全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(4)：537— 540 2OO9年 7月
重组水母发光蛋白及其在植物
钙离子信号检测中的应用
郝小花1，张国增2
(1．湖南文理学院 生命科学系，湖南 常德 415000；2．河南大学 生命科学院，河南 开封 475000)
摘 要：重组水母发光蛋白作为检测植物细胞钙信号的手段是近十几年发展起来的新方法，该文介绍了重组
水母发光蛋白作为 CaZ+检测探针 的发展过程、测钙原理 、Ca +浓度检测方法、Ca2+浓度换算方法、优点与不
足 、及在植物细胞钙离子信号检测中的研究进展。并利用国外实验室提供的方法在国内首次得 出冷激条件下
植物细胞内细胞质中([Ca + cyt)和液泡膜附近([Ca +]md)钙离子浓度动力学变化曲线。
关键词：重组水母发光蛋白；钙浓度换算；[ca +] t；钙信号
中图分类号 ：Q945，Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2009)04—0537—04
Recombinant aequorin
l ● J ■ ● ●
applicaUon in measurlnR
luminous protein and its
calcium signal of plant cell
HAO Xia()_Hua1，ZHANG Guo-Zeng2
(1．De户口rtment ofLife Sciemes，HunanA andScienceColege，Changde 415000，China；
2．Department of 1．ife Sciences，Henan University，Kaifeng 475000，China)
Abstract：Recently，the application of recombinant aequorin luminous protein has appeared in measuring calcium signal
of plant cell as a new method．This paper introduced mainly the development of the recombinant aequorin luminous
protein as a probe，the principle and operates method of measuring calcium concentration，and how tO conversion the
calcium concentration．It summarized the advantages and deficiencies of the protein，and collected mainly the progress
in development studies in measuring calcium signal of plant cel1．Meanwhile，using the method provided by other la—
boratory，the authors got the cold shock kinetics of Eta2+]cyt and[Ca外]md for the first time．
Key words：recombinant aequorin Iuminous protein；conversion tO the calcium concentration；[Ca +]哪；calcium signal
Ca抖作为普遍的第二信使在细胞信号转导过
程中起着非常重要的作用(孙大业等，2001；常芳等，
2005)，而人们对 Ca抖在信号转导中作用的认识 ，则
很大程度上取决于[Ca抖] 。测定技术的发展(郭神
等，2003)。最近 十几年来 出现 的新 型探 针有 Ae—
quorin(水母 发光 蛋 白)，yelow cameleon 2．1等
(Sanders等，1999)。而 Aequorin发展 最快也最受
人们的关注。Aequorin作为检测钙离子新型探针
的使用，极大地推动了人们对 Ca。 在细胞信号转导
过程中作用的认识进程。十几年来，国内外取得了
众多令人瞩目的成果。在钙离子信号研究过程中，
水母发光蛋白得到了广泛的应用，迅速地使钙离子
信号传导网络的研究打开了新的局面。
1 水母发光蛋白的发现及早期应用
Shimomura等(1962)首先从维多利亚多管水
母 (Aequorea victoria)中分离 出一种蛋 白(aequor—
in)，该蛋白在无氧情况下可以发射出波长为 469
