全 文 ：中国生态农业学报 2010年 11月 第 18卷 第 6期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Nov. 2010, 18(6): 1378−1384


* 国家科技支撑计划课题(2006BAD17B05, 2007BAD87B04−03)资助
** 通讯作者: 胡春胜(1965~), 男, 博士, 研究员, 长期从事农业生态学及其相关领域的研究。E-mail: cshu@sjziam.ac.cn
王莹(1982~), 女, 博士研究生, 研究方向为土壤微生物生态学。E-mail: sweetwy@hotmail.com
收稿日期: 2010-04-01 接受日期: 2010-05-26
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.01378
环境中的反硝化微生物种群结构和功能研究进展*
王 莹 1,2 胡春胜 1**
(1. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050021; 2. 中国科学院研究生院 北京 100049)
摘 要 反硝化作用是生态系统氮循环的重要组成部分, 与地下水硝酸盐累积和温室气体排放密切相关。种
类繁多的细菌、真菌和古菌参与反硝化过程, 并在调控反硝化速率和反硝化气体产物比例等方面发挥重要作
用。反硝化微生物的种群结构是一系列环境影响因素长期作用的结果, 反硝化微生物种群对温度、水分、pH、
O2含量、资源可利用性和植被类型等因素产生不同的响应。环境因素通过对反硝化微生物的影响来调控反硝
化速率和反硝化酶的生成。分子技术的应用为自然环境中反硝化微生物的研究开辟了广阔前景, 并为进一步
认识反硝化微生物种群结构和功能的相互关系提供了新的发展方向。本文总结了关于环境中反硝化微生物种
群的研究结果, 并为进一步研究反硝化微生物种群结构和功能的联系提供了总体框架。
关键词 反硝化过程 反硝化微生物 微生物种群结构 功能基因 分子技术
中图分类号: Q93 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)06-1378-07
Research advances on community structure and function of denitrifiers
WANG Ying1,2, HU Chun-Sheng1
(1. Center for Agricultural Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,
Shijiazhuang 050021, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract Denitrification is an important part of N-cycling in ecosystem, and is closely associated with nitrate accumulation in
groundwater and greenhouse gas emission. Various bacteria, fungi and archaea involved in denitrification play important roles in
controlling rate and N2O︰N2 ratio of denitrification. Populations of denitrifiers are structured by long-term environmental factors.
They respond to temperature, moisture, pH, O2 content, nutrient availability and vegetation in different ways. Environmental factors
indirectly control denitrification rate and enzyme production through affecting denitrifiers. The molecular technology application
