全 文 ：广 西 檀 物 Guihala 29(5)：576— 580 2009年 9月
新变种上犹杜鹃的 ITS分子标记证据分析
刘仁林，曹利民，肖 红
(赣南师范学院 化学与生命科学学院，江西 赣州 341000)
摘 要，对杜鹃花科杜鹃属的新变种上犹杜鹃进行了 ITS分子标记分析。结果表明 (1)上犹杜鹃与原变种
毛果杜鹃在系统树上没有聚合为一支I(2)上犹杜鹃ITS序列密码子第二位上的 G+C含量与原变种毛果杜
鹃差异明显，而且编码位上的G+C含量(G-FCc)也与原变种毛果杜鹃有差异，(3)上犹杜鹃与原变种毛果杜
鹃的形态特征有明显的区别，并具间断性特征I(4)密码子偏向性指数 CB1分析正好反映了上犹杜鹃处于“变
种”等级阶段的特点。基于这些证据，认为上犹杜鹃处理为种以下等级“变种”比较合理。
关奠调；杜鹃属}新变种，ITS证据
中圈分类号：Q949．772．3 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2009)05—0576—05
Analysis of the evidences of ITS from a new variety
Rhododendron seniavinii var．shangyounicum
LIU Ren-Lin，CAO L Min，XIAO Hong
(Department ofChemistry andLi Science，GannanNormalCollege，Ganzhou 341000，China)
Abstract,Rhododendron seniavinii var．shangyounicum is a new variety，which belongs to the family Ericaceae and
genus Rhododendron．As to make classification of this new variety more true．many evidences of ITs has been studied
in this paper and the results are as folows：(1)Based on the strict consensus and most parsimonious tree of lTs se-
quences，Rh．seniavinii var．shangyounicum has not been clustered with Rh．seniavini var．seniaviniiI(2)G+C con-
tent at second codon positons(G+C2)is more different Rh．seniavlnii vat．shangyounicum and Rh．seniavinii var．58一
niavinii，and G+C content at coding positions(G-q-Ce)also is different between them (3)morphologic characters be—
tween this tWO taxa is clearly different by sOme intermittent characters!(4)Codon Bias Index CBI shows features of a
new variety Rh．seniavini var．shangyounicum which is in evolving ．According to the evidences above，it is reasOnable
that Rh．seniavini var．shangyounicum should be treated as a variety．
Key words：Rhododendron!new variety!evidences of ITS
杜鹃属(Rhododenron)是杜鹃花科(Ericaceae)
一 个种类丰富的属，1 000余种(David等，1959)，属
典型的北温带分布类型(闵天禄等，1979)。中国杜
鹃属约542种(何明友等，1999)，主要分布于我国西
南地区。上犹杜鹃(Rhododendron seniavinii var．
