全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(4)：627—632 2007年 7月
白木香悬浮培养细胞中2一(2一苯乙基)
色酮化合物的诱导形成
何梦玲1，2，戚树源2，胡兰娟
(1．广东药学院 中药学院，广州 510224；2．中国科学院 华南植物园，广州 510650)
摘 要：白木香是我国生产沉香的唯一植物资源，为研究其中次生代谢产物的生物合成，从国产沉香中分离
并鉴定了4种已知的2一(2一苯乙基)色酮化合物，实验中以此作为标准品，以白木香根悬浮培养细胞为材料，黄
绿墨耳真菌提取物为诱导子，首次在组织培养物中成功诱导了2-(2-苯乙基)色酮化合物的产生，为研究中药
沉香活性成分 2一(2一苯乙基)色酮化合物的生物合成建立了一个试验体系。
关键词：沉香；黄绿墨耳真菌；2-(2一苯乙基)色酮；白木香
中图分类号 ；Q946 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2007)04—0627—06
Inducible formation 0f 2-(2-phenylethy1)chromones
● ■ ■ ● l J n ● ●■ ● ● ●
in ca儿 SllSDeIlSl0n cultu】 Ot Aqutlana slnensls
HE Meng-Ling ，QI Shu-Yuan2，HU Lan-Juan2
(1．Department of Chinese Traditional Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510224，China；
2．South China Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：Aquilaria sinensis is the only species of Aquilaria in China for agarwood resources and has been recorded
as endangered plant since 1992．The present dissertation was undertaken tO study the inducible formation of the see—
ond metabolites in A．sinensis．Four 2-(2一phenylethy1)chromones existed in agarwood were identified．For the first
time，fungal extracts of Menanotus flavolivens elicited the production of these chromones in cel suspension culture of
A．sinensis，whereas they were not existing in normal condition．And a cell suspension culture system of A．sinensis
was established．
Key words：agarwood；Menanotus flavoliven：2-(2一phenylethy1)chromone；Aquilaria sinensis
白木香(Aquilaria sinensis)，又名土沉香，为瑞香
科沉香属植物，是我国特有的珍贵树种，也是我国生
产沉香的唯一植物资源，现已被列为国家濒危保护植
物(中国科学院植物研究所，1992)。沉香是我国、日
本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和名贵
的天然香料，其性辛 、苦，微温，能行气止痛、温中止
呕、纳气平喘(国家药典委员会，2000)。商业上的巨
大利润和非法贸易正导致世界各地的沉香越来越少。
WWF(世界野生生物基金会)和 IUCN(国际自然与自
然资源保护联合会)已提出报告，敦促沉香出口国关
注与沉香管理、贸易控制相关的问题，以保护这种古
老并极具经济价值的资源。
2一(2一苯乙基)色酮类化合物是中药沉香的活性
成分(杨峻山，1998)。沉香是由于白木香木材组织受
伤或感染真菌形成的。华南植物研究所发现黄绿墨
耳真菌(Menanotus flavolives)感染白木香木材伤口
收稿日期：2005—11—2O 修回日期：2006-08-13
基金项目：国家自然科学基金(30070066)；广东省tl然科学基金(000974)；广东药学院课题(43548008)[Supported bytheNational Natural Science
Foundation of China(30070066)；Natural Science Foundation of Guangdong Pro~nee(000974)；Foundation of Guangdong Pharmaceutical University
(43548008)]
作者简介：何梦玲(1975一)，女，广东梅州人，博士，讲师，主要研究方向：植物组织培养和次生代谢，(E-mail)hmldf@hotmail．eom。