facilitates the study on denitrifiers in natural environments, and shows new directions for further understanding of correlation be-
tween denitrifier population structure and their function. This paper summarized research achievers in denitrifier population, and
advanced a framework for future studies about connections between denitrifier population structure and function.
Key words Denitrification, Denitrifiers, Microbial population structure, Functional genes, Molecular technique
(Received April 1, 2010; accepted May 26, 2010)
反硝化作用是生态系统氮循环的重要组成部
分。反硝化作用是指氮氧化物作为末端电子受体 ,
通过反硝化微生物的作用将硝酸盐还原为N2O和N2
的过程[1]。反硝化作用广泛存在于全球各种环境介
质中, 例如土壤、沉积物、海水、淡水及地下水等。
反硝化作用一方面减少了环境中的硝酸盐累积, 另
一方面其气体产物又是生态系统中氮流失的重要途
径之一, 其气体产物之一的 N2O 是一种重要的温室
气体, 并且对臭氧层有破坏作用。由于反硝化作用
对环境的潜在重要性, 对其作用机制及所涉及酶和
微生物的研究越来越引起广泛重视, 从而引发了大
量新试验方法的开发和应用。
早期的科学家们研究了反硝化作用的影响因素,
以便能够更好地理解这一过程, 多数研究都集中在
硝酸盐可利用性、O2含量和 pH 等因素对反硝化速
率的调控作用上[2−5]。这些影响因子通过一系列的反
硝化微生物种群发挥其调控作用, 而反硝化微生物
的种群结构能够反映这些调控因子综合作用结果。
第 6期 王 莹等: 环境中的反硝化微生物种群结构和功能研究进展 1379


早期的研究由于试验条件和方法的限制, 及反
硝化基因的广泛分布, 导致人们忽视了反硝化微生
物的种群组成和多样性对反硝化过程的重要调控作
用。事实上, 反硝化基因的存在并不意味着反硝化
基因在环境中的必然表达, 并且反硝化基因表达的
产物并不一定具有同等的反硝化功能。因此, 进行
反硝化微生物应对环境条件变化和胁迫的不同响应
机制, 以及反硝化微生物种群结构和功能之间的相
互关系对于认识反硝化过程及其影响因素具有十分
重要的意义。
1 反硝化过程中的酶和基因
反硝化过程包含 4 个由酶催化的还原反应, 分
别是硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、NO 还原和 N2O
还原[6]。催化反硝化过程的各种酶由几种特定基因
来编码, 这些基因被用来作为研究反硝化微生物种
群组成的靶序列。硝酸盐的还原与 2 种类似的酶有
关, 即膜结合硝酸盐还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原
酶(Nap)。由于这 2种酶同时也存在于反硝化微生物
种群之外的微生物中 , 所以编码这 2 种酶的基因
narG 和 napA 在研究反硝化微生物多样性方面未得
到广泛应用[6−8]。催化亚硝酸盐还原的 2种酶是分别
由 nirK和 nirS编码的 Cu型亚硝酸盐还原酶和细胞
色素 cd1型亚硝酸盐还原酶。nirK和 nirS是最早用
于反硝化微生物多样性研究的基因, 由于它们涉及
的亚硝酸盐还原反应是反硝化过程中第 1 个有气体
产生的步骤, 故这 2 个基因随后也成为反硝化微生
物种群研究中最普遍使用的分子标记物[9]。一些研
究聚焦在由 norB编码的 NO还原酶(Nor)上, 由于这
种酶催化形成 N－N 双键, 因此其在反硝化过程中
发挥特殊作用[10]。编码 N2O 还原酶(Nos)的 nosZ 在
