全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(1)：25— 30 2011年 1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．201l_01．007
云南真藓和细叶真藓的核糖体 DNA ITS序列分析
汪琛颖1，2，李利博 ，赵建成
(1．河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050016；2．郑州师范学院 生命科学系，郑州 450044)
摘 要 ：从形态特征和地理分布特征 比较分析云南真藓和细叶真藓的区别 ，通过对核糖体 DNA的内转录间
隔区序列分析研究 ，对二者进行分子水平鉴定。对包括真藓属及相关属的 6种植物的 ITS序列进行扩增和测
序 ，使用 DNAMAN和 MEGA3．0软件对获得的 ITS序列数据进行分析。结果表明，云南真藓和细叶真藓的
ITS-1和 ITS-2区在序列长度 ，G+C含量上均存在差异。UPGMA法聚类分析表明，这种差异发生在种级水
平。研究结果表明，云南真藓和细叶真藓应视为独立的两个种。
关键词：细叶真藓 ；云南真藓 ；ITS序列 ；序列分析
中图分类号：Q944．1 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)01-0025-06
ITS sequences analysis of nuclear ribosomal DNA
of Bryum yuennanem and B． ．pillaU ll se a／Jca ttre ●
WANG Chen-Ying ，LI Li一13o ，ZHAO Jian-Cheng
(1．Colege of Life Science，Hebei Normal University，Shiiazhuang 050016，China；2．Department
o_厂L fe Sdence，Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，China)
Abstract：Morphological characteristics and ecological distributions of Bryum yuennanense and B．capillare were ana—
lyzed in this study．Molecular identifications were done by the analysis of Bryum yuennanense and B．capillare ITS
region of the six species in the related genus were amplified and sequenced．The sequences data were analyzed by
DNAMAN and MEGA3．0．The results showed that the length of sequences and content of G+C of ITS-1 and ITS-
2 were different between B．yuennanense and B．capillare．Phylogenetic tree based on ITS sequences data was con—
ducted by UPGMA method，which showed some variations at the level of species．B．yuennanense and B．capillare
should be assigned as two different taxa．
Key words：Bryum capillare；Bryum yuennanense；ITS sequence；sequence analysis
真藓属 (Bryum)隶属于藓纲 (Musci)真藓 目
(Euryles)真藓科 (Bryaceae)，是藓类中较大 的属之
一
。 此属中的各类 群存在 大量 的形态学变化，所以
分类标 准 较 难 确 定 (陈 邦 杰 ，1963) 细 叶 真 藓
(Bryum capillare)是 Hedwig早在 1801年在“Spe—
cies Muscorum Frodosorum”中确立的种。云南真
藓(Bryum yuennanense)是 Brotherus于 1924年根
据云南丽江所采标本所确立的种。细叶真藓广泛分
布于世界各地，由于形态学变异频繁，异名甚多，记
录有 67个异名，Bryum yuennanense即为其中异名
之一(Gangulee，1980)。何小兰在吴鹏程主编的“横
断山区苔藓志”中也指出，细叶真藓随生境的变化其
形态变异很 大，异名 也包括 B．yuennanense。黎兴
江等(2002，2006)对 B．yuennanense作为B．f＆pil—
lare的异名提出异议。他们根据模式标本及采集到
的标本对比，发现前者形态完全不同于后者，故恢复
收稿日期 ：2010-06一l 5 修回日期：2010—10—20
