全 文 ：生物多样性 2006, 14 (5): 410–420 doi: 10.1360/biodiv.060104
Biodiversity Science http: //www.biodiversity-science.net

——————————————————
收稿日期: 2006-05-25; 接受日期: 2006-07-24
基金项目: 中国科学院“西部之光”人才培养计划项目(樟科濒危植物思茅木姜子的保护遗传学研究)和国家自然科学基金项目(30470123)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: jieli@xtbg.ac.cn
樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的ISSR分析
陈俊秋1, 2 慈秀芹1, 2 李巧明1 李 捷1*
1 (中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部植物系统与保护生物学实验室, 昆明 650223)
2 (中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘要: 本文采用ISSR标记对中国特有且仅在云南南部狭域分布的樟科濒危植物思茅木姜子(Litsea szemaois)现存8
个居群的遗传多样性进行了研究。从96条引物中筛选出了10条, 对103个个体进行了扩增, 共扩增出77条条带, 其
中多态性条带为67条。分析结果表明: (1) 思茅木姜子的遗传多样性水平很高。在物种水平上，多态位点百分率PPB
=87.01%, 平均每个位点的有效等位基因数Ne=1.4006, Nei’s基因多样度指数H=0.2466, Shannon多样性信息指数
Hsp=0.3826; 在居群水平上，PPB=37.99%, Ne=1.2500, H=0.1418, Shannon多样性信息指数Hpop=0.2088。(2) 居群间
的遗传分化较低。基于Nei’s遗传多样性分析得出的居群间遗传分化系数Gst=0.3700; Shannon’s居群分化系数
((Hsp–Hpop)/Hsp)为0.45。AMOVA分析显示: 思茅木姜子的遗传变异主要存在于居群内, 占总变异的72.99%, 居群
间的遗传变异占27.01%, 表明思茅木姜子属于异交种。 (3)两两居群间的Nei’s遗传一致度 (I)的范围为
0.8233–0.9761。经Mantel检测, 居群间的遗传距离和地理距离之间不存在显著的正相关关系(r=0.0925, P= 0.6931)。
我们推断人类活动的干扰和生境的片断化是导致思茅木姜子濒危现状的主要因素。考虑到目前其遗传多样性水平
虽然很高, 但各居群个体数量很少, 因此应该对思茅木姜子各居群的所有个体实施及时的就地保护; 而遗传变异
大部分存在于居群内的个体间, 所以在迁地保护时应在各居群内大量采样。
关键词: Litsea szemaois, 特有濒危植物, ISSR, 遗传多样性, 遗传结构
Genetic diversity of Litsea szemaois, an endangered species endemic to
China, detected by inter-simple sequence repeat (ISSR)
Junqiu Chen1,2, Xiuqin Ci1,2, Qiaoming Li1, Jie Li1*
1 Laboratory of Plant Phylogenetics and Conservation Biology, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese
Academy of Sciences, Kunming 650223
2 The Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049
Abstract: Litsea szemaois is a critically endangered species endemic to southern Yunnan，China. We as-
sessed the genetic variability within and among eight extant populations of this species using ISSR PCR (10
primers). We expected a low genetic diversity level, but our results revealed an extraordinarily high level of
specific genetic diversity (at species level: percentage of polymorphic loci PPB=87.01%, effective number of
alleles Ne=1.4006, Nei’s (1973) gene diversity H=0.2466, and Shannon’s Information index Hsp=0.3826; at
population level: PPB=37.99%, Ne=1.2500, Nei’s (1973) gene diversity H=0.1418, and Shannon’s Informa-
tion index Hpop=0.2088. The diferences among populations in levels of genetic diversity were very obvious,
with the highest level (PPB=72.73%) in Mandian population and the lowest level (PPB=18.18%) in Jinghong
population. A low level of genetic differentiation among populations was detected based on Nei’s genetic di-
versity analysis (37%), Shannon’s diversity index (45%), and AMOVA (27.01%). This may result from
out-breeding. Pairwise genetic identity (I) values among populations ranged from 0.8233 to 0.9761. There
was no correlation between genetic and geographic distance among the populations studied. The influence of
human activity and forest fragmentation may play a prominent role in creating this species’s current endan-
gered status.
第 5期 陈俊秋等: 樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的 ISSR分析 411
Key words: Litsea szemaois, endangered and endemic plant, ISSR, genetic diversity, genetic structure