反硝化微生物种群研究中应用也相当广泛[11], 可能
是由于这种酶催化还原 N2O的同时生成 N2, 而 N2O
是一种重要的温室气体, 其反应产物 N2是大气的主
要组成部分。
2 反硝化微生物的多样性和分布
反硝化是一个兼性厌氧的微生物过程。许多不
同种类的微生物都具有反硝化能力, 如热袍菌门、
产金菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌属和变形
菌门等[12], 此外, 某些真菌[13−14]和古菌[15]也具有反
硝化的能力。由于许多反硝化微生物不能单独产生
反硝化过程所需的所有酶, 它们是通过共同作用来
完成整个反应过程的 [12], 因此, 反硝化过程也可以
看做是不同种类微生物共同作用的结果。
随着分子生物学及其技术的快速发展, 对反硝
化微生物的研究不仅局限于经过分离培养的反硝化
微生物, 更有很多科学家已经把目光集中在未分离
培养的微生物多样性研究上[8,16−19]。由于反硝化细菌
广泛的分类学多样性, 将通用的靶 rRNA 基因用于
反硝化微生物的研究是不现实的。因此, 多数关于
反硝化微生物的研究将编码反硝化过程中相关酶的
功能基因作为研究对象。反硝化微生物种群的微生
物学研究多集中在细菌方面, 这是由于细菌被认为
是大部分环境中的优势反硝化微生物种群。近年来,
真菌对于反硝化过程的贡献被重新认识 [13,20], 一些
证据表明在草地土壤的反硝化过程中, 真菌的作用
比细菌更加重要[20]。真菌基因组中的反硝化功能基
因与细菌的反硝化功能基因有很大不同[21], 还需对
其做进一步研究。嗜极古菌的反硝化能力早已被认
识, 但非嗜极古菌的反硝化能力目前还不为人所知。
在一些喜盐古菌上发现了编码亚硝酸盐还原酶的
nirK基因, 但这些基因序列与细菌有很大差别[22−23]。
因此, 还需要大量针对性的研究来解释古菌对反硝
化过程的重要性。
3 应用于反硝化微生物研究的方法和技术
反硝化微生物并不是分类学上的特定种群, 而
是一系列不同种属微生物的集合。目前, 大量的反
硝化微生物是不可分离培养的, 多种分子生物学新
方法的应用为反硝化微生物的分类鉴定、种群组成
和多样性研究、功能基因的定量分析等提供了新的
发展方向。
3.1 反硝化微生物种群结构和多样性研究
3.1.1 T-RFLP技术
末端限制性片段长度多态性 (Terminal restric-
tion fragment length polymorphism, T-RFLP)是一种
相对高效的技术, 这种技术将经过 PCR 扩增的基因
片段用限制性内切酶进行酶切, 然后通过凝胶电泳
分离后, 再使用DNA序列测定仪测定酶切片段的长
度[24−25]。T-RFLP技术能够定量检测优势基因片段的
相对数量, 从而确定种群中的优势微生物。如, 以不
同季节土壤样品中的 nirK 作为分子标记物, 应用
T-RFLP技术可分析反硝化微生物种群结构, 并通过
nirK 的相对数量确定其中的优势种群 [26]。T-RFLP
技术在比较种群差异方面是一种有效的方法, 但它
不能提供关于微生物种类鉴定的相关信息。
3.1.2 PCR-DGGE技术
变性梯度凝胶电泳 (Denaturing gradient gel
electrophoresis, DGGE)是一种广泛应用的 DNA指纹
图谱技术[19,27]。这种方法根据 DNA片段长度和 GC
含量的将经过 PCR 扩增后的 DNA 片段进行分离,
在凝胶上形成一系列的条带, 每一个条带代表一个
1380 中国生态农业学报 2010 第 18卷


特定的基因片段 , 同时代表一种特定的微生物。
DGGE 是分析反硝化微生物种群多样性的重要方
法。通过对不同耕作处理土壤中的 nirK 和 nirS 的
DGGE 图谱进行分析后, 发现传统耕作土壤和免耕
土壤中的反硝化微生物的多样性指数 H没有显著差
异[28]。DGGE 技术在定量分析上不如 T-RFLP 技术,
但能够提取完整的基因片段并进行测序, 从而可能
提供更加详细的反硝化微生物种群结构系统发生学
鉴定的相关信息。如, DGGE技术被用来分析不同施
肥土壤中的反硝化微生物的组成和种群结构, 通过
对 DGGE凝胶上的 nosZ基因片段进行切胶测序, 建
