全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(2)：255— 261 2011年 3月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．03．022
无籽八月桔胚囊及胚胎发育细胞学观察
范学翠，秦永华，叶自行 ，吴筱颖 ，胡桂兵
(华南农业大学 园艺学院，广州 510642)
摘 要：运用酶解振荡压片技术和常规石蜡切片技术分别研究 了无籽八月桔的胚囊育性及无籽八月桔 自交
和异交 (无籽八月桔×台湾桠柑 ，无籽八月桔×有籽八月桔)的胚胎发育。结果表明：无籽八月桔胚囊可育 ，成
熟胚囊具一个卵细胞 、两个助细胞 、三个反足细胞 以及一个大 的含二个极核的中央细胞；其 自交和异交的胚
胎发育均正常 ，授粉后 2周出现球形胚和少量心形胚 ，授粉后 3周出现心形胚和鱼雷形胚，授粉后 4周全部为
鱼雷形胚 ，授粉后 5周发育成子叶胚，授粉后 7周子叶胚继续发育形成种子痕迹 ，仍具珠柄。可以得 出，无籽
八月桔胚囊育性正常，且不具胚胎 中途败育现象 ，胚胎败育不是无籽八月桔无籽的原因。
关键词：无籽八月桔 ；无籽机理 ；胚囊 ；胚胎发育
中图分类号 ：$666．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)02—0255—07
Cytological observation of embryo sac and embryonic
development in the new mandarin cultivar
‘Wuzibayuej u，(Citrus reticulata Blanco)
FAN Xue-Cui，QIN Yong-Hua，YE Zi-Xing，
W U Xiao-Ying．HU Gui—Bing
(Faculty of Pomology，College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 5 10642，China)
Abstract：Enzymolysis oscillation squash method and routine paraffin section were used to study embryo sac fertility
of‘Wuzibayueju’and the embryonic development of three pollinated combinations(‘Wuzibayueju’בWuzibayueju’·
‘Wuzibayueju’בPonkan’，‘Wuzibayueju’× ‘Bayu~u’)．The results were as folows．(1)The embryo sac fertility
of‘Wuzibayueju’was norma1．Mature embryo sac had one egg，two synergids，three antipodal cels and a big central
cel containing two polar nuclei．(2)The embryonic development of self-pollinated‘Wuzibayueju’and cross-polina—
ted‘Wuzibayueju’בPonkan’。‘Wuzibayueju’× ‘Bayueju’were norma1．Two weeks after self-pollination，the zy—
gotic embryo became globular—shaped and a few heart-shaped．Three weeks later，heart—shaped embryos and torpedo-
shaped embryos were observed．Four weeks later，embryo reached at the torpedo stage．Five weeks later，cotyledon—
ary embryos were observed．And seven weeks later，cotyledonary embryos were developing into seeds while funiculi
were still existent．Those results indicated that embryo sac fertility of‘Wuzibayuej u’was normal and there was no
embryo abortion during embryonic development．Therefore，the embryo abortion was not the seedless reason of the
new cultivar‘Wuzibayuej u’．
Key words：‘Wuzibayuej u’；seedless mechanism；embryo sac；embryonic development
收稿 日期 ：2010 07 30 修 回日期：2O10 11-22
基金项目：广东省科技计划项目(2006B20201036)[Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province of China
(2006B20201036)]
作者简介 ：范学翠(1984)，女，山东枣庄人，硕士，主要从事果树种质资源改良及遗传育种研究，(E mail)fanxuecui@163．com。
通讯作者 ：胡桂兵，教授，博士生导师，(E—mail)guibing@scao．edu．cn。
256 广 西 植 物 31卷
八月桔 (Citrus reticulata‘Bayueju’)是我国特
有的宽皮桔品种之一 ，该 品种 1O月下旬开始成熟，
果 肉清甜，结实早 ，丰产性好，因品质优 良而深受广
大消费者的喜爱，但原有的八月桔由于种子太多(平
均单果种子数在 16．6粒左右)，从而限制其进一步
发展 (邓秀新等，2008)。课题组通过芽变选种途径
在粤西山区选育出一株无籽芽变植 株，连续观察两
