gubler，1989；Baskin
等，l992；He等，2003；Liu等，2004)。这些方法由
于使用了包埋介质，往往对微管的抗原性有一定的
收稿 13期：2006—11-29 修回日期：2007—05—14
基金项目：国家自然科学基金(30060038)[Supported by the National Natural Science Foundation of china(30060038)]
作者简介：张新成(1979-)，男，河南通许人，硕士研究生，植物学专业，主要从事植物生理生化及结构植物学研究，(Bnlail)zhang】dnch∞gI1y@l63．com。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E—mail：lizhigangnn@163．corn)
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2期 张新成等：冰冻切片法在植物微管骨架研究中的应用 165
影响且费用高，或需要复杂的制片过程，从而使应用
受到一定的限制。
冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定
的硬度进行切片的一种方法。具有快速、方便的特
点，因其不经过脱水和透明等步骤，易保持生物体细
胞的原有形态，尤其在免疫组织化学染色中，能较好
的保存细胞抗原的免疫性，因此在免疫组织化学、原
位杂交及酶定位中被广泛应用。冰冻切片法在植物
微管研究中具有周期短、微管抗原性保护好、费用低
等特点，因此，在植物微管研究中具有广阔的前景。
本研究以甘蔗茎尖为例介绍冰冻切片法研究植物微
管骨架的一般过程及技术上的一些改进。
1 材料和方法
1．1材 料
品种 ：粤糖 86／368(Saccharum officinarum
CV．Yuetang 86／368)。
1．2方法
1．2．1固定剂及固定液的选择 目前国内外报道的
研究植物微管的固定液一般是 4 的多聚甲醛溶
液。由于甘蔗茎尖材料比较大并且细胞分化比较特
殊，经过试验发现 9 的甲醛溶液的渗透速度要明
显好于 4 多聚甲醛，对蛋白质抗原性的损伤也较
小。配置 固定 液 的缓 冲液 是 50 mmol／L Pipes
(pH7．0)，试验表明单一的 Pipes缓冲液效果 比
Pipes，EGTA，MgSO (PEM)三者的混合液对细胞
形态的维持更好。
1．2．2材料的固定及切片 取甘蔗伸长初期的甘蔗
茎尖，剥去幼叶，在实体解剖镜下将包裹生长锥的几
片大的幼叶剥去，仅保留生长锥附近的第 3至第 6
片幼叶或叶原基。将甘蔗茎尖修成4 mm×1 mm×
4 mm的组织块，即包括幼叶原基、生长锥、伸长区
的初生增粗分生组织和部分成熟区，立即投入 9 9／6
甲醛(50 mmol／L Pipes配制，pH7．0)固定液中，并
抽气 15～20 rain，将材料从抽气机中取出，振荡摇
动直至材料下沉 为止 。室温下 继续 固定 4～24 h，
然后进行如下处理：
将材 料 在 10 9／6 DMSO(二 甲基 亚砜 )(50
t mmol／L PBS，pH7．0配制)冲洗 3～5次，每次 30
rain，中间真空抽气 15～20 rain。材料在最后一级
冲洗液中停留2～3 h，经上述处理过的材料在低温
下切片可以得到很大的保护。冰冻切片机切片温度
为-25～一35℃，切片厚度根据材料细胞的大小和样
品的自发荧光来确定。甘蔗茎尖切片厚度为 15～
20 btm。选取茎尖正中且典型的纵切片用 L广多聚赖
氨酸(Sigma P8920)粘片 ，保存在 50 mmol／L PBS
(pH7．0)中，4℃条件下保存一周不会失去微管的
抗原性 。
1．2．3微管的免疫荧光标记 将切片从 PBS中取
出来进行如下处理：用含 2 Nonidet P一40的去污
剂处理 0．5 h以增加细胞膜通透性 ，含 1 9／5纤维素酶
和 0．5 的果胶酶溶液处理 5 rain，立即用 PBS冲洗
3次，每次 20 rain。然后用 2 Nonidet P一40的去
污剂处理 30 rain(以上溶液均用50 mmol／L PBS配
制，pH7．0)。PBS冲洗 3次，每次 20 rain。将切片
在 anti—a tubulin抗体(Sigma，1：200，PBS稀释，内
含有 2 小牛血清蛋白)中室温下孵育 1h。用相应
的缓冲液冲洗 3次，每次 30rain。之后在 FITC标
记的兔抗鼠抗体(Sigma，1：40，PBS稀释)中室温下
孵育 1 h。反应结束后用 PBS冲洗 1～2 h，冲洗液
更换 4～5次 。用含有 50 9／6甘油及 0．1 的对苯二
胺(PBS，pH8．5配制)的封片剂封片。封好的片子
在 4℃冰箱黑暗条件下可以保存 1～2周，保存半个
月以上抗体荧光大为减弱。
为了检验结果的真实性及观察样品的自发荧
光，设置以下对照：a不加一抗，b不加二抗，c一抗
和二抗都不加。实验程序和上述完全一致。
1．2．4荧光显微镜的观察及图像的处理 制备好的
片子在荧光显微镜下观察，所用显微镜型号为 O—
lympus BX51型号 (Japan)，激发光为蓝光，物镜镜
头为 100倍油浸镜头。标记理想的图片利用 O—
LYMPUS DIGITAL CAMERA DP70采集，图片保
存格式为 tif。图片的后期处理采用 Photoshop 7．0
编辑排版，高分辨率打印机彩色打印。实验结果见
图版及其文字说明。
2 总结和展望及讨论
由于植物细胞 的特殊性 ，如叶绿体及细胞壁 中
木质素的自发荧光，细胞壁的障碍限制抗体进入等
因素的存在，植物微管的研究远远落后于动物微管
的研究，而且研究成果常因植物种类而异(徐是雄