基金项目：国家自然科学基金 (31070184)；河北省 自然科 学基金(C2008000158)[Supported by the National Natural Science Foundation of China
(31070184)；the Natural Science Foundation of Hebei Province(C2008000158)
作者简介 ：汪琛颖(1968一)，女，河南南阳市人，博士 ，副教授 ，主要从事苔藓植物分子系统发育研究，(E-mail)okwcy@yahoo．corn．cn。
通讯作者 ：赵建成(1956)，男 ，教授，博士生导师 ，研究领域为植物学、植物生态学，(E-mail)zhaojiancheng@mail．hebtu．edu．cn。
26 广 西 植 物 31卷
其原名，B．yu~Tzna 72ense的新拟名为云南真藓。
近年来，分子生物学的方法 特别是基 于 DNA
序列数据分析方法越来越多地被用于苔藓植物的系
统发育学研究(Cox& Hedderson，1999；Pedersen
& Hedenas，2003，2007)。 由于 核 核 糖 体 DNA
(nrDNA)的内转录间隔区(internal transcribe spac—
er，ITS)两个间隔区的获得和解释都相对容易 ，序列
短、两端均连接高度保守区、拷贝多、一致进化快和
长度保守等特性均有助于它们的 PCR扩增 、测序和
排序。这些序列能提供足够的潜在信息变异来有效
地解决系统发育关 系(Baldwin，1992)，而且 国内有
张会(2003)及 车未艾 (2006)等应用 ITS序列数据
分析羽藓科和广义平藓科系统学研究的成功事例。
但对真藓属植物的 ITS序列分析尚未见文献报道。
本文试图通过分析 ITS序列，对 比同源性，为云南
真藓和细叶真藓的分类和鉴定提供参考依据。
1 材料与方法
1．1实验材 料
为比较云南真藓和细叶真藓的差异范围，选取
4种真藓属植物、1种银藓属植物和 1种丝瓜藓属植
物为研究材料，采用陈邦杰(1963)的属级分类系统
(表 1)。凭证标本保存于河北师范大学生命科学学
院植物标本室(HBNU)。
1．2形态特征观察
在体视显微镜下进行解剖观察，对植物体形态
特征进行观察和分析，在显微绘图仪下进行绘图。
表 l 标本 Genbank登录号及来源
Table l Species sequenced in this study with GenBank accession numbers and the source of voucher specimens
1．3总 DNA的提取、PeR扩增及 DNA测序
称取上述材料各约 20 mg置于研钵 中，加少量
磷酸吡哆醛(PVP)粉末 ，加入液氮充分碾磨。其总
DNA用 Plant Genomic DNA Kit试剂盒 (Tiangen
Biotech，北京)进行提取。使用 NanoDrop ND一1000
(NanoDrop Technologies，美国)紫外分光光度计测
DNA浓度 与 纯 度，以备 用 于 PCR扩 增 的模 板。
lTS1 5．8S—ITS2区的扩增采用 巢式 PCR法 ，第一
轮扩增使用的外侧 引物参 照 Shaw(2000)描述 的
BMBC～R和LS4～R，PCR反应物总体积为25 L，其
中 lO× Taq Plus buffer(200 mmol／L Tris—HC1
pH8．4，200 mmol／L KC1，100 mmol／L(NH4)2S ，
15 mmol／L MgC12，其它成分)2．5 uL；10 mmol／L
dN FP Mix 0．j L；25 mmol／L MgC12 1 L；2．5
U／IA laq plus DNA polymerase(Tiangen Bio—
tech，北京)0．5 L；10／,mol／L BMBC—R和 LS4一R
引物各 1．25 I ；模板 21 ng，补足水份。另设一不
加 DNA模板的阴性对照 。扩增反应在 533l Mas—
t ercycler gradient PCR仪 (Eppendorf Biotech，德
国)上进行 ，PCR扩增程序为 ：94℃预变性 2 rain；
94℃ ，l min，50℃，1 min，72℃，1 min，共 35个循
环 ；最后 72℃延伸 7 rain，4℃保存。扩增结果经
1．2 琼脂糖凝胶电泳检测成功后，取 0．5 L扩增
产物作为后续 PCR扩增模板 ，扩增 引物为 ITS1和
ITS4(Shaw，2000)。PCR反应物其它成份同上，总
体积为 50 L。PCR扩增产 物经加有 Goldview川
(北京赛百盛基因技术有限公司)的 1．2 琼脂糖凝
胶电泳后，在紫外透射仪下观察，切割 目的条带，用
UNIQ一10 pillar purification kit(上海生工生物工程
公司)进行纯化。纯化产物送上海英骏生物公司使
用 ABI一3730XL DNA测序仪进行双向序列测定。
1．4序列处理与排列
将上 述 获 得 的 序 列 采 用 Pubmed工 具 的
BLAST检验，排除有外源污染的序列存在。利用
Omiga 2．0(Searby，2000)软件和一对引物 ITS1和