年发现其单果平均种子数均为 1．9粒，符合柑桔无
籽的标准 。芽变是遗传 物质 的改变 ，包括染色体数
目变异 、染色体结构变异 、基 因突变及核外突变，且
基因突变产生的芽变多数是 由一个基因的突变形成
的(沈德绪 ，1995)，因此 ，研究由芽变产生 的无籽八
月桔的无籽机理，在理论及实践上都具有特别重要
的意义。
柑桔无籽的原因有许多，包括雄性不育(胡志勇
等 ，2006；张青闪等 ，2006)、胚囊育性下降或败育(刘
蕊 等，2008；肖 金 平 等 ，2007)、自 交 不 亲 和
(Yamamoto等 ，2002；Ye等，2009)、胚胎败育(王玉
玲等，2008)、多倍体造成的不育(Grosser等，2000)
以及 外 在 因素 影 响 (Talon等，1992；邓 秀新 等 ，
1996)等。对无籽八月桔的雄配子体的育性及 自交
亲和性的研究结果表明，无籽八月桔的雄配子体可
育 、自交亲和(另文发表)。在此基础上 ，本文对无籽
八月桔成熟胚囊 的育性 和胚胎发育进行 了研究 ，以
期阐明无籽八月桔无籽化机理 ，为生产应用提供理
论依据。
1 材料与方法
1．1材料
材料无籽八月桔(树龄 2 a)、有籽八月桔和台湾
碰柑均种植于广州市华南农业大学分场果 园，试验
植株均以酸桔为砧木。
1．2方法
1．2．1无籽八 月桔成熟胚囊的观察 取无籽八月桔
即将开放的花蕾，将其雌蕊固定于卡诺固定液 l(无
水乙醇 ：冰醋酸一3：1)中，固定 12～24 h，梯度乙
醇浸洗(95 ～9O ～85 ～8O ～75 ～7O )后
(每次 10 rain)，于 70 乙醇中 4℃保存备用 。参照
李湘 阳等(2000)的方法并略做改进 ，步骤 如下 ：于
7O 乙醇中剥取子房中的胚珠 ，经 50％～3O 乙醇
梯度下行至蒸馏水 ，每级 10 min；换入 2．5 纤维素
酶和 2．5 果胶酶 的混合液 (pH5．5)中，在微型振
荡器上 28 C酶解处理 2～7 h；微型离心机上 1 500
rpm离心 5 min，去酶液 ，水洗 2次 ，去上清 ，加入乳
酚甘油(乳酸 2O mI 酚 2O mI 、甘油 40 mL、蒸馏水
2O mI )透明。制片，用吸管将胚珠和一滴乳酚甘油
转移到载玻片上 ，加上盖玻片，用解剖针在盖玻片上
轻敲，使胚珠的细胞分散 ，分离出胚囊 ，用倒置相差
显微镜(Olympus IMT一2，日本)观察拍照。
1．2．2无籽八 月桔 自交和异交胚胎发育的观察 分
别于无籽八月桔 自交 、无籽八月桔 ×有籽八月桔及
无籽八月桔 ×台湾槛柑授粉后 2、3、4、5、6及 7周取
幼果 ，每个处理采集 4个发育正常的幼果 ，将材料浸
于卡诺 氏固定液 I(无 水乙醇 ：冰醋酸一3：1)带
回，固定 12～24 h，梯度乙醇浸洗后 ，置 70 乙醇中
4℃保存备用。将材料用 2 丙酸乙醇媒染及 2
丙酸乙醇+爱氏苏木精(2：1)整染 。随后进行流水
冲洗 、梯度乙醇脱水以及氯仿透明、浸蜡。最后用石
蜡对处理过的材料包埋。用切片机(AO820，美国)
进行切片 ，厚度 8“m，经二 甲苯脱蜡 ，中性树胶封片
后，在光学显微镜(0lympus BH一2，日本)下镜检 ，选
取有代表性 的片子用数码显微 照相 系统 (Olympus
DP70)进行拍照。
2 结果与分楫
2．1酶解时间对无籽八月桔胚珠解离效果的影响
不同的酶解时间对无籽八月桔胚珠解离有显著
影响。于微型振荡器上，酶解 4～5 h的效果最好，
内外珠被几乎完全脱落。酶解时间在 3 h以下的胚
珠 ，其内外珠被没有脱落 ，还需用解剖针使之离散，操
作不方便；酶解 6 h以上 的胚珠解离过度，内外珠被
虽脱落 ，但胚囊无法保证其完整性，也不利于观察 。
2．2无籽八月桔成熟胚囊的结构观察
利用 酶解振荡压片法，从无籽八月桔的胚珠中
分离出“七胞八核”的胚囊结构 (图版 I：1)，可见在
珠孔端有 1个卵细胞、2个助细胞 ，在合点端有 3个
反足细胞 ，以及在这两群细胞之问有 1个大的含 2
个极核的中央细胞。由此表明，无籽八月桔成熟胚
囊的发育是正常的。
2．3无籽八月桔 自交和异交胚胎发育状况
无籽八月桔 白交和异交授粉后 2周，观察到多
数的球形胚和少数的早心形胚 (图版 I：2 10)。自
交和异交授粉后 3周和 4周 ，可以观察到心形胚和
鱼雷形胚(图版 I：ll l5，图版 Ⅱ：l6 28)，已进入分




2期 范学翠等：无籽八月桔胚囊及胚胎发育细胞学观察 261
2006)。第二 ，无籽八月桔是课题组在粤西山区发现
的无籽芽变突变体 ，在研究其无籽机理时，采用的是
在温度较高的广州通过无性 繁殖手段种植的材料 ，
广州与粤西山区开花时温度差异 比较大 ，从而可能
造成育性存在差异 。具体原 因还有待进一步研究 。
4 结论
本研究对胚囊和胚胎发育进行观察 ，发现无籽
芽变八月桔的胚囊具有七胞八核结构 ，自交和异交
授粉果实胚胎发育正常，由此可 以确定胚胎败育不
是无籽八月桔无籽的原因。
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(下转第 265页 Continue nq page 265)
2期 王雪娟等 ：睫毛萼凤仙花的组织培养及其愈伤组织的超微观察 265
外植体进行愈伤组织的诱 导和植株再生研究。结果
表明，在合适的培养基配方上 叶片和茎都可 以诱 导
出愈伤组织 ，但叶片的诱导率较高，且形成的愈伤组
织能够再生出不定芽和不定根 。因此 ，对 于离体再
生为 目的的睫毛萼凤仙花组 织培养来说 ，叶片是最
适的 外 植 体。在 MS+ NAA 0．5 mg／I + 6-BA
2．0mg／I 培养基上，叶片诱导的愈伤组织可以直接
再生出植株。
对叶片和茎诱导 的愈伤组织进行超微结构 观
察，发现在愈伤组织阶段 ，出现再分化和未出现再分
化的组织在超微结构上就有 明显差异，所 以在愈伤
组织再生研究中，可以根据超微结构初步判断其再
生能力 ，从而减少试验所需时间 ，N：DN成功的机率。
本试验首次对睫毛萼凤仙花进行离体培养，并
再生出了植株，但对于商业化大规模生产来说 ，其再
生体系还需要进一步的系统化研究 。
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