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628 广 西 植 物 27卷
后能加速沉香的形成(广东省植物研究所，1976)。沉
香中的化学成分主要有两大类：倍半萜类化合物和色
酮类化合物，且健康的白木香木材中未检出色酮化合
物。Yoshi等(1978)首次报道从沉香(A．agalocha)
中分离和鉴定一个命名为“agarotetrol”的 2一(2一苯乙
基)色酮化合物，近 lO年来先后在沉香属植物中发现
近 3O种具有 2一(2一苯乙基)结构的色酮类衍生物(Qi，
1995)。Picker等(1976)从芸香科巨盘木属的一个澳
大利亚种(Flindersia laevicarpa)的树皮和树叶中、
Wang等(2001)从禾本科的白羊草(Bothriochloa isch—
a6qnum)中也分离得到这种具有 2-(2-苯乙基)结构的
色酮化合物，此外，未见报道其它植物分离到该类化
合物，这是一种新结构类型的稀有的色酮类化合物，
其合成途径或生源途径未见报道。
本文以白木香根悬浮培养细胞为材料，试验了黄
绿墨耳真菌提取物对悬浮培养细胞中色酮化合物的
诱导生成作用，为进一步研究 2一(2一苯乙基)色酮化合
物在白木香中的生物合成提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 2-(2-苯乙基)色酮化合物的鉴定
参照林立东等(2000)的方法，国产沉香 5 kg打
粉，用 95 9，6乙醇提取，提取液浓缩后 ，用 5 Na。CO。
溶液皂化，再用乙醚提取，提取液浓缩后得中性部分
浸膏。经反复硅胶层析分离，以石油醚一乙酸乙酯
梯度洗脱和制备 TLC分离、重结晶。
1．2 2-(2-苯乙基)色酮化合物 HPLC分析方法
配制色酮化合物 l#、2#、3#、4#的标准甲醇
溶液，浓度分别为 0．7、0．6、0．8、0．65 mg／mL，精确
量取 lO、25、50、100 L标准液混合后稀释至 200
L，浓度较大者自然挥发至干后定容至 200 L，加
上原液共组成 5个浓度梯度，进样 2O L，依色谱条
件分离，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线
性回归，重复 3次。结果表明，四种色酮化合物在此
范围内峰高与样品浓度呈良好线性关系。4个线性
回归方程分别为：色酮 l#：Y一48．959X一820．55，r
一0．997 4；色酮 2#：Y一55．16lX一939．94，r一
0．980 3；色酮3#：Y一12．494X+28．943，r一0．997 9；
色酮 4#：Y一42．126X+648．54，r一0．998 3。
精密度试验：吸取上述标准液 2O L依色谱条
件进行分析，重复进样 3次，所得数据进行统计分析
后，求得四种色酮化合物的相对标准偏差 RSD分别
为：4．5 9，6、4．4 9，6、3．3 9，6和 4．6 9，6。
1．3细胞系及培养方法
愈伤组织的诱导：实验室培养的白木香无菌苗，
剪取 l～2 cm长的根，接入愈伤组织诱导培养基
MS+BA0．5+NAA2．0中，诱导愈伤组织的产生，
并在同样的培养基内每 3周继代一次。诱导得到的
愈伤组织系为 A 细胞系。
悬浮培养体系的建立：培养3～4代的疏松愈伤
组织，取处于对数生长期的长势较好、结构较疏松的
细胞接入培养液(为不加琼脂的愈伤组织诱导培养
基)，建立悬浮培养细胞系，每 10 d继代一次。
培养条件：500 mL三角瓶，内加 150 mL培养
液，用无菌培养容器封口膜封 口，接种后 120 r／min
摇床上黑暗培养，温度(26±1)℃，继代培养 2代以
上作为种子，试验时接种于装有 8O mL新鲜培养基
的 250 mL三角瓶中。
生长曲线的测定：将种子细胞接种于 150 mL
三角瓶内，5O mL培养液／瓶，接种密度为 100 g／L，
每3 d收获一次；做加真菌的细胞生长曲线时，在细
胞培养第 7天加入无菌 的黄绿墨耳真菌提取物
(MFFE)，其他和一般生长曲线的测定一样，细胞抽
滤后在 6O℃烘干至恒重，称重，做成生长曲线，实验
重复 3次，取平均值，所有培养均为暗培养(下同)。
1．4真菌的培养及提取液的制备
黄绿墨耳真菌培养：黄绿墨耳真菌购自中国科学
院微生物研究所菌种保藏室。菌种于 4℃冰箱中保
存，每 2～3个月继代一次。欲制备提取液的真菌在
马铃薯培养液中静置黑暗培养3周，温度(26±1)℃。
马铃薯液体培养基：每l 000 mL 2O 马铃薯汁
中含葡萄糖 20 g、磷酸二氢钾 3 g、7水硫酸镁 1．5
g、维生素 B10．06 mg，调整 pH 至 6．0，每 500 mL
三角瓶中分装 8O mL培养液，高压灭菌锅中121℃
下消毒 20 rain。
黄绿墨耳真菌提取液 (fungal extracts of M_
flavolivens，MFFE)的制备：收获的菌丝体经水洗
后，在 6O℃烘干至恒重，打粉称重，加 5倍量的蒸馏
水 100℃回流 1．5 h，抽滤收集上清，渣再加 3倍量
的蒸馏水100℃回流 l h，抽滤，合并两次上清，在水
浴上蒸发至干，得到浸膏状真菌提取物，称重。
1．5黄绿墨耳真菌提取液对白木香悬浮培养细胞中
2-(2-苯乙基)色酮化合物的诱导产生
在 A 悬浮细胞培养的第 7天，加入无菌的
MFFE进行诱导，于黑暗中继续培养 ll d收获。收