立系统发育树, 确定 nosZ的同源性[29]。
3.1.3 其他分子生物学技术
除了以上 2 种最常用的分子生物学技术外, 荧
光 原 位 杂 交 (Fluorescence in situ hybridization,
FISH)、微阵列(Microarray)、基因文库构建和分析等
技术, 也可用于研究反硝化微生物种群。
FISH 技术是一种细胞水平上的原位菌落测定
技术, 可避免核酸提取和 PCR 扩增过程中产生的偏
差。应用 FISH技术测定活性污泥中反硝化微生物种
群组成, 结果表明, β-proteobacteria是脱氮活性污泥
系统中数量最丰富的优势菌群[30]。应用微阵列技术
研究美国切萨皮克湾水系统中的 nirS, 结果表明 ,
在环境因素影响下, 反硝化微生物种群之间存在明
显差异[31]。基因序列文库技术能够提供更多物种间
和混合种群中基因变化的特定信息。具体方法是将
环境样品中混合种群的核酸进行 PCR 扩增, 克隆全
部基因片段并测序, 建立基因序列文库; 从中随机
选择克隆子进行测序和排列, 对某一特定样品中扩
增后的基因片段进行统计; 通过对大量克隆子详细
序列信息的采集, 能够评估每个变异基因的相对比
例, 测定总基因多样性和特定种群组成。这种技术
能够提供关于种群结构的更加详尽的描述, 但是比
以上几种技术更加昂贵。
3.2 反硝化微生物种群的定量研究
特定基因片段的相对数量可以通过定量 PCR
(Real-time PCR)来测定[32−34]。应用 Real-time PCR技
术进行 nirS 基因在不同环境样品中的定量研究, 结
果表明, 湖泊沉积物和地下水中 nirS 数量较多, 分
别达到 2.2×106 拷贝· μg−1(DNA)和 1.1×1011 拷
贝·μg−1(DNA), 而海洋沉积物中的 nirS 数量较少,
为 1.0×102 拷贝·μg−1(DNA)[32]。Henry 等 [33]应用
real-time PCR技术研究土壤样品中 nirK基因的数量,
灵敏度达到 102, 结果表明, 6 种理化性质不同的土
壤样品中 nirK 的数量范围是 9.7×104~3.9×106 拷
贝·g−1(土样)。这种技术可以对目标基因进行精确
定量, 但不能提供任何关于种群组成的信息。
3.3 反硝化功能基因的表达
3.3.1 通过 mRNA检测反硝化功能基因的表达
DNA 中反硝化基因的存在只表明这种生物具
有反硝化的能力, 而 mRNA 中反硝化基因的存在才
能表明这种生物正在进行反硝化基因的表达, 并产
生相应的酶。环境样品中 RNA的提取和保存十分困
难, 目前有些实验室已经能够克服这些困难并为进
一步研究提供更多可能性[34−37]。例如, Nogales等[38]
研究了河口沉积物中 5 种反硝化基因的表达情况,
结果表明, 在 DNA 中能够检测到 5 种基因, 但在
mRNA 中只检测到 nirS 和 nosZ, 说明 nirS 和 nosZ
的活性得以表达, 而不能确定存在于反硝化微生物
中的其他基因是否表达。由此可见, 尽管反硝化能
力广泛存在于微生物中, 但只能在特定的条件下被
诱发而表达。
3.3.2 反硝化酶的测定
反硝化酶能够催化反硝化作用的发生, 是反硝
化微生物活性的直接反映, 因此反硝化酶动力学是
反硝化微生物活性的重要检测手段。通过对不同类
型土壤中反硝化酶活性(Denitrification enzyme ac-
tivity, DEA)进行测定, 结果表明, 牧场土壤中反硝
化酶活性显著高于森林土壤[39]。应用酶动力学方法
研究不同国家农田土壤中的 N2O 还原酶, 其半饱和
速率常数显著增加的结果表明反硝化微生物的优势
种群发生了变化[40]。Metz 等[41]应用寡核苷酸探针
EUB338 和异化 Cu 型亚硝酸盐还原酶基因(DnirK)
的特异性单克隆抗体共同标记环境样品中的反硝化
微生物, 通过流式细胞仪和扫描电镜检测, 将样品
中能够表达 DnirK 的反硝化微生物识别出来; 并应
用人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)进行N2O产生
速率和 DnirK 基因表达关系的研究, 结果表明, 当
N2O的产生速率最高时, DnirK的表达量也达到最高,