shangyounicum)系杜鹃花科杜鹃属植物，主要分布
在江西上犹、崇义以及湖南汝城、桂东等县，海拔
600~i 100 m，生长于林区路边或疏林内，它与原变
种在形态上有明显区别。为了使分类证据充分、可
信、可靠，对上犹杜鹃和毛果杜鹃原变种(Rh．senia—
vinii var．seniavinii)以及相关类群进行 ITS分子标
记实验分析。ITS是核糖体 DNA(nrDNA)的内转
录间隔区，ITS序列可以提供丰富的信息位点，目前
被广泛应用于植物进化与系统分析，符合较低阶元
系统分析的要求(田欣等，2002)。
收稿日期l 2008—05—20 修厕19期，2009·02—17
基金项目l教育部科技基础条件平台子专题(5O5002)[supported by Basic Research and Development Plan Df Education Department of China(505002)]
作者简介 刘仁林(1958·)，男．江西永新人，教授，研究方向为植物分类学。(E-mail)Irldongh@126．corn。
5期 刘仁林等：新变种上犹杜鹃的ITS分子标记证据分析 577
1 研究方法
1．1分子标记 I
1．1．1取样 映山红亚属(subg．Tsutsusi)取样 8种
(含种以下等级)，其它亚属的类群取样 2个种：即云
锦杜 鹃 (Rhododendron fortunei)、羊 踯躅 (Rh．
molle)。所取样的器官为新叶，即展叶后 2～3个
月，立即用硅胶保存，带回实验室后迅速放入一7O℃
的超低温冰箱保存。每个种在同一地区，对映山红
亚属，每个种分为海拔高、中、低三种类型，每种类型
选择 1个群落各取 3株，其它亚属的云锦杜鹃、闹羊
花每个群落取 1株，每个种在同地 区分别 3个群落
各取 1株，混合后提取 DNA。所采标本保存在江西
农业大学标本馆(JXAU)。取样主要考虑三个方面：
(1)外推类群的选择：云锦杜鹃同属于杜鹃属，分布
较普遍，采样方便；其次云锦杜鹃是常绿杜鹃亚属
(subg．Hymenanthes)的类群，常绿杜鹃亚屑在系统
发育中处于原始地位，其中云锦杜鹃亚组(subsect．
Fortunea)、耳叶杜鹃亚组(subsect．Auriculata)、大
叶杜鹃亚组 (subsect．Grandla)和杯毛杜鹃亚组
(subsect．Falconera)是原始类群的直接后裔(方瑞
征等，1995)，因此采用云锦杜鹃作外推类群比较合
适。(2)在较近缘的类群中取样：首先对毛果杜鹃原
变种取样并采集标本。毛果杜鹃原变种的等模式标
本(存放于中国科学院北京植物研究所)采自福建
(Chamberlain等，1990)，湖南也有分布(Stever~son，
1930)，因此通过等模式的查阅和研究，到福建对毛
果杜鹃原变种进行采集、取样。其次，对映山红亚属
的映山红组(sect．Tsutsusi)取样：即映山红(Rh．sf 一
si)、背绒杜鹃(Rh．hypoblematgsum)、乳源杜鹃(Rh．
rhuyuenense)、湖南杜鹃(Rh．hunanense)4个种和上犹
杜鹃；对映山红亚属轮叶组(sect．Brachycalyx)的取
样为 2个种：满山红(Rh．mariesi)和华丽杜鹃(Rh．
farrerae)。(3)适当扩大取样范围，即选择与映山红
亚属较近缘的羊踯躅亚属(subg．Pentanthera)的羊
踯躅取样；另外，映山红的取样增加了取样地点，分
别在福建戴云山、江西寻邬和广东南昆山取样。共
表 1 样本来源
Table 1 Resource of materials lor experiment
取 1O个种(含种以下等级)的样本(表 1)。
1．1．2实验方法 DNA的提取：取硅胶保存的植物
叶片约 0．1 g，采用改良的 CTAB法(Doyle JJ&
Doyle JL，1987)提取总 DNA并测序(邹喻苹等，
2001)。具体操作方法：(1)硅胶上取出 0．5 g干燥
的组织，在液氮中迅速研磨，使成糊状或粉状，在研
磨时即时加入少许抗坏血酸钠和 PVP干粉；(2)将
糊状物转入 5 mL离心管(聚苯丙烯管，耐氯仿)后，
加入 5～10 mL 65℃的 2×CTAB提取介质(100