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4期 何梦玲等：自木香悬浮培养细胞中2一(2一苯乙基)色酮化合物的诱导形成 629
获的细胞按图 1的方法分离提取 ，取 中性部分进行
HPLC分析和 LC-MS检测。
悬浮培养细胞
l抽滤
50~C 烘干至恒重
I称定重量
倒A5OraL磨13具塞三 角瓶
I加入1 0mL二氯甲烷浸泡24h
过滤
— —
滤 液 滤渣
l 10mL二氯甲烷谩艘4h
I厂
合 一 触
1／3量Na0H萃取3次
— — — — — — —
NaOMfil~分 二氯甲烷部 分
— — — — — 甲烷洗涤。次I ————] l
Na0H部分 二氯甲烷部分— l
用e 一 调整。一至s—e
1／34二氯甲烷萃取3次 1／3量蒸馏水洗涤3次
二氯甲烷部分 加 无水硫酸钠干燥过夜
加无水硫酸钠干燥过夜
旋转蒸发回收溶剂至3- 旋转 蒸发 回收溶剂至干
~]1]0．5mL甲醇溶 解
图 1 样品提取方法
Fig．1 Extractive methods of samples
LC-MS系统包括 PE200高效液相色谱仪和 ABI
公司的API 2000质谱仪，配置 Turboion Spray离子源
( )，色谱柱 Nova-Pak(Waters)C18，150 Inrn×3．9
mm(i．d．)×4 m，流动相为甲醇 ：水(6O：40)，流速
0．7 mL／min。试剂：均为分析纯，色谱为色谱纯。无水
硫酸钠在使用前于烘箱中100℃下烘2 h后使用。
1．6色酮含量的 HPLC测定
提取溶液均为分析纯；色谱用甲醇为色谱纯，色
谱用水为双蒸水。
HP1100高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱柱
Kromasil—C18(250 mm×4．6 mm，d5 m)。柱温室
温，流动相甲醇一四氢呋喃一水(50：5；55)，流速：
0．8 mL／min，检测波长 210 nm。
样品测定：将中性部分加入 0．5 mL甲醇，旋涡
混匀器混匀，用滤膜(孑L径 0．25 m)过滤后备用。
每次进样 20 L，记录峰高。
2 结果与讨论
2．1 2一(2一苯乙基)色酮化合物的鉴定
得到下列 4个色酮化合物：色酮 1#：6，7-二甲
氧基一2一[2一(4 一甲氧基苯)乙基]色酮(R 一R：一R 一
OCH。；R。一H)；色酮 2#：6，7--甲氧基一2一(2一苯乙
基)色酮(R =R2一OCH。，R。一R 一H)；色酮 3#：
6一甲氧基一2一[2一(3，一甲氧基苯)乙基]色酮(R：一R。一
OCH。，R 一R =H)；色酮 4#：6一甲氧基一2一(2一苯乙
基)色酮(R2一OCH ，R 一R。=R 一H)。
R1
R2
R3
O
R4
它们的 H-NMR和 C¨-NMR数据见表 1，其结
果与文献一致(Hashimoto等，1985；Nakanishi等，
1986；宋振玉，1997)。
2．2 MFFE对 A 细胞生长的影响
真菌诱导子(fungal elicitor)是来源于真菌的一种
确定的化学信号，在植物与真菌的相互作用中，它们
可以快速、高度专一和选择性地诱导植物细胞中特定
次生代谢物的形成和积累。由于植物次生代谢物常
具有重要的医药和经济价值，近 2O年来，国内外在植
物组织和细胞培养中利用不同的真菌诱导子提高目
的次生代谢产物产量的研究至今仍是一个热点(Di—
Cosmo等，1985；Eilert，1987；Dixon等，1986，1990；宁
文等，1993)，如真菌诱导物可促进异黄酮类、萜类和
某些生物碱类次生代谢产物的合成(Eilert，1987)。
由图2看出，未添加 MFFE的白木香正常悬浮
培养细胞中是没有色酮化合物的产生的，这一点和
戚树源等在白木香植物上直接实验的结果一致(戚
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630 广 西 植 物 27卷
树源等，1998，2OOO)。由图 3看出，白木香正常悬浮
培养细胞的生长曲线呈近似的“S”型。即按逻辑生
长模型(Logistic Growth Mode1)进行增殖生长，此
生长曲线可大致分为 3个时期：延迟期(O～3 d)，指
数生长期(3～l5 d)，静止期(15～18 d)。而在培养
第 7天添加了MFFE的细胞生长曲线却有所不同。
表 1 四种色酮化合物 1#、2#、3#、4#的氢谱和碳谱数据
Table 1 1H—NMR and 13C—NMR data of ehromone 1#，2#，3#，4#
碳 Carbon 1# 2#
8H 8r 8H
3# 4#
6．38，1H(s)
7．52，1H(s)
7．12，1H(s)
2．92，2H(m)
3．O0，2H(m)
7．10，1H(s)
6．81～6．83，3H(m)
3．78，3H(s)
3．98，3H(s)
4．O0，3H(s)
169．0
108．5 6．07，1H(s)
177．3
103．9 7．47，1H(s)
148．2
155．6
99．6 6．82，1H(s)
153．4
117．O
32．3
29．3
131．4
129．2
114．1
158．3
114．1
129．2
55．3
56．5
56．6
2．87，2H(dd，J=
7．2，8．4 Hz)