ITS4确定 ITS范围、正反向测得序列的拼接，最终
获得 ITS序列。数据提交 GenBank，获得 GenBank
登录号 (表 1)。运 用 DNAMAN 6．0．3．48软件
(www．1ynnon．com)对样品的 ITS序列进行同源性
分析。用 MEGA ver3．1(Kumar等 ，2004)计算 ITS
l期 汪琛颖等：云南真藓和细叶真藓的核糖体 DNA ITS序列分析 27
2
，
一
l
1 mm
图 1 云南真藓 1．叶片；2．叶尖细胞；3．叶中部细胞；4．叶基部细胞；5．叶横切；6．茎横切
(李利博 20073475．比伊j尺：1．1 mm；2-5．0．1 mm；6．0．z ram)
Fig．1 Bryum yuennanense 1．Leaves；2
． Leaf apices cells；3．M idleaf cells；4．Basal leaf cells；5．Transverse section
of leaf；6．Transverse section of stem(Li LB．20073475．Scale bar：1 mill for 1；0．1 mm for 2—5；0．2 mm for 6)
序列的碱基 组成、GC含量及根 据非加权成对平均
数(UPGMA)法构建聚类树系图，并通过自举分析
(bootstrap)作置信度检测，自举数据集为 1 000次。
2 结果和分析
2．1形态特征比较分析及其地理分布特征
由于云南真藓未见孢子体，对云南真藓和细叶
真藓配子体的形态学特征进行对 比研究，发现两者
具有一些共同的特征，其中叶尖渐尖，叶基无下延，
叶中部细胞壁薄以及中肋贯顶突出呈短芒状。其差
异性表现在，云南真藓叶形为长圆形、卵圆状披针形
或心形．，长宽比为 3：l；无分化边缘；叶细胞相对较
小 ，叶中部细胞 的长宽比约为 2：1(图 1)。而细叶
真藓叶形为倒卵形 、卵圆形或舌形 ，长宽 比为 2．5：
1；边缘不明显分化呈 1～2列线形薄壁细胞；叶细胞
相对较大，叶中部细胞的长宽比约为 3：1(图2)。
从地理分布特征来看，两个种的分布区域也存
在一定的差异。细叶真藓为世界广布种，在中国几
乎遍及各个省区，而 云南真藓 目前在世界上仅 中国
有分布的记录，主要分布于云南、四川、西藏一带，个
别地 区如安 徽、浙 江也有 分布记 录(黎兴江等，
2006)。
2．2目的片段 18S一26S rDNA及其ITS片段的扩增
以云南真藓为例，图3示 ITS区巢式 PCR扩增
结果，第一轮 PCR扩增产物片段大小约 1 500 bp，
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图 2 细叶真藓 1．植物体；2．叶片；3．叶尖细胞；4．叶中部细胞；5．叶基部细胞；6．茎横切；7．叶横切；8．芽孢 (曹娜 20050219)
Fig．2 Bryum
．
capillare 1．P1ant；2．LeaVes；3．Leaf apices cels；4．Midleaf cals；5．Basal leaf cells,6．TranSVerse section of stem；
7．Transverse section of leah 8．Gemmaes．(Scale bar：2 mm for 1；1 mm for 2；0．1 mm for 3-5；0．1 mm for 6—7；0．2 mm for 8．)
第二轮 PCR扩增产物片段大小约 1 000 bp。
2．3 ITS序列长度及分析比较
云南真藓、细叶真藓、真藓、银藓、小丝瓜藓和
Bryum amblyodon的 ITS序列的总长度分别为
936、1 041、970、1 006、1 100、1 029 bp。均包括部分
18S rDNA 区，ITS区 (ITS一1+ 5．8S rDNA+ITS一
2)和部分 26S rDNA区。其 ITS分布情况见表 2，
同源性比较见表 3。
从 表 2、表 3可见 ，在六 种样 品的 ITS区 中，
5．8S rDNA区的长度一致，均为 152 bp，且 5．8s
rDNA区同源性最高 ，在云南真藓和细叶真藓 间达
i00 。但 ITS一1和 ITS～2的同源性在属、种之间表
现出多态性。在 ITS-1区，云南真藓与真藓属植物
真藓及 B．amblyodon的同源性分别为 38．68 和
35．40 ，均 大 于 与 细 叶真 藓 之 间 的 同 源 性
(34．31％)，与丝瓜藓属植物小丝瓜藓的同源性为
18．42 ，与银藓属植物银藓的同源性为 37．23 9，6。
在 ITS一2区，云南真藓与真藓及 B．amblyodon的同
源性分别为 54．77 和 51．26 ，大于与细叶真藓之
间的同源性(50．50 )，与银藓及小丝瓜藓的同源性
分别为40．45 和 48．24 9／6。而细叶真藓与 B．am—
blyodon及银藓在 ITS-1的同源性分别为 48．18 和
41．61 ，均高于与云南真藓间的同源性。同样情况
也存在于 IT 2区，细叶真藓与 B．amblyodon及银藓
1期 汪琛颖等：云南真藓和细叶真藓的核糖体 DNA ITS序列分析 29
在 ITS-2的同源性分别为 62．81 和 6O．05 9／6。