rim的蓝色光。与荧光素酶不同的是，该蛋白发光
收稿日期 ：2008—03—24 修回日期 ：2008—09—17
基金项目：湖南省自然科学基金(06JJ50042)[Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province(06JJ50042)]
作者简介：郝小花(1979一)，女 ，河南巩义人，硕士 ，主要研究方向为植物生理与分子生物学 ，(E—mail)yybxiaohua@163．tom。
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时不需要低分子量的有机物质做为底物或者辅助因
子 ，所以当时被称为光蛋白(photoprotein)。后来的
研究发现光蛋 白是由约 22 KD的脱辅基水母发光
蛋白(apoaequorin)、氧分子和辅基腔肠荧光素(CO—
elenterazine)三部分形成的复合物。其中脱辅基水
母发光蛋白由 189个氨基酸组成 ，具有 3个 Ca。 结
合的 EF hand结构。腔肠荧光素(coe1enterazine)
是一个分子量约 400 Da的疏水基团 ，它可以自由穿
越细胞膜。当3个 Ca。 与水母发光蛋白结合后，引
起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键
破裂 ，腔肠荧光素被氧化为 coelenteramide，并释放
出C0 和一个质子，同时放出波长为 469 nm的蓝
色光。即：
Aeq glO r i n— ： — Apoaequorin+coedente rami de+CO2+I i ght
!! I
(slow)
(Charbonneau等，1985)。
此发射光可以通过生物发光仪来进行检测 ，反
应的速度取决于 Ca。 的浓度 。当 Ca 的浓度足够
高时(大于 100 t~mol／L)，反应速度达到最快 ，所有
的水母发光蛋白都发生反应并释放出质子，同时发
出波长为469 am的蓝色光。当 Ca抖浓度较低时，
则仅有部分水母发光蛋白发生反应。
此外，水母发光蛋白不能渗透通过完整细胞的
细胞膜 ，因此早期实验 中所用的水母发光蛋 白是从
水母中提取出来 ，通过显微注射的方法将水母发光
蛋白注射到细胞内，用来监测细胞内 Ca 的动态平
衡 (Shimomura，1997)。1967年 Ridgway& Ash-
ley(1967)就首次将纯化 的水母 发光蛋 白显微注射
到动物细胞中，并检测到了肌纤维细胞中钙信号的
瞬时变化。但该方法对实验技术要求较高，因此限
制了水母发光蛋白的应用。在此后 2O年间，其应用
仅限于从水母 中提取、纯化发光蛋 白，并显微注射到
细胞内用以研究感兴趣的钙信号。
2 水母发光蛋 白的 cDNA 克隆及
体外表达
1985年，Prasher等(1985)从维多利亚多管水
母中克隆并分离出了脱辅基水母发光蛋白的 cD—
NA，并将其在大肠杆菌中表达，再孵育可自由穿越
细胞膜的辅基腔肠荧光素后，腔肠荧光素和脱辅基
水母发光蛋白可以重组成有生物活性的水母发光蛋
白，此次发现为水母发光蛋 白的广泛应用打下了坚
实的基础 。
由此 ，水母发光蛋白在多种细胞类型(哺乳动物
细胞、植物、酵母等)中得到表达，产生脱辅基水母发
光蛋 白(Inouye等，1986；Rizzuto等 ，1992)。检 测
细胞内 Ca抖浓度变化时 ，将腔肠素加入到细胞溶液
后 ，腔肠素 自由穿过细胞膜进入细胞与细胞内翻译 、
表达的脱辅基水母发光蛋白组合 ，形成功能性 的水
母发光蛋 白，上述过程称为重组(recombinant)。水
母发光蛋 白和腔肠素重组后就可以检测不同刺激条
件下细胞中Ca。 浓度的瞬时变化。
Knight等(1993)用体内重组实验证明 2 t~mol／L
的腔肠素黑暗过夜处理烟草和没处理的烟草相比腔
肠素对烟草不产生毒性 。而且不断的研究发现，水
母发光蛋白能忍受一定范围高、低温的刺激，44℃
时水母发光蛋白仍保持稳定状态，但是 5O℃约
44 的水母发光蛋 白被破坏 ；0℃的低温不影响水
母发光蛋 白的生物活性。异博定 、La、Ga、EGTA、
TEA的处理对 于拟南 芥也不会造成伤害 (Knight
等，1997)。
此后，人们相继应用水母发光蛋白这一测钙手
段测定了拟南芥烟草大豆等多种植物细胞在感受外
界不同的刺激过程中细胞质内的钙信号情况。研究
表明，机械(或 吹拂 、激烈摇晃 、震动)触摸、低 渗胁
迫、冷热冲击 、有氧和无氧胁迫、盐渍和干旱都可导
致[Ca ] 水平快速而短暂的变化。变化的持续时
间对每种信息而言是特有的，不同的[-Ca抖] 变化