3．01，2H(dd，J=
7．2。8．4Hz)
7．15～7．28，5H(m)
3．92，3H(s)
3．95，3H(s)
167．4
1O9．5
177．4
104．2
6．23，1H(s)
7．55，1H (d，J=
3．0 Hz)
147．3
154．1 7．19，1H(m)
99．5 7．38，1H(d，J=
9．1 Hz)
152．4
116．9
35．9 2．95，2H(m)
168．O
109．1 6．2O，1H(s)
178．2
104．7 7．55，1H (d，J=
3．0 Hz)
157．O
123．9 7．2O，1H(m)
119．3 7．38，1H (d，J=
9．1 Hz)
151．5
124．2
36．1 2．93，2H(m)
33．0 3．04，2H(m) 33．1 3．04，2H(m)
139．7
128．5
128．2
126．4
128．2
128．5
56．2
56．3
7．27，1H(m)
6．74～6．78，3H(m)
141．2
114．1
159．8
111．8
129．7
12O．6
55．2
55．9
7．2O～7．29，5H(m)
3．89，3H(s)
169．O
1O9．2
178．2
104．7
156．9
124．O
119．3
151．4
124．O
36．1
33．0
139．6
128．6
128．2
126．6
128．2
128．6
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一
唰
珀
屠
咀】
图 2 MFFE对细胞中色酮化合物产生总量的影响
Fig．2 Effects of MFFE on total contents
of ehromone in cell
从图上看，细胞干重几乎无增殖，说明作为诱导子的
MFFE，对细胞生长有较强的抑制作用。
诱导子能引发植物细胞中次生代谢产物合成关
键酶的基因表达(Roberts等，1997)，同时它的加入
也会导致细胞生长的抑制和细胞活性的丧失(Wang
等，2001)，这一点在我们的研究中也得到了证实。
O．1 6
O 3 6 9 12 15 18 21
培养时间 CuIture time(days)
图 3 MFFE对 AR细胞生长的影响
Fig．3 Effects of MFFE on the growth of AR cell
2．3细胞中 2-(2-苯乙基)色酮化合物的分离鉴定
在加入 MFFE的培养细胞中分离和检测出了
四种色酮化合物，通过 HPLC分析和 LC—MS鉴定，
这四个色酮化合物与四个标准化合物的 HPLC保
留值和LC．MS的碎片信号(图4)一致。
药材沉香中存在两种主要的成分——倍半萜类
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O O O O O O
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4期 何梦玲等：白木香悬浮培养细胞中2一(2一苯乙基)色酮化合物的诱导形成 631
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图 4-a 四种标准色酮中 1#与 4#的 LC-MS图谱
Fig．4-a LC—MS data of chromone 1# and 4#
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m／z．anu
图 4-b 样品中 1#与 4#色酮的 LC—MS图谱
Fig．4-b LC-MS data of chromone 1# and 4#
化合物和2一(2一苯乙基)色酮化合物，沉香的品质主
要由这两类化合物决定。黄绿墨耳真菌是诱导白木
香植物产生沉香的真菌，感染真菌后的白木香植物
最先产生的化合物就是此类色酮化合物(戚树源等，
2OOO)，而健康的白木香木材和未经诱导的悬浮培养
细胞中都不能检测到色酮化合物，这些结果说明色
酮化合物是白木香细胞在逆境状态下重新合成的次
生代谢产物，而且白木香细胞的次生代谢物合成机
制与白木香整体植株组织薄壁细胞的次生代谢物合
成机制(Yu等，198O)是相似的。
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632 广 西 植 物 27卷
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图 4-c 四种标准色酮中2#与3#的LC—MS图谱
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图 4-d 样品中2#与 3#色酮的LC-MS图谱
Fig．4-d LC-MS data of chromone 2# and 3#
本研究中，黄绿墨耳真菌是从沉香木材中分离
出来的，生产实践已经证明这种真菌能诱导沉香的
生成，而且到目前为止，还没有任何其他的文献报道
此种真菌可以诱导其他代谢物的合成，也没有任何
文献报道其他真菌可以诱导沉香的合成。因此就目
前的试验结果来看，我们认为黄绿墨耳真菌可能是
专一诱导白木香产生沉香的诱导物。
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