当环境条件从有氧变为缺氧时, N2O 的产生速率降
低, 但同时 DnirK 的表达量却没有减少, 说明由于
Cu型亚硝酸盐还原酶的稳定性使得DnirK的表达与
反硝化功能的实现不同步。
4 反硝化微生物在反硝化过程中的作用
微生物生态学面临的一个突出问题是不同结构
组成的微生物种群在功能上是否也存在差异。有证
据表明不同反硝化微生物种群有不同的反硝化速率,
生成不同比例的气体产物。Cheneby 等[42]发现 2 种
反硝化气体产物N2O和 N2比例不同的土壤中, 反硝
化微生物种群组成存在显著差异, 以 N2O 为主要气
体产物的土壤中, 能够将NO3－还原为N2O的反硝化
第 6期 王 莹等: 环境中的反硝化微生物种群结构和功能研究进展 1381


微生物数量更多。Holtan-Hartwig等[40]发现 3个不同
采样地的 NO3－和 N2O 还原酶动力学存在本质不同,
且土壤中的反硝化微生物种群组成能够影响 N2O生
成。对 2 种不同类型土壤中 4 种反硝化酶活性和气
体产物中 N2O 比例分析的结果表明, 农田土壤中硝
酸盐还原酶(Nar)、亚硝酸盐还原酶(Nir)和 NO 还原
酶(Nor)的数量比自然土壤中更多, 与此相对, 自然
土壤中的反硝化微生物具有更高的 N2O 还原酶活
性, 而自然土壤反硝化气体产物中的 N2O 比例更
高[43−44]。Rich 等[18]也发现, 将森林土壤和牧场土壤
进行比较, nosZ 反硝化微生物种群结构与反硝化酶
的潜活性间有密切关系。但是也有研究表明, 到目
前为止反硝化微生物种群结构和功能间的关系还不
能被确定。如 Rich等[45]发现尽管农田、河岸及河床
土壤中的 nosZ基因图谱和N2O还原酶活性都发生变
化, 但是二者变化方式不同, 表明农业生态系统中
反硝化微生物种群活性和种群组成是非耦合关系。
在 Boyle 等[39]关于反硝化微生物种群组成和活性的
相互关系研究中, 尽管反硝化酶活性受试验影响而
发生变化, 但 nosZ 基因图谱未发生变化, 表明反硝
化酶的相对活性有时受反硝化微生物种群组成的影
响, 但在有些情况下, 也会受环境因素的影响。
综上所述, 反硝化微生物对反硝化速率和反硝
化动态过程有一定影响, 但具体的影响程度和机制
以及反硝化微生物种群结构与反硝化酶活性、反硝
化速率、反硝化气体产物 N2O和 N2的比例之间的相
互关系, 还需进一步的研究来解释和证明。
5 反硝化微生物的影响因素
自然生态系统中许多环境因素都可能对反硝化
微生物种群结构和多样性产生不同程度的影响。到目
前为止, 自然环境中反硝化过程的研究多数集中在
土壤、河口沉积物和海洋沉积物上。多种方法的综合
应用为研究环境因素对反硝化微生物的影响以及反
硝化微生物种群对环境变化的响应提供了有力工具。
5.1 土壤环境中反硝化微生物的影响因素
土壤中的反硝化微生物种群有很高的多样性 ,
且不同土壤环境中的反硝化微生物种群组成变化很
大。土壤中的反硝化微生物种群结构受有机碳含量、
NO3－含量、pH、含水量、温度、季节和土地利用方
式等多种因素影响。另外, 由于科学家对试验技术和
PCR 引物选择的不同, 使得这些因素对反硝化微生
物种群多样性和结构影响的研究结果有一定差别。
通过对土壤中含 nirK基因的反硝化微生物进行
T-RFLP分析, Bremer等[26]发现植物根系分泌物能够
直接影响微生物的种群组成, 但反硝化微生物种群
组成同时受季节等多种因素的影响, 说明反硝化微
生物种群结构的形成是土壤理化性质(包括全氮含
量、有机碳含量和 pH 等)、根系生物量、植被类型
等多种因素共同作用的结果。Cavigelli 等[43]通过对
农田土壤和自然土壤中反硝化微生物种群进行分析,
发现 O2 含量对农田土壤中反硝化微生物种群的抑
制作用更加明显, 而自然土壤中的反硝化微生物种
群对 pH 变化更加敏感。Prieme 等[17]应用 T-RFLP
技术比较了树木丛生的高地和沼泽湿地中 nirK 和
nirS 基因片段多样性, 其中一个突出发现是 2 种土
壤中 nirK 基因序列很少有重叠, 他们还发现湿地土
壤中 nirK 基因库具有更高的多样性, 说明土壤含水
量对含有 nirK的反硝化微生物种群多样性有影响。
Mergel等[46]在不同季节分别对土壤剖面不同深度的