思茅木姜子(Litsea szemaois)是樟科木姜子属
中的杯托组(Sect. Cylicodaphne)植物, 为我国云南
省南部热带季雨林的特有树种 (李捷和李锡文 ,
2006)。思茅木姜子具有在系统演化上较为独特的假
伞形花序(3–5个伞形花序生于短枝上呈总状花序),
是解决和认识木姜子属系统发育极为重要的科学
研究材料; 同时作为热带雨林演替后期的树种, 它
在维持森林生态系统平衡中起着重要作用, 是物种
多样性的重要组成成分, 具有重要的保护价值(Li
et al., 2004)。
思茅木姜子主要分布于西双版纳地区低丘雨
林和沟谷雨林的中层(郭晓荣等, 2004), 其分布区很
窄。据《中国植物红皮书: 稀有濒危植物》记载, 其
仅见于云南南部勐海、景洪和勐腊三县海拔
800–1,500 m的密林中, 属狭域分布植物, 为濒危种
(傅立国, 1992)。但在本项目开展初期, 在对上述三
县思茅木姜子的记载分布地进行认真的野外实地
考察与采样时, 在勐海县却未发现有思茅木姜子分
布, 在其余两县也仅发现8个自然居群。在野外调查
时还发现, 思茅木姜子分布范围小, 居群数量和个
体数量均很少, 自然更新缓慢; 加上近年来日益强
烈的人类活动干扰导致的森林片断化及生境的不
断恶化, 其生存已经受到了严重的威胁。而目前对
思茅木姜子除在植物生态学方面有过研究报道外
(郭晓荣等, 2004), 其他学科的研究尤其是对该物种
在DNA水平上的遗传多样性等保护生物学的相关
研究至今尚未见报道。
ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记是
一种简单重复序列区间扩增多态性分子标记, 具有
DNA样品用量少、操作简单、快速灵敏和实验成本
低等优点, 而且实验重复性好、信息量大且多态性
高, 因而是一种非常理想的检测物种内遗传变异的
分子标记, 已被广泛应用于遗传多样性分析和居群
生物学的研究(钱韦等, 2000; 杨淑达等, 2005)、品
种鉴定(Prevost & Wilkinson, 1998), 以及物种的分
类系统学比较(Huang & Sun, 2000; Joshi et al.,
2000)等方面, 同时也成为构建遗传图谱的有力工
具(Kojima et al., 1998; Sankar & Moore, 2001)。
本文采用ISSR分子标记对仅存的8个思茅木姜
子自然居群的遗传多样性进行了研究, 旨在阐明其
遗传多样性水平和遗传结构, 分析其致濒机制, 从
而为制定科学有效的保护策略和措施提供基础资
料和科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
取样尽量覆盖该物种的整个分布范围。由于该
种植物分布比较狭窄, 我们对仅存于景洪和勐腊县
的8个自然居群均进行了取样。采样时间为2004年9
月, 各个居群的具体位置和采样个体数详见表1和
图1。所取样品为植株的叶片, 在野外迅速用硅胶干
燥保存。
1.2 DNA的提取与PCR扩增
思茅木姜子总DNA的提取采用改进后的CTAB
法(Doyle & Doyle, 1987), 每次取1.0–1.5 cm2干燥的
叶片组织。
PCR反应在GeneAmp 9700 Thermocycler PCR
仪上进行。25 µL反应体系包括 : 10×Buffer(10
mmol/L Tris-HCl, pH8.3; 50 mmol/L KCl) 2.5 µL, 5
U/µL的Taq DNA 聚合酶(TAKARA, 宝生物工程
(大连)有限公司) 0.2 µL, 25 mmol/L的MgCl2 2.0 µL,
10 mmol/L的dNTPs(TAKARA, 宝生物工程(大连)
有限公司)2.0 µL, 15 µmol/L的引物(上海生工生物
工程有限公司)1.0 µL, 10% 的DMSO 5.0 µL, 50
ng/µL的模板DNA 1.0 µL, 以及ddH2O 11.3 µL。
扩增程序: 94°C 5 min; 94°C 50 s, 退火(温度视
不同引物而定)50 s, 72°C 2 min, 45个循环; 72°C 10
min。电泳条件: PCR扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶
上电泳(1×TBE, 100V)分离, 以DNA Marker DL2000
(100–2,000 bp)(TAKARA, 宝生物工程(大连)有限
公司)为分子标记, 溴化乙锭(EB)染色显带。DNA片
段通过凝胶成像系统(SYNGENE)观察记录。
1.3 数据分析
将ISSR琼脂糖凝胶电泳图谱记录后进行人工
读带, 以DNA Marker DL2000 (100–2,000 bp)作为
相对分子量标准, 由同一引物扩增的电泳迁移率一
致的条带被认为具有同源性, 属于同一位点的产物
(杨淑达等, 2005)。
412 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 14卷