引发不同的生理反应。从而确立了水母发光蛋白在
检测植物细胞钙信号中的地位。
钙离子浓度的换算
水母发光蛋 白一旦和 Ca 反应 即丧失发光功
能，因此当一部分水母发光蛋白与 Ca。 反应时，被
消耗水母发光蛋 白的发光强度能反映出 Ca抖浓度
变化，而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与
Ca抖浓度 之间存在 一种线形关 系 (Knight等，
1997)。因此通过生物发光仪检测水母发光蛋白发
光强度就可以换算出Ca。 的相对浓度(Cobbold&
Rink，1987)。换算公式为：pCa：0．332588(一logk)
+ 5．5593
K是一个常量，即每 秒种记录的发光总和
4期 郝小花等：重组水母发光蛋白及其在植物钙离子信号检测中的应用 539
(Knight等 ，1991)。 由此，人们可 以得到直观的相
对钙离子浓度 ，单位为微摩尔(~mol／L)。生物发光
仪的检测一般可设定为每秒记录 5次 ，按照预测的
细胞反应时间，记录相应的时长 ，得到原始数据。目
前，国内已有计算机专业人员将此计算方法编写程
序可对输出的大量原始数据进行快速的批量处理。
4 细胞内定位表达及新应用
作为一个蛋白质，加上特异性的靶序列后，这种
重组蛋白可以精确地在细胞内定位，这是人们对水
母发光蛋白感兴趣的另一个重要原因(Haley等，
1995)。用这种方法，可将水母发光蛋白定位于细胞
内不同部位，成为研究 Ca 信号时空复杂性的新
工具 。
Knight等(1991)构建了表达脱辅基水母发光
蛋白定位 于细胞 质的质粒 pMAQ。并得 到了转化
的烟草(Nicotiana plumbaginifolia)植 株，利用 转
基因植物报告了触摸、冷休克和真菌激发子等因子
刺激时细胞质中Ca。 浓度的变化。而且该实验也
证明2#mol／L的腔肠荧光素过夜处理烟草，对烟
草也不会产生毒性。
1996年，Knight等(1996)又构建了表达脱辅基
水母发光蛋 白定 位于液 泡的细胞 质面 的质 粒
HVA1—2．2，并检测得 到了冷刺激下细胞质 中钙离
子浓度的变化 ，得到了液泡膜 附近钙离子浓度变化
的动力学曲线。
本文利用 Heather Knight教授提供的载体，通
过 Floral dip法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)
野生型 Columbia(col—O)，获得在细胞质中和液泡膜
附近特异表达脱辅基水母发光蛋 白的植株。参照文
献提供的方法(Cobbold& Rink等，1987；Knight
等，1996)，得到了冷刺激 (cold shock)下细胞质和液
泡膜附近钙离子浓度变化的动力学曲线(图 1)(此
实验在河南大学植物逆境生物学实验室完成)。
水母发光蛋 白能进行选择性的定位 ，因此该方
法明显优于利用 Ca。 荧光染料的方法标定 Ca +浓
度。目前水母 发光蛋 白已被成功定位于细胞核
(Pouly等，2001)、叶绿体(Sai&Johnson，2002)、细
胞外基质(Gao等，2004)及植物液泡的细胞质面
(Knight等，1996)。并已得到转化植株。通过对这
些转化 植株 的研 究，证实 细 胞器 能 和 特异 的
[Ca抖] 信号结合。
水母发光蛋白还能用来连续几周测定[-Ca ] ．
的变化。比如，查到在白光和红光下[Ca ] 的节
奏性震荡 ，在黑暗下消失；相反 ，叶绿体中 Ca。 的节
奏性震荡却始于黑暗开始时。细胞内两个不同部分
[-Ca。 ]的差别可能是形成光周期机理的基础。此
外，利用水母发光蛋检测 Ca。 浓度变化可在整体水
平进行，也可在任何类型的细胞中进行。
： S
呈
艇
2 0
5
0
5
0 O
0 20 40 60
时间 Ti me(S)
80
图 l 冷激条件下，细胞质(CYT)中、液泡膜附近(MD)钙
离子浓度变化动力学曲线 (每个结果重复 5次以上)
Fig．1 [Ca。+]。yt and[Ca +] Cold Shock Kinetics
(Traces are averages of five individual seedlings)
2000年，Knight利用水母发光蛋白的细胞内特
异表达载体(Kiegle等，2000)转化拟南芥，从而得到
在拟南芥根的表皮、表皮和皮层伸长区、内皮、中柱
鞘等部位定位表达脱辅基水母发光蛋白的植株，在
一 定的刺激条件下，得到不同的钙离子浓度变化的
动力学曲线，证实对于一定的刺激，不同类型的细胞
反应也不 同。
水母发光蛋白除在检测植物细胞内钙离子浓度
方面有很大的应用和发展之外，在其它方面的应用