mmol／L Tris—HCl pH8．0，1．4 mol／L NaC1，20
mmol／L EDTA，2 CTAB，0．1 ～2 硫基 乙
醇)，放入 65℃水浴保温 3O～60 min，开启摇动阀
维持缓慢摇动；(3)加入等体积的氯仿／异戊醇(24：
1)，缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊
液，在 6 000 g离心 10 rain使分层，取出水相转入另
一 离心管；(4)重复第 3步，即再用氯仿／异戊醇(24
：1)抽提 1次；(5)在两次抽提的水相中加入 2／3体
积冰冷的异丙醇，置于一2O℃ 30 min或过夜。然后
在 10 000 g离心 10 min收集沉淀，在室温下自然风
干4～5 min；(6)将此沉淀溶于合适体积的(200
L)0．1TE缓冲液(1．0 mmol／L Tris—HC1 pH8．0，
0．1 mmol EDTA pH8．0)，加入 2～3 L RNase A
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储备液 (10 mg／mL)，在 37℃保温 1 h以裂解
RNA；(7)保温后用等体积的氯仿／异戊醇(24：1)
再抽提一次，将水相转入另一 1．5 mL离心管，加入
1／5体积 10 mol／L的NH (使其总终浓度为2 mol／
L)，然后加入两体积冰冷 95 乙醇，在一2O℃放置至
少 30 rain；(8)再 10 000 g离心 10 min，收集沉淀；
(9)加入 7O 乙醇洗沉淀(10 000 g离心 10 min)去除
残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无乙醇
味，如果沉淀过干则难以溶解；(10)溶入适量的(200
～ 3O0 L／g新鲜组织)0．1TE缓冲液，分装后放人一2O
℃储存或放入4℃冰箱待用。
PCR扩增和测序 ：在 Perkin Elmer 960型 PCR
仪上进行 PCR扩增，引物为 White(1990)的引物，
PCR条件：97℃预变性 4 min，94℃变性 1 rain，50
℃退火 1．5 rain，72℃延伸 2 min，3O个循环，扩增
后用 Watson公司纯化试剂盒进行纯化 。依据双脱
氧链终止法(Sanger等，1977)的原理在 960型 PCR
仪上进行测序反应，反应条件为：96℃变性 10 S，50
℃退火5 S，6O℃延伸4 rain，3O个循环，反应体系为
5 L，所得产物经热变性后于 ABI310型自动测序
仪上进行序列测定。完成测序后进行序列校正，然
后通过互联网进入 Genbank，找出同源性最高的序
列，应用 Blast进行 比对，确定 ITS1、5．8S和 ITS2
的区间位点，并用 DNASP进行序列特征分析。引
物序列：ITS“4”(Sequence 5 to 3 )TCCTCCGCT—
TATTGATATGC；ITS“5’(Sequence 5 to 3 )
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；引物作用方
为：ITS“5”由 18 S与 ITS1交界区一ITS1—5．8 s—
ITS2—26 S与 ITS2交界区 ；ITS“4”由 26 S与 ITS2
交界区一ITS2—5．8s—ITS1—18s与 ITS1交界区。
序列经校正、对比等，得到如下结果。
2 结果与分析
采用 Clustalx 1．83软件对序列进行对准排序，
以云锦杜鹃为外推类群，应用 Paup 4．0bl0软件
(Swoford，2001)，对 1O种 (包括种以下等级)的
ITS序列进行分析。设置最大简约法和启发式搜索
(Heuristic search)获得 1个最简约树的严格一致树
(图 1)，并用靴带法(Bootstrap analysis，1000 repli—
cate)分析、检验简约树中各分支的支持率。ITS序
列长度范围是638--659 bp(表2)，5．8S均为164位
点。空位(gap)作缺失处理，ITS区序列有 23个变
锦杜鹃 R．fDrtu ei
羊花 R．moIle
果杜鹃R．se，7iaVinii
Va r seniavini i
