全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(2)：269— 272 2008年 3月
拟南芥细胞异三聚体 G蛋白的分离纯化
谢 虹，杨飞武，郭 莹，梁建生
(扬州大学 生物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)
摘 要：以拟南芥哥伦比亚 Columbia(Col—O)野生型悬浮培养细胞为材料，采用超声波破碎、匀浆、离心、4O
～ 6O 饱和度硫酸铵分步沉淀 、Sephadex G-25脱盐 、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换、Sephadex G-200
凝胶过滤，最后经过 Sepharose CL-6B得到纯化的目的蛋白，蛋白收率为0．097 。纯化的蛋白质经非变性聚
丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定显示为一条带，经 Western blotting证实为 G蛋白。把经 Native—PAGE鉴定的蛋白质
的条带回收，进行SDS—PAGE显示有 3条带。一条是 Ga亚基，其分子量为60kDa左右；另外 2条带分子量为
45kDa和 35kDa，可能是 p、7亚基，初步证实拟南芥中存在异三聚体 G蛋白。G蛋白提取方法的建立为在基
因突变型拟南芥中G蛋白功能的研究奠定基础。
关键词：拟南芥；异三聚体 G蛋白；亚基；纯化
中图分类号 ：Q946．1 文献标识码 ；A 文章编号 ：1000—3142(2008)02—0269—04
Separation and purification of G proteinOt
from Arabidopsis thaliana
XIE Hong，YANG Fe卜Wu，GUO Ying，LIANG Jian-Sheng
(Colege of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)
Abstract：G protein was purified from the suspended cultured wide-type cell of Arabidopsis thaliana(Col—O)by ul—
trasonic fragmentation，homogenization，centrifugation，40 ～ 6O saturation Ammonium sulphate sedimentation，gel
filtration(Sephadex G-25，Sephadex G-200，Sepharose CL_6B)and DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chro—
matographer．The result identified by non-denatured PAGE showed one band in the gel and W estern blotting analysis
confirmed that the protein was G protein．The target protein after Native_PAGE was collected，and it displayed three
bands after SD PAGE．The first band was Q subunit，and its MW was about 60kDa．The second and third bands
which were 45kDa and 35 kDa，were presumed tO be the p and 7 subunits．The purification method of G protein wil
facilitate further function investigation of G protein in mutant-type cell of A．thaliana．
Key words：Arabidopsis thaliana；heterotrimeric G proteins；subunit~purification
G蛋 白(G protein／GTP binding protein)于 20
世纪 80年代首先在动物中被发现，其介导的信号转
导机理被广泛而深入地研究(Sakmar，2002)。G蛋
白由 a， ，7三个亚基组成三聚体，分子量 100 kDa
左右。G蛋白通过其亚基上氨基酸残基的脂化修饰
将其锚定在细胞膜内表面上，Ga上结合着 GDP，并
与GI]7共同构成三聚体形式(孙大业等，2001)。当
位于膜表面的受体(GPCRs)与配基结合后，受体被
活化并催化 Ga上的 GDP解离，并在同一位置上结
合 GTP导致 Ga构象变化，使 Ga与 GI]7解离，从
而各自调节胞内效应器并由后者导致一系列下游生