表1 用于ISSR分析的8个思茅木姜子天然居群
Table 1 Populations of Litsea szemaois for ISSR analyses
居群编号
Population code
分布地
Locality
居群大小
Population
size
采样数
Sample
size
海拔
Altitude (m)
纬度
Latitude
经度
Longitude
勐仑 ML 勐腊勐仑
Menglun, Mengla County
17 16 537–700 21°55′N 101°16′E
龙林 LL 勐腊龙林
Longlin, Mengla County
7 5 670 21°32′N 101°30′E
基诺山 JNS 勐腊基诺山
Jinuoshan, Mengla County
8 6 1,050–1,170 22°02′N 101°00′E
纳板河 NBH 景洪纳板河
Nabanhe Nature Reserve, Jinghong County
19 11 718–750 22°09′N 100°40′E
过门山 GMS 景洪过门山
Mt. Guomen, Jinghong County
29 24 900–1,000 22°14′N 100°36′E
小糯友 XNY 景洪小糯友
Xiaonuoyou, Jinghong County
8 6 1,100–1,200 22°14′N 100°37′E
曼点 MD 景洪曼点
Mandian, Jinghong County
41 31 690–710 22°07′N 100°39′E
景洪 JH 景洪市自然保护区
Jinghong Nature Reserve
4 4 1,050 22°02′N 100°54′E










图1 8个思茅木姜子居群的取样分布图(居群代号同表1)
Fig. 1 Map showing locations of the eight sampled Litsea szemaois populations. Population codes are the same as in Table 1.

第 5期 陈俊秋等: 樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的 ISSR分析 413

按同源性条带的有无分别以1和0的格式记录
并输入计算机 , 构成 ISSR表型数据矩阵输入
POPGENE 1.32软件(Yeh et al., 1997)进行分析。统
计下列参数: 多态位点百分率(PPB)、Shannon多样
性信息指数(Ho，在物种水平上为Hsp，在居群水平
上为Hpop)、Nei’s基因多样度指数(H)、平均每个位
点的观察等位基因数(Na)、平均每个位点的有效等
位基因数(Ne)、总的基因多样度(Ht)、居群内基因多
样度(Hs)、基因分化系数(Gst)、基因流(Nm)、Nei’s
遗传距离(D)和遗传一致度(I), 并据此用UPGMA方
法进行聚类, 分析各群体之间的遗传关系。运用
DCFA1.1(张富民和葛颂, 2001)对ISSR表型数据矩
阵进行计算 , 得到表型间的距离系数 , 组成
WINAMOVA所需要的距离系数(δ2)矩阵文件, 即距
离文件(.dis), 然后运用WINAMOVA软件(Excoffier,
1993)对居群间和居群内的遗传变异进行分子变异
分析(AMOVA)(张富民和葛颂, 2002)。同时也通过
Shannon’s居群分化系数((Hsp–Hpop)/Hsp)来估测居群
间的遗传变异。运用TFPGA 1.3 (Miller, 1997)检测
居群间的遗传距离和地理距离间的相关性(置换
3,000次)。
2 结果
2.1 引物筛选结果
从96条ISSR引物(加拿大哥伦比亚大学UBC
Primer Set No.9, http://www.biotech.ubc.ca/services/
NAPS/Primer_Sets/Primers.pdf)(上海生工合成)中筛
选出10条条带清晰、重复性和稳定性好且多态性条
带相对较多的引物用于全部DNA样品的PCR扩增
(表2)。
2.2 思茅木姜子的ISSR遗传多样性
用所选的10个引物对思茅木姜子的103个个体
进行扩增, 所得片段在100–2,000 bp之间。共检测到
77个清晰、可重复的有效位点, 其中多态位点有67
个。分析结果表明: 在物种水平上, 思茅木姜子具
有较高的多态位点百分率(PPB = 87.01%)(表3)、平
均每个位点的有效等位基因数 (Ne=1.4006±
0.3315)、Nei’s基因多样度 (H=0.2466±0.1714)和
Shannon’s多样性信息指数(Hsp=0.3826 ± 0.2333)(表
4)。在居群水平上, 各个居群的多态位点百分率
(PPB) 差异较大 (18.18–72.73%), 平均值为37.99%
表2 ISSR引物序号与序列
Table 2 List of ISSR primers and their sequences used in the
study
引物
Primer
序列
Sequence (5–3)
808 (AG)8C
811 (GA)8C
826 (AC)8 C
827 (AC)8G
841 (GA)8YC
842 (GA)8YG
844 (CT) 8 RC
866 (CTC)5
891 HVH(TG)7
895 AGA GTT GGT ACG TCT TGA TC