反硝化微生物数量进行分析, 结果显示, 在表层 0~5
cm 土壤中, 反硝化微生物种群数量最多, 随着土壤
深度的增加, 反硝化微生物种群数量逐渐减少; 同
时, 他们还分析了季节变化对反硝化微生物的影响,
发现反硝化微生物种群在秋季、冬季和早春季节数
量多, 而在夏季数量较少。近年来, 人为氮沉降在全
球许多地区日益严重, 很可能给陆地生态系统和水
生生态系统的平衡带来风险。氮沉降可能提高反硝
化速率和反硝化气体产物中 N2O 的比例, 有研究发
现农田土壤中氮肥的施用导致反硝化微生物种群结
构的变化。Wolsing和 Prieme[47]应用 T-RFLP技术对
土壤中 nirK 基因片段的微生物种群组成进行分析,
发现施肥处理土壤中的种群组成与对照土壤存在明
显不同; 但是不能把这些差异归因于单一影响因素,
因为反硝化微生物种群对于氮含量增加的响应可能
是氮含量增加(直接效应)和其他环境因素(间接效应)
共同作用的结果。尽管 NO3－被认为是反硝化速率的
重要控制因素, 但 Mergel等[48]应用 DNA杂交技术,
发现酸性森林土的土壤剖面中 NO3－含量与反硝化
微生物种群数量有很小的相关性, 表明反硝化微生
物的数量和种群结构是由多种因素调控。Stres等[49]
应用 RFLP 技术分别对农田土壤和自然未开垦土壤
中 nosZ 的数量和多样性进行分析, 结果显示, 农田
土壤中的 nosZ表现出更高的多样性, 数量也比自然
土壤中更多, 同时 2种土壤中 nosZ种群组成存在明
显差异, 说明耕作导致反硝化微生物种群多样性增
加。不同的基因受到环境因素的影响程度也不同 ,
与 nirK和 nirS相比, nosZ在不同环境间的差异较小。
Rich 等 [18]应用 T-RFLP 技术进行检测 , 发现尽管
nosZ 的相对数量有差异, 但相邻的森林和牧场土壤
中 nosZ的种类大体相同, 但各自在一些特定环境下
有不同的基因型。Rich等[45]也发现相邻的农田土壤、
河岸土壤及河流沉积物中的 nosZ大体相同。这些研
究表明相对于其他反硝化过程中的基因, nosZ 的分
布更具普遍性, 且环境因素的影响也较小。
1382 中国生态农业学报 2010 第 18卷


5.2 海洋和河流沉积物中反硝化微生物的影响因素
各种影响因素对土壤和沉积物中反硝化微生物
种群的相对重要性不同, 这是由于土壤中的微生物
一般受碳含量的限制, 而沉积物的氮含量是更重要
的限制资源。Liu等[50]应用 PCR-克隆方法研究了墨
西哥湾 O2缺乏区域沉积物中的 nirS和 nirK, 随环境
梯度变化检测到截然不同的反硝化微生物种群; 对
特定基因型的反硝化微生物种群相对数量进行主成
分分析(PCA), 发现 NO3－和 O2水平是反硝化微生物
种群分布的主要影响因素。分别对大西洋和太平洋
大陆架沉积物中 nosZ 基因序列的分析显示, 2 种沉
积物中的 nosZ存在明显差异, 这种差异可能是由环
境因素影响所造成, 也可能是特定种群长期进化的
结果, 目前尚无定论[51]。
以上关于环境因素影响反硝化微生物种群的研
究表明, 单一的环境因素能够对反硝化微生物种群
产生不同程度的影响, 但反硝化微生物多样性和种
群结构的形成往往是多种环境因素共同起作用的结
果, 而且影响程度和影响机制还需大量试验研究来
验证。
6 反硝化微生物研究展望
反硝化过程在全球生态系统氮循环中发挥着十
分重要的作用, 反硝化作用能够减少陆地和水环境
中的硝酸盐累积, 产生 N2O, 也能够将一部分 N2O
转化为 N2, 因此, 反硝化过程中微生物的研究对于
大气环境、水环境污染防控及土壤养分保持等方面
具有重要价值。但是由于反硝化微生物具有种类繁
多、分布广泛和多数难以分离培养的特性, 使得关
于反硝化微生物种群结构、多样性、生理学特性及
其影响因素等的研究存在一定困难。随着科学的发
展和新技术的出现, 关于反硝化微生物种群的研究
无论在广度上还是在深度上都将有很大扩展, 主要
体现在以下几方面:
更加完善的反硝化功能基因库的建立能够促进
反硝化微生物分子生物学研究进一步发展。通常做
法是为从环境样品中提取的功能基因序列建立一个
系统发育树 , 目的是确定物种的起源 , 然而 , 公开
的基因库中只有很少一部分功能基因片段是已知生