M
1500bp
1000bP
M
图 3 样品云南真藓外侧引物 BMBC_R和 LS4一R
PCR扩增及内侧引物 ITS1和 ITS4 PCR扩
增产物电泳图(M：100 bp标准分子量标记)
Fig．3 PCR amplification of rDNA ITS in Bryum
yuennanense(Lane 1 PCR product amplifed by primers
BMBC-R and LS4一R：Lane 2 PCR produ~ amplifed by
primers ITS1 and ITS4；Lane M ：lO0bp DNA ladder)
表 2 六种样品的 ITS分布长度比较
Table 2 Comparisons of the rDNA ITS length
variation among these six species
Bootstrap重复 1 000次的 自举一致树如图 5。
从图5可见，由云南真藓和真藓组成一个弱支
持的分支(自举值为 53)与细叶真藓和 B．amblyo—
don组成的分支构成姊妹群。说明云南真藓与真藓
的关系较与细叶真藓更近。
表 3 六种样品的 ITS同源性比较
1 O00bp Table 3 Comparisons of the rDNA ITS
homologies among these species
2．4 G+C含量
对六种样品的ITS区 G+C含量的计算(表 4)
可以看出，云南真藓与细叶真藓，真藓及小丝瓜藓的
G十C含量在 5．8S rDNA 区一致 ，均 为 50．65 。
在 ITS一1及 ITS-2区，各种样品的 G+C各不相同，
表现出不 同种 的特 异性。云南真藓 与细叶真藓在
ITS区 G+C含量上的差异(1．O6 )大于其与真藓
间的差异(0．47 )。
2．5云南真藓与细叶真藓 ITS区碱基序列差异
云南真藓与细叶真藓 ITS序列 间存在 105个
变异位点，其中ITS一1区内有 76个位点变异，ITS一2
区内有 29个位点差异 ，而在 5．8S区两者序列一致
(图 4)。
2．6聚类分析
由于ITS一1和 ITS一2片段长度有限，各自提供
的信息量并不十分充足，所以将两个片段及 5．8S片
段合并，利用 MEGA ver3．1软件的 UPGMA法，
表 4 六种样品 ITS区 G+C含量分布情况
Table 4 Comparisons of the G+C content
among these six species
3 讨论
在核糖体基因多基因家族的成员中，除裸子植
物外，ITS区在植物核基因组中是高度重复的，所以
比起多数低拷贝的核基因位点来说，这样多的拷贝
数很容易通过 PCR扩增。因为苔藓植物材料难 以
持续、快速、稳定地得到，其生长缓慢，对环境条件有
特殊要求，人们虽然早在 自然界中采集到它们，但目
前尚难以在实验室中大量、长期培养，所以在分子系
统学研究中经常要用到陈旧的材料及蜡叶标本材
料，但这并不影B向lTS序列的获得(Baldwin等，
30 广 西 植 物 31卷
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． ． 自nC．⋯
图 4 云南真藓与细叶真藓 ITS序列问的变异位点(一致一 ·；插入／缺失一一)
Fig．4 The map of variable sites of ITS sequence between B．yuennanens
and B．capillare(“·”means Identical：“一 ’means Inde1)
Poh，／a crudoides
CCTGGCACTT
⋯ ⋯
． B．．
TAT-RCTTCC
． ． CC⋯ C．
比较 ，也发现两者存在的差异。云南真藓及细叶真
藓的 ITS区的 ITS一1及 ITS一2序列比对结果显示，
伽 6，y ， 二者在DNA序列上存在种级水平的显著差异。根
Bryum capi I late
amblyodon
yuennanense
argenteum
图 5 根据 ITS序列数据获得的 UPGMA法 Bootstrap
一 致树 (分支上的数字代表自展支持率)
Fig．5 Bootstrap consensus tree from the ITS data
(gootstrap support is shown above the branch)
1995)。另外，由于 ITS区不加入成熟核糖体，所以
受到的选择压力较小 ，进化速率较快 。本研究通过
对云南真藓和细叶真藓及相关的真藓科植物的ITS
序列进行比对分析表明，ITs区对属下种间水平分
类鉴定上可以提供有价值的信息资料。
黎兴江等(2006)对云南真藓及细叶真藓形态学
比较研究发现，云南真藓“植物体明显粗壮，叶在茎
上密集-hlzN ，叶细胞明显小于细叶真藓 ，且叶边缘无
明显的分化”。作者通过对两者配子体 的形态观察
据上述形态学研究并结合 ITS序列数据分析结果
支持黎兴江等(2006)的观点，因此，云南真藓与细叶
真藓应分别是两个独立的种。
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