(表3), 平均每个位点的有效等位基因数 (Ne)为
1.2500(±0.3585), Nei’s基因多样度指数 (H) 为
0.1418(±0.1913), 各个居群的Shannon指数 (Ho)为
0.1160–0.3894, 平均值Hpop为0.2088(±0.2729) (表
4)。
Shannon多样性指数显示了各居群的遗传变异
由高到低依次为曼点 (MD)>过门山 (GMS)>勐仑
(ML)>小糯友(XNY)>基诺山(JNS)>纳板河(NBH)>
龙林(LL)>景洪(JH)(表4), 与PPB值分析的结果(表
3)基本一致。各居群间的遗传多样性差别较大, 其
中景洪曼点居群(MD)的遗传多样性水平最高(PPB
=72.73%, Ne=1.4503, H=0.2621, Ho=0.3894), 景洪自
然保护区居群(JH)的遗传多样性水平最低(PPB =
18.18%, Ne=1.1561, H=0.0817, Ho= 0.1160)(表3, 4)。
2.3 思茅木姜子居群的遗传变异
用POPGENE计算出的遗传变异分析结果(表5)
表明: 思茅木姜子各居群间存在着一定的遗传分
化。8个自然居群总的遗传多样性Ht = 0.2251, 其中
居群内遗传多样性Hs=0.1418, 居群间的基因多样
度 (Dst=Ht–Hs)为 0.0833, Nei的基因分化系数
Gst=0.3700, 表明有37%的遗传变异存在于居群间,
63%的遗传变异存在于居群内, 居群内的遗传分化
大于居群间的分化。居群间基因流(Nm=0.5(1–Gst)/
Gst)为0.8513, 基因流较小。
根据Shannon’s多样度指数的分析结果(物种水
平上Hsp=0.3826, 居群水平上Hpop=0.2088)(表4), 计
算出Shannon’s居群分化系数((Hsp–Hpop)/Hsp)为0.45,
即有45% 的遗传变异分布在居群间, 55%的遗传变
414 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 14卷

表3 思茅木姜子各居群的多态位点百分率(PPB)统计(居群代号同表1)
Table 3 The PPB statistics of Litsea szemaois populations. Population codes are given in Table 1.
居群编号
Population code
采样数(株)
Sample size
多态位点数
No. of polymorphic loci
多态位点百分率
PPB (%)
勐仑 ML 16 36 46.75
龙林 LL 5 19 24.68
基诺山 JNS 6 23 29.87
纳板河 NBH 11 23 29.87
过门山 GMS 24 39 50.65
小糯友 XNY 6 24 31.17
曼点 MD 31 56 72.73
景洪 JH 4 14 18.18
平均 Mean 12.875 29.25 37.99
物种水平 At species level 103 67 87.01