山红 R．siresii r，
山红 R．sims i i(2)
山钮 R s／ms i；(3)
绒杜鹃R．hypobleastosum
南杜鹃 R．h“nanense
犹杜鹃 s口，7／aV／n／／
VaT．shangyoun|cUm
源杜鹃 R rhuyuenense
山红 R mar|esi i
丽杜鹃 R．far，erae
图 1 空位作缺失处理时用 Paup软件得到的映山红
亚属与其它类群 ITS序列分析最简约树的严格一致树
Fig．1 Strict consensus and most parsimonious
tree of ITS sequences by Paup
步长为5O，分支横线上面的数值为靴带支持率，下面的数
值为步长,Cl=O．96，HI=0．0000，RI=0．96。
tree length=5O，the number above the lines of branches
are bootstrap value(0A)，the number bdow the lines of branches fire
steps of branchesl CI=0．96。HI=0．0000，RI一0．96．
异位点，24个系统发育的信息位点。由表 2可知，
所取样本的 5．8S序列都为 164个 bp，比较稳定；云
锦杜鹃、闹羊花的序列较长，分别为 650 bp和 659
bp。此外，应用 Dnasp4．10软件(Julio等，2006)分
析各样本的 G+c含量(表 2)，其中：G+C2为密码
子第二位上的G+C含量；G+C3s为密码子(同义
密码子)第三位上的 G+C含量；G+Ce为编码位
(coding positions)上的G+C含量；G+C为各样本
ITS1与ITS2及 5．8s的总 G+C含量。CBI为密
码子偏向性指数。
2．1最简约树的严格一致树的分析
由图 1可知，上犹杜鹃没与毛果杜鹃原变种聚
合在一起，而与乳源杜鹃聚合为一支。这说明上犹
杜鹃的ITS基因序列与毛果杜鹃原变种有明显差
异，换句话说，上犹杜鹃与毛果杜鹃原变种的差异是
建立在基因序列差异的分子基础之上，因此支持把
上犹杜鹃作为种以下等级“变种”处理。说明了映山
红亚属的映山红组和轮叶组分别聚为两支，高连明
等(2002)对映山红亚属组间关系的 ITS分析也得
到同样的结果，在形态上轮叶组的类群均以叶轮生
5期 刘仁林等：新变种上犹杜鹃的ITS分子标记证据分析 579
或对生明显区别于映山红组，因此支持在映山红亚
属中成立这两个组的形态分类处理(何 明友等，
1994)。
由图 1还可知，上犹杜鹃没与毛果杜鹃原变种
聚合在一起 ，而与乳源杜鹃聚合为一支，这与杜鹃花
属中有些类群是天然杂交起源有一定的联 系(闵天
禄等，1990)。由于杜鹃属植物寿命较长，风媒异花
授粉 ，结实量大，基因交流频繁 ，种间杂合度较高，据
测定 ，种间杂合基 因多样化 比率达 0．683(高连名
等 ，2000)，因此 ，上犹杜鹃可能是天然杂交起源的类
群之一。图 1表明，映山红这个种 3个跨省区的样
本依然聚合在一个分支，说明杜鹃属虽然种间杂合
性较高，但种内却保持着一定的稳定性，原因是杜鹃
属植物寿命较长 、风媒异花授粉、结实量大、基因交
流频繁等特点有利于种内维持低水平的群体遗传分
化和高水平的种间遗传分化(高连名等，2000)。高
水平的种间遗传分化有利于物种形成 ，种内低水平
的群体遗传分化又是物种性状稳定、清晰可辨的基
础 ，因此杜鹃属的这一特点又在一定程度上反映了
杜鹃属之所以种类繁多、而种间形态上依然清晰可
辨的分子基础，图 1中映山红组和轮叶组明显地聚
为两支也是杜鹃属这一规律的反映。
表 2 各样本 ITS1、ITS2、5．8S的长度和基因分析
Table 2 Length of ITS1，ITS2，5．8S of samples and their gene analysis
类群 Taxa
分析指标 Items of analysis
ITS1(bp) ITS2(bp) 5．8S(bp) G+C2 G+C3s G+Cc G+C CBI
聚为两支也是杜鹃属这一规律的反映。
2．2基因分析
由表 2分析可知，同一个种不同地理区域的样
本 G+C2含量变化不大，如表 2中映山红 (1)、映山
红(2)和映山红(3)之间的 G+C2含量差异很小。