等，1996)。植物微管在植物的生长发育等形态建成
过程中起到非常重要的作用，要了解微管在植物形
态建成中的作用，特别是深埋在植物组织或器官内
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部的作用，必须有适合于微管研究方法的技术上的
改进 。植物茎尖 由大量幼叶包裹 ，而且细胞分化也
很特殊，分生细胞、各种成熟的细胞等都有分布，茎
尖的微管骨架也很少被研究 ，其 主要原因是缺少稳
定、可靠和简便的方法。因此，长期以来，植物微管
骨架的研究多集 中在小孢子、根尖及表皮等材料上 。
植物茎尖材料的固定是最为重要的环节 ，试验结果
表明 9 的甲醛溶液 的渗透速度及对微管抗原性 的
保护等方面要明显优于 4 多聚甲醛溶液，尤其是
在固定大的组织块时这种固定液的渗透效果非常
好。冰冻切片的低温往往对细胞造成损伤，而材料
固定后利用 1O DMSO处理可以在很大程度上减
少对细胞的损伤。利用冰冻切片方法结合间接免疫
荧光标记技术可以对甘蔗茎尖不同区域(包括分生
区、伸长区和成熟区等)发育过程中的微管骨架进行
结构和功能的研究，为单子叶植物甘蔗蔗茎增粗机理
提供微管动力学方面的实验依据 ，同时也为其它植物
微管骨架的研究提供借鉴意义。本研究表明，改进的
冰冻切片方法非常适合植物微管骨架的研究 ，特别是
研究深埋在大的器官或组织块中的细胞，实验周期
短，微管抗原性保护好。这一技术方法的建立对研究
微管骨架在植物发育中的作用具有重要意义。
图版 I 利用冰冻切片技术结合问接免疫荧光技术标记的甘蔗茎尖不同区域细胞在荧光显微镜下的荧光图像
Plate I Photographs of shoot apex cels microtubule arrays in diferent regions of Saccharum officinarum，the shoot apices were fixed，cryosec-
tioned and then stained by immunofluorescence technique，shoot axes point upwards
A．甘蔗茎尖生长锥原套细胞的成膜体微管；B．甘蔗茎尖第三幼叶基部的周质微管列阵，左下方箭头示和细胞伸长轴方向平行的纵向列阵微
管，右上方箭头示和细胞伸长轴近垂直的周质微管列阵，其中央黑色区域为细胞核所在位置；C．甘蔗茎尖处于正在伸长状态第一幼叶的微管
列阵，左上方的箭头表示和细胞伸长轴垂直的周质微管，右下方箭头示刚刚形成的早前期微管带； 甘蔗茎尖仲 }乏区原形成层束细胞的周质
微管，微管和细胞伸长轴近斜向排列。Bar=4 Fm
A．Phragmoplast microtubule array in the tunica of shot tip in sugarcane；B．Cortical microtubules in the primordium of the third young leaf，the low—
er left arrow indicates the microtubules array longitudinal tO the long axis of the cell，and the upper right arrow shows the more or less transverse cor—
tical microtubule to the axis of cell，the hole in the middie tO the cell shows the nucleus；C．Microtubule arrays in the first elongating young leaf of
shot apex in Sugarcane，the arrow in the upper left indicates the cortical microtubule were predomi nantly transverse to the long axis of the cel，and
the arrow lower right shows the emerging preprophase band；D．Oblique cortical microtubules array to long axis of the procambial strand cel in the e—
longation zone in sho t apex of sugarcane．1Bar=4 Fm
致谢 真诚感谢 日本奈良女子大学Dr Sakagu—
chi、华南农业大学刘向东教授惠赠抗体及在 实验技术
方面的帮助；美国 Dr Tobias I．Baskin(University of
Massachusets)为本 实验提供十分有益的技术上建议
及对图片细致的分析；中国农业大学袁明教授、李岩
教授和 中国林业科学院殷亚方博士、中国科学院微生
物重点开放实验室陈志玲博士后、北京大学尤瑞麟教
授等对本实验提供的帮助。
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而直径只有 0．5～O．7 CH1。因此需要形成一种能很
好适应其生理功能的内部结构。牛膝茎中存在有两
种不同类型的异常结构 ，即正常维管系统外围的三
生维管组织和髓中的髓维管束。其茎中的三生结构
主要由导管、木纤维和径向厚壁结合组织组成，髓维
管束的木质部和韧皮部都较发达，这些结构特征增
强了机械支持和物质输导的功能，是适应其生理功
能的结果。
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