理生化反应。同时由于 Ga本身具有内源的 GT—
Pase活性，水解 GTP为 GDP，使 Ga变为非活化
态，与 GI]7再次结合成三聚体而完成一次信号过程
收稿日期 ：2006—08-18 修 回日期 ：2007—06—08
基金项目：国家 自然科学基金；海外杰出青年基金(30528023)[Supported bytheNationalNatural Science Foundation ofChina FundsforTalented
Overseas Young Scholars(3O528O23)]
作者简介 ：谢虹(1988一)，女，福建永安人 ，硕士研究生，讲师 ，主要从事生物化学与生物工程等教学与科研 ，(E-mail)xiehongwjn@yahoo．corn．en。
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270 广 西 植 物 28卷
(Jones& Assmann，2004)。大量研究发现 G蛋白
偶联信号转导系统是一类重要的细胞信号传导途径，
其在简单真核生物、高等动物及植物中普遍存在。G
蛋白在真核细胞膜信号的分选和扩大、蛋白质的合成
与运输、细胞骨架的形成、囊泡在细胞内的运输以及
细胞增殖及分化等方面起重要的调节作用。
虽然在植物中 G蛋 白的研究处于相对滞后阶
段，但在拟南芥的叶片和根、水稻的胚芽鞘等多种植
物细胞中检测到了G蛋白的存在。在植物体中，异
三聚体 G蛋白参与了生长发育的诸多过程，如气孔
开关、细胞 周 期 调节、根 的发育 (Ulah& Chen，
2001；Pandey& Assmann，2004)、光信号转导和光
控发育 以及病原信号 转导 (Komatsu& Yang，
2004)过程。
哺乳动物 目前发现 23种 Ga，6种 GB，12种 G7
蛋白，每个亚基都由多基因编码，从而构成多种多样
的可能组合方式。植物中仅在水稻中有报道称 a、
B、 亚基形成了类似于动物细胞中的异三聚体状态
(Kato& Mizutani，2004)，拟南芥中是否存在异三
聚体 G蛋白尚未见相关报道，大量的基因序列信息
表明可 能 只有 1种 a亚 基 (GPA1)、1种 B亚 基
(AGB1)和 2种 亚基(AGGl、AGG2)(Ellis& Mi—
les，2001)。最近对G蛋白偶联信号途径的研究显示
G蛋白Ga、Gt?和G7三个亚基间的相互作用对阐明
其信号转导机理至关重要，而研究亚基间的相互作
用必须先分离纯化相应的蛋白质。由于蛋白质的纯
化与序列分析难度较大，到目前为止，还很难完全纯
化一种植物异三聚体 G蛋 白。一方面人们利用己
知G蛋白保守氨基酸序列合成的寡核苷酸为探针
的方法对植物中可能存在的 G蛋白亚基的基因进
行研究；另外通过重组 G蛋白的分离纯化来研究 G
蛋白在细胞信号转导中可能的作用途径。但重组 G
蛋白在宿主细胞中表达过程中存在修饰化的缺失和
G蛋白亚基的丢失等问题。本文以拟南芥哥伦比亚
(co1)野生型悬浮培养细胞为材料，探索纯化 G蛋白
的途径，优化提取方法，为 G蛋白后续的研究做一
些基础工作。
1 材料与方法
1．1实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型 Columbia
(Col-o)种子由美国北卡立罗那大学 Alan M Jones教
授惠赠。植株生长于本实验室的温室，其悬浮培养细
胞系为叶片组织培养细胞，于冷冻冰箱 MS液体培养
基培养至一定浓度后，收集贮于一86℃。
1．2主要试剂
G蛋白a亚基(AtGPA1)抗体，是按照 a亚基
氨基酸序列合成的寡肽免疫兔子后采集的血清；
Sephadex G-25、Sephadex G一200、硝酸纤维素膜
(NC)购于 Amersham 公司 ；DEAE Sepharose Fast
Flow和 Sepharose CL-6B为 Sigma公司产品；低分
子量标准蛋白质购于中国科学院上海生物化学研究
所 ；二抗 (Goat anti Rabbit IgG—HRP)购 于上 海
Sangon公司。
1．3蛋白质浓度测定
蛋白质浓度的测定用紫外吸收法，以BSA为标
准蛋白。
1．4蛋白纯度鉴定、分子量测定和 Western blotting
蛋白纯度分别用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法
鉴定，6 分离胶。分子量测定用 SDS一聚丙烯酰胺
凝胶 ，12 分离胶 。Western blotting以 G 蛋 白 a
亚基(AtGPA1)的抗体跟踪检测 G蛋白的存在。以
上方法参照《蛋白质技术手册》(汪家政等，2000)中
的方法进行。
I．5蛋白质提取
蛋白质提取参照 Kashino(2003)和 Lehner等
(2003)的方法。称取拟南芥细胞 100 g，按 1：1(w／
v)加 入 100 mL Bufer A(含 50 mmol／L Tris，1
mmol／L EDTA，1 mmol／L DTT，0．1 mmol／L