但是，上犹杜鹃 ITS序列密码子第 2位上(G+C2)
的G+C含量为 0．525，与原变种毛果杜鹃(O．517)
相差 0．008(即 0．8 )，差异明显。由于密码子第二
位上的碱基替换都能表达为氨基酸取代的替换，因
而具有进化意义。由此可知，上犹杜鹃具有明显的
基因序列差异的遗传基础。这个结论在分子水平上
提供了上犹杜鹃可以作为种以下等级处理的重要依
据。此外，表2中上犹杜鹃ITS序列编码位(coding
positions)上的 G+C含量(G+Cc)为 0．554，原变
种毛果杜鹃为 0．553，二者差异达到 0．1 ，一般而
言，ITS序列编码位上的碱基替换可 以引起氨基酸
取代(黄原，1998)，成为信号位点，这又说明了上犹
杜鹃作为新变种分类等级的合理性。
密码子第三位上的替换多数为同义替换，这使
序列中密码子第三位碱基组成很快趋于随机化，从
而使这一位点成为无信号位点，因此 G+C3s含量
变化常常是引起趋同进化的原因之一，在分类研究
中应该正确识别这种趋同造成的假象。上犹杜鹃密
码子第 3位上的 G+C含量(G+C3s)为 0．523，12
个样本的平均值也为 0．523，说明上犹杜鹃的趋同
变异不强烈，性状相对较稳定。
由于密码子偏 向性指数 CBI与基因表达速度呈
正相关，与核基因的进化速率呈负相关(黄原，1998)。
因此根据表 2可知，上犹杜鹃的CBI指数为0．255，大
于原变种毛果杜鹃的CBI(0．291)，而且是所采的12
个样本中CBI指数最小的一个类群(表2)，说明上犹
杜鹃的进化速率较快，基因表达速度较慢，这一事实
正好反映了上犹杜鹃处于“变种”等级阶段的特点，支
持把上犹杜鹃处理为种以下等级的类群。
2．3表型形态分析
上犹杜鹃与毛果杜鹃原变种的形态特征有明显
580 广 西 植 物 29卷
的区别(表 3)，其中上犹杜鹃的花丝中部以下具白
色短毛、花柱无毛是区别于原变种毛果杜鹃的间断
性特征 ，具有明显的分类意义。上犹杜 鹃主要分布
于罗霄山脉中段的上犹、崇义、遂川、汝城、桂东等县，
具有一定的地理分布区。因此基于形态特征分析，把
上犹杜鹃处理为种以下等级的分类群具有一定的合
理性。这种形态分类的处理与前面ITS的分析是一
致的，即图 1中上犹杜鹃没有与毛果杜鹃原变种聚合
在一起 ，反映了上犹杜鹃的分化形成具有遗传差异的
分子基础，并表现出一些稳定的形态性状。
表 3 上犹杜鹃与原变种毛果杜鹃的比较
Table 3 Comparison of morphologic characters between Rh．seniavinii var．
shangyounicum and Rh．seniavinii var．seniavinii
3 讨论
(1)应用 ITS分子标记分析表明，上犹杜鹃与
原变种毛果杜鹃在系统树上没有聚合为一支；基因
分析也表明，上犹杜鹃ITS序列密码子第二位上的
G+C含量与原变种毛果杜鹃差异明显，而且上犹
杜鹃 ITS序列编码位上的G+C含量也与原变种毛
果杜鹃也有差异，这些结论在分子水平上提供了上
犹杜鹃可以作为种以下等级处理的重要证据。此
外，上犹杜鹃与原变种毛果杜鹃的形态特征有明显
的区别，并具间断性特征，这与分子标记的分析结果
一 致。根据密码子偏向性指数 CB1分析，上犹杜鹃
的CBI指数大于原变种毛果杜鹃的CBI指数，而且
是 CBI指数最小的一个类群，说明上犹杜鹃的进化
速率较快，基因表达速度较慢，这一事实正好反映了
上犹杜鹃处于“变种”等级阶段的特点，充分说明把
上犹杜鹃处理为种以下等级“变种”的合理性。基于
上面的证据，上犹杜鹃与毛果杜鹃原变种的形态差
异是奠定在基因序列差异的基础之上，因此将上犹
杜鹃处理为种以下等级“变种”比较合理。
(2)ITS分析表明：上犹杜鹃没有与毛果杜鹃原变
种聚合在一起，而是与乳源杜鹃聚合为一支，这可能与
杜鹃花属中有些类群是天然杂交起源有一定的联系。
(3)根据 ITS分析，映山红这个种 3个跨省区
的样本依然聚合在一个分支以及与其它同类研究的
结果一样：映山红组和轮叶组明显地聚为两支，这些
事实进一步说明了杜鹃属虽然种间分化性较高，但
种内却保持着一定的稳定性的特点。
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