物的。而目前的技术只能根据已知的序列来设计引
物和探针, 故急需不依赖于引物、并且能够覆盖未
知反硝化基因序列的新技术。有 2 种技术能够提高
反硝化基因序列的数量和多样性, 一种是已培养微
生物的基因组测序, 另一种是全部种群的宏基因组
测序。越多的微生物基因组被测序, 对反硝化过程
中基因的生理机能和调控机制了解就越多。然而多
数反硝化微生物很难被培养, 因此, 仅仅对基因组
进行测序对于测定反硝化基因的多样性是不充分
的。宏基因组学能够重建未培养生物的基因组[52−54]。
宏基因组学的通常方法是从混合种群提取的核酸中
随机挑选基因片段进行测序, 再应用精密生物信息
学工具整合为基因组。完整的反硝化基因组能够带来
反硝化功能基因的全长序列, 进而为引物和探针的
设计提供帮助, 同时对功能基因进行系统发育鉴定。
应用现有的技术, 需要大量的资源来测定单一
样品中反硝化微生物种群的多样性。仅有可用的高
生产量种群分析方法是指纹图谱技术, 例如 DGGE
和 T-RFLP, 但它们不能提供关于反硝化微生物种群
和基因序列鉴定的具体信息。功能基因的微阵列技
术能够同步检测并定量数以千计的基因及基因突变,
目前被用于分析海洋沉积物中的反硝化微生物种群
结构[34,55]。虽然微阵列技术有很好的发展前景, 但其
应用面临着很多技术上的挑战, 如敏感性、连贯性
和定量化[56]。在未来更加完善的功能基因库建立的
基础上, 微阵列技术将成为相对廉价并高效的评估
基因多样性、数量及表达的方法。
在微生物生态学的研究中, 人们越来越关注特
定微生物种群与其功能方面的研究。反硝化过程十
分复杂, 反硝化微生物种群活性及其代谢功能的准
确测定存在一定难度。最近发展起来的稳定性同位
素探测技术(Stable isotope probing, SIP)将稳定性同
位素标记技术与分子生物学技术相结合, 为解决这
一问题提供了新的途径。应用 SIP 技术标记反硝化
微生物的 DNA, 提取[13C]DNA 并进行 Full cycle
rRNA分析, 发现[13C]克隆文库中的 16S rRNA基因
优势种群为丛毛单胞菌科和红环菌科的细菌, 并结
合 FISH技术研究发现, 反硝化速率与这些种群的数
量密切相关[57]。
新技术的发展和基因库的完善将持续推动反硝
化微生物种群的研究。然而, 一些关于反硝化微生
物种群组成和功能的关系及微生物种群组成在调控
反硝化速率和过程方面的作用的具体问题还需进一
步探讨:
(1)微生物种群的反硝化基因库中的哪些基因能
够被表达？哪些因素控制了它们的表达？
(2)如何确定反硝化微生物功能基因的特殊存在
形式？如何利用功能基因作为分子标记物对反硝化
微生物种群结构和多样性进行准确测定？
(3)其他环境因素(如碳有效性、微量营养元素、
pH 等)如何控制反硝化微生物种群结构和影响基因
的表达？环境胁迫(如湿润/干旱、结冰/融化等)如何
影响反硝化微生物种群结构？土壤食物网动力学如
第 6期 王 莹等: 环境中的反硝化微生物种群结构和功能研究进展 1383


何影响反硝化微生物种群？
(4)反硝化微生物种群结构如何对环境变化产生
响应？
这些问题可能需要通过田间观察、实验室控制
试验和基于过程的模型三者相结合来解决。在田间
试验中, 由于许多环境因素是相互关联、共同起作
用的, 所以研究环境因素在反硝化微生物种群结构
调控中的作用及其相互关系非常困难。实验室控制
试验可在机制水平上更好地解释这些调控的原理。
但是由于很难控制微生物种群, 所以对微生物多样
性或种群组成在调控反硝化速率中的作用进行解释
十分困难。而基于过程的模型研究中, 影响微生物
种群结构的参数很多, 而模拟结果与试验测定结果
存在一定偏差。
分子生物学新方法和技术的出现, 以及多种方
法和技术的结合应用, 为反硝化过程和反硝化微生
物的研究开辟了新的领域。尽管过去反硝化微生物
种群结构的作用曾经被忽视, 但现在已经认识到它
是反硝化速率和反硝化产物比例的一个重要影响因
素。通过对一系列生态系统中反硝化微生物种群、
反硝化速率和环境因素的同步研究, 将确定在何种
条件下微生物在反硝化过程中发挥更大的影响, 并
将进一步说明影响反硝化微生物种群的因素。
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