PMSF，300 mmol／L蔗糖 ，1 mol／L NaC1，pH8．0)，
用细胞超声破碎仪于冰浴上破碎 30s×10，间隔 30
S，然后 4℃、11 000 r／min离心20 min，取上清。沉
淀在冰浴上研磨后，与上清合并，在 4℃摇床上振荡
3 h。离心弃沉淀，收集上清液 170 mL。上清液逐
步加入硫酸铵至饱和度为 40％，于冰浴上搅拌 30
min，离心弃沉淀，上清液加入硫酸铵至饱和度为
60 ，于冰浴上搅拌 30 min后，离心收集沉淀。沉
淀用 尽 量 少 的 Buffer B(含 50 mmol／L Tris，1
mmol／L EDTA，5 mmol／L巯基 乙醇，0．1 mmol／L
PMSF，0．025 mmol／L GDP，pH8．0)溶解 后 ，上
Sephadex G一25(1．6 cm×90 cm)层析柱，量程为
2A。加入Bufer B洗脱，流速为 2 mL／min，每分钟
收集 1管。合并含有目的蛋白的洗脱液上 DEAE—
Sepharose Fast Flow层析柱(1．6 cm×50 cm)后，
先用 Buffer C(含 20 mmol／L Tris，1 mmol／L ED—
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2期 谢虹等：拟南芥细胞异三聚体 G蛋白的分离纯化 271
TA，5 mmol／L 巯 基 乙 醇 ，0．1 mmol／L PMSF，
0．025 mmol／L GDP，pH8．0)开始洗脱，流速为
0．25 mL／min，量程为 lA，再用含 0．15 mol／L NaC1
的 Bufer C(pH8．0)洗 脱 ，然 后用 含 0．3 mol／L
NaC1的Bufer C(pH8．O)洗脱，收集合并目的蛋白
溶液上 Sephadex G-2OO(1．6 cm×90 cm)，用 Buffer
B洗脱，流速为 0．25 mL／min，设定量程为 0．2 A，
每 5 rain收集 1管，合并蛋白质洗脱液进行冷冻干
燥后，用少量洗脱剂 Buffer B溶解上 Sepharose CL一
6B层析柱(1．6 crn×50 cn1)进行 纯化 。用 Buffer B
洗脱 ，流速为 0．6 mL／min，设定量程为 0．5 A，每分
钟收集 l管，合并目的蛋白。
2 结果
2．1蛋白质收率
称取一86℃冻存的 100 g拟南芥细胞 ，破碎后按
照目的蛋白的提取步骤进行，同时分别测定每一步
骤蛋白溶液的体积和蛋白质含量，测得各个步骤中
蛋白质的含量如表 l所示 。
表 1 G蛋白收率
Table 1 The recovery rate of G protein
蛋 白质样品
Sample
总体积 蛋白质浓度 总蛋白
Total Concentration Total
vo1．(mI ) (mg／mL) protein(g)
从表 l可看出，拟南芥细胞经过破碎、离心后，
溶液中总蛋白约4．108 g；硫酸铵分步沉淀除去了一
部分的杂蛋白；而 DEAE—Sepharose FF洗脱后，含
目的蛋白的溶液中蛋 白质总量只有之前的三分之
一
，这一步骤除去了大量的杂蛋 白；最后 经过 Seph—
adex G一200和 Sepharose CL一6B洗脱，纯化的蛋白
质的收率只有 0．097 。
2．2硫酸铵分步沉淀
细胞破碎后获得上清液，用 2O ～4O 、4O
～ 6O 和 6O ～8O 饱和度硫酸铵进行沉淀。经
Western blotting鉴定后结果如图 1。G蛋白主要
存在 4O ～6O 饱和度硫酸铵沉淀中。
2．3层析分离 蛋 白
样品经硫酸铵分步沉淀后，用葡聚糖凝胶 Sepha—
dex G-25脱盐以便进一步纯化，经 Western bloting
鉴定可知图2中第一峰为 G-protein所在。脱盐的蛋
白质溶液经过 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换
层析，在洗脱剂中逐渐提高 NaC1的浓度分段洗脱目
的蛋白，以除去大量的杂蛋白(图3)、两步凝胶过滤后
(图 4、5)，通过电泳鉴定 ，得到较纯的目的蛋白。
A
20％一40％ 40％一60％ 60％一80％
1．0
图 1 G蛋白的饱和硫酸铵沉淀
Fig．1 G protein precipitation by different
saturation of ammonium sulfate
图 2 Sephadex G-25层析图
Fig．2 Sephadex(3-25 gel filtration profile of G—protein
图 3 DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换层析图
Fig．3 DEAE—Sepharose Fast Flow ion exchange
column chromatogram of G—protein
umber
目的蛋白洗脱液的收集是通过 SDS—PAGE和