也十分广阔。以前因为技术困难，很少有人注意植
物细胞信号传导过程中线粒体钙离子的作用。2003
年，David等(2003)通过能稳定表达水母发光蛋白
的拟南芥，并定点到线粒体中以用于研究分析植物
线粒体中钙离子变化和揭示[-Ca ] 的独立调节。
同样，钙离子信号途径在丝状真菌中的情况了解得
非常少。2004年，Nelson发展了一种基于重组水母
发光蛋白的方法来进行此研究(Nelson 8L Kozlova，
2004)。通过密码子优化，已得到高水平表达水母蛋
白的 Neurospora crasstl，Aspergillus niger和 As-
pergillus awamori菌株 。
2007年，舒柏华等(2007)利用水母发光蛋白生
物发光分析技术建立了一种 PCR产物定量检测技
术。实验证实，该定量检测技术是一种灵敏的、可靠
540 广 西 植 物 29卷
的 、非放射性的基因微量定量方法 。
5 优缺点及展望
对于植物细胞而言，叶绿体有 自发的荧光 ，同时
植物体内也存在其它微弱荧光。但这两种荧光的强
度与植物体内重组的水母发光蛋 白的发光强度相比
非常微弱，对于应用水母发光蛋 白检测细胞 内 Ca抖
浓度的变化不会产生太大干扰(Knight等，1993)。
将水母发光蛋白转入到植物中，获得细胞 内稳定表
达水母发光蛋 白的转基因植 物，可以在整体水平上
简便而快 速地 测定细胞 内 Ca。 浓 度的瞬间变化。
避免了以原生质体为材料的诸多不便，同时也使实
验得以在更接近 自然状态的情况下进行 。
重组水母发光蛋白之所以在测定植物细胞钙信
号中得到广泛应用 ，主要是 因该 方法有 以下优点 ：
(1)对细胞无伤害，不影响其正常的生长发育；(2)不
外泌，不在细胞内区室化或凝集，能在较长时间内检
测钙离子信号；(3)不需激发光源，因而消除了细胞
自发荧光的干扰；(4)加信号肽后能准确定位。因
此，在钙离子信号研究过程中，水母发光蛋白迅速得
到广泛应用，并极大地推进了钙离子信号研究进程。
在试验过程中，也存在一些问题 ，虽然水母发光
蛋白可以在植物体内广泛或选择性表达，但腔肠荧
光素的过膜渗透可能不太理想。腔肠荧光素可能很
难进入深层组织细胞，对 Ca 浓度的检测可能存在
一 些影响。同时，由于细胞壁的物质障碍，使得植物
表层 2～3层以下细胞发出的荧光无法测量，发光读
数主要来 自于表层细胞 (Rizzuto等 ，1992)。因此 ，
也有研究者利用悬 浮培养的细胞进行试验，并证明
螫合细胞外的钙离子可以诱发细胞内钙库钙离子的
释放(Stephen等 ，2001)。同时，aequorin也还存在
其它的一些不足 ：(1)需预先与发光辅基进行重组 ；
(2)测钙过程中发光辅基为不可逆消耗 ；(3)产生的
光信号较弱需要用高灵敏度的生物发光仪检测；(4)
不适用于单个细胞中钙信号的研究。
对于辅基腔肠素来说，目前除了标准的腔肠荧
光素外，还合成了几种腔肠荧光素的类似物：h—CO—
elenterazine、ip—coelenterazine、coelenterazine 18及
e—coelenterazine(Knight等，1991)。这些腔肠荧光
素类似物重组的半合成水母发光蛋白具有不同的光
发射特征和Ca 敏感度(Shimomura等，1993)。从
理论上看，这些半合成的水母发光蛋白具有更大的
Ca 浓度应用范围和测量准确度。但实际上，半合
成的水母发光蛋 白缺少稳定性且量子产率明显低于
天然的水母 发光 蛋 白，因此 限制 了其应用 (Shimo—
mura等，1993；Montero等，1997)。
通过水母发光蛋白基因与细胞特定区域定位信
号构建的重组基因和在植物体内重组表达，使该技
术既能检测细胞质内钙离子的变化 ，又能准确定位
到大多数的亚细胞结构等细胞器 ，进而检测这些细
胞器中的钙离子变化。这对植物细胞钙信号的局部
与整体变化的研究无疑是一个推动，大大促进了植
物细胞钙信号的研究进程 。在其它方面，如舒柏华
等利用水母发光蛋白与 PCR相结合，建立的 PCR
产物定量检测技术就是在新领域的新发展。但一段
时间内，水母发光蛋白还需一定的改进和完善。
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(下转第 501页 Continue on page 501)
4期 李志刚等：割手密茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化 501
甘蔗种茎尖生长锥的微管列阵已经发生了很大的变
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