Western bloting鉴定进行的，利用 G-protein的 亚
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272 广 西 植 物 28卷
A
0．1
0
Fraction number
图 4 Sephadex G-IOO凝胶过滤层析图
Fig．4 Sephadex G-IO0 gel filtration profile of G-protein
A
0．2
0
0 40 80 Fraction number
图 5 Sepharose CL一6B凝胶过滤层析图
Fig．5 Sepharose CL-6B gel filtration profile of G-protein
基的一抗与目的蛋白洗脱液中C-protein的 a亚基特
异结合确定收集管中是否含有G-protein(图6)。
2．4蛋 白亚基鉴定
纯化 的 G蛋 白溶液与粗 提液进行 Native—
PAGE后 (图 7：a’b)胶上只有一条带，可知所得 G一
蛋白已较纯。另一块 Native—PAGE的胶进行转运
后 Western blotting鉴定，确定该条带为 G蛋白(图
7：c)。
取经过 6步分离纯化获得的目的蛋白溶液，进行
Native-PAGE后，固定、染色胶块，用刀片切下含有目
的蛋白的胶条，并切成 1 1Tim~的小块，加液氮研磨，然
后加入少量 SD PAGE样品缓冲液，沸水浴 10 rnin，
最后 4℃、11 000 r／rain离心 30 min，取上清，用于
SD PAGE，结果如图 7：d。在 SD PAGE胶上可以
看到3条带，第一条带颜色深，而且清晰可见，为G蛋
白a亚基(与 Western bloting鉴定结果一致)；第二
条带颜色较淡，分子量为 45kDa左右 ，与文献报道的
J3亚基分子量(43kDa)相近；第三条带颜色更淡，分子
量为 35kDa左右，有可能为 y亚基。
图 6 G-蛋白的 SDS—PAGE和 Western blotting鉴定
Fig．6 SDS—PAGE and Western blotting
identification of G-protein
97．4kDa
§g t 66 2kDa
43．0kDa
20．1kDa
14．4kDa
● 1
● 2
3
a b C d
图 7 蛋 白的鉴定
Fig．7 Characterization of G—protein
a．粗提液的 Native-PAGE；b．Sepharose CL-6B洗脱液
Native-PAGE；c．免疫印迹；d．SDS—PAGE。
3 讨论
迄今为止，关于 G蛋白分离纯化的报道很少，
即使有也是基于重组细胞 G蛋白亚基的分离，从天
然状态下的细胞中分离纯化 G蛋白的报道还没有 。
由于蛋白纯化过程相当长而复杂，工作量大，收率极
低，因此很难从组织细胞中分离纯化得到 G蛋白。
本试验以拟南芥野生型细胞为材料，通过层析分离
等方法，获得了少量的较纯的 G蛋白，只能用于做
一 些初步的定性鉴定，没有能够做 HPLC测定和氨
基酸序列测定，但优化了一套植物 G蛋白分离纯化
的方法，为以后实验室开展植物 G蛋白性质和功能
研究奠定了理论基础。同时初步证实了 G蛋白可
能有 3个亚基组成 ，其 中一条为 a亚基是可 以确定
的，但由于本试验无法得到l3、y亚基的抗体，所以还
(下转第 147页 Continue on page 147)
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2期 阮成江 ：连翘的二型花柱 147
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一 】67
连翘的二型花柱
阮成江
(大连民族学院 生物技术与资源利用国家民委教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)
摘 要：报道了连翘中的二型花柱(长花柱和短花柱)。长花柱的柱头和雄蕊高度分别为 6．12土0．05 mm和
2．35土0．04 mm，短花柱则为 2．23土0．04 mm和 6．02~0．06 mm。短花柱花的花冠大小明显超过长花柱。开放
授粉条件下 ，长短花柱花的座果率分别为 9．1l 土0．04 和 8．93 ±0．07 。人工异交的座果率在长一短
(36．8 土0．04 )与短一长(36．2 土0．07 )组合间无 明显差异(Fo，39)一1．38，P一0．14)。人工异交实验表
明，传粉者限制可能发生在生长于中国东北部的人工连翘种群中，这可能是因为该地区早春 的低温和多风气候
条件影响传粉者的种类和活动。
关键词 ：二型花柱 ；连翘；花性状
(上接第 272页 Continue from page 272)
需要进一步通过拟南芥 p亚基和 亚基缺失突变体
细胞中提取蛋白质试验进行确证。
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