表4 思茅木姜子居群的遗传多样性(居群代号同表1)
Table 4 The genetic variation of Litsea szemaois populations. Population codes are given in Table 1.
居群编号
Population code
等位基因观察值
Na
有效等位基因数
Ne
Nei’s 基因多样性
H
Shannon’s 指数
Ho
勐仑 ML 1.4675 ± 0.5022 1.3009 ± 0.3816 0.1720 ± 0.2065 0.2540 ± 0.2953
龙林 LL 1.2468 ± 0.4339 1.1611 ± 0.3151 0.0929± 0.1728 0.1375 ± 0.2503
基诺山 JNS 1.2987 ± 0.4607 1.2029 ± 0.3563 0.1136 ± 0.1896 0.1669 ± 0.2709
纳板河 NBH 1.2987 ± 0.4607 1.1859 ± 0.3311 0.1072 ± 0.1813 0.1592 ± 0.2618
过门山 GMS 1.5065 ± 0.5032 1.3270 ± 0.4011 0.1836 ± 0.2123 0.2700 ± 0.3006
小糯友 XNY 1.3117 ± 0.4662 1.2159 ± 0.3624 0.1210 ± 0.1936 0.1773 ± 0.2769
曼点 MD 1.7273 ± 0.4483 1.4503 ± 0.3702 0.2621 ± 0.1951 0.3894 ± 0.2758
景洪 JH 1.1818 ± 0.3882 1.1561 ± 0.3499 0.0817 ± 0.1791 0.1160 ± 0.2516
平均 Mean 1.3799 ± 0.5208 1.2500 ± 0.3585 0.1418 ± 0.1913 0.2088 ± 0.2729
物种水平 At species level 1.8701 ± 0.3384 1.4006 ± 0.3315 0.2466 ± 0.1714 0.3826 ± 0.2333
Na, Observed number of alleles; Ne, Effective number of alleles; H, Nei’s (1973) gene diversity; Ho, Shannon’s information index (Mean, Hpop; At
species level, Hsp)



表5 思茅木姜子居群基因多样性Nei’s分析
Table 5 Nei’s (1987) analysis of gene diversity in Litsea szemaois populations
总基因多样性
Ht
居群内基因多样性
Hs
基因分化系数
Gst
基因流
Nm
平均 Mean 0.2251 0.1418 0.3700 0.8513
标准差 Standard deviation 0.0286 0.0124
Ht, Total gene diversity; Hs, Gene diversity within populations; Gst, Coefficient of gene differentiation; Nm, Gene flow, Nm=0.5(1–Gst)/Gst (McDermott
& McDonald, 1993)


异分布在居群内部。此结果略高于POPGENE的分
析结果。
用AMOVA进行的基于欧氏距离平方的遗传变
异巢式方差分析结果也显示思茅木姜子的遗传变
异主要存在于居群内, 占总变异的72.99%, 居群间
的遗传变异占27.01%(P<0.001)(表6)。此结果略低于
POPGENE的分析结果。
尽管三种方法分析的结果在数值上有差异, 但
是所揭示的思茅木姜子居群间遗传分化的趋势是
一致的, 都表明遗传变异主要存在于居群内, 居群
内的遗传分化大于居群间的分化。
2.4 居群间遗传距离和遗传一致度
用POPGENE计算出了思茅木姜子8个居群两
两居群间的Nei’s遗传一致度(I), 其范围为 0.8233 –
第 5期 陈俊秋等: 樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的 ISSR分析 415

表6 思茅木姜子的AMOVA分析
Table 6 Analysis of molecular variance (AMOVA) for Litsea szemaois based on ISSR data
谱系结构
Source of variance
方差总和
SSD
平均方差
MSD
变异组分
Variance component
变异百分率
Percentage of total variance (%)
P＊
居群间 Variance among populations 3.0998 0.443 0.0297 27.01 < 0.001
居群内 Variance within populations 8.4663 0.089 0.0891 72.99 < 0.001
P值表示比观察值的变异大的概率, 这个概率是通过把居群中的样本经过1,000次随机排列改变计算得到的。
SSD, Sum of squared deviation; MSD, Mean of squared deviation. * P-values are the probabilities of having a more extreme variance component than
the observed values alone. Probabilities were calculated by 1,000 random permutations of individuals across populations.


表7 思茅木姜子8个居群间的Nei’s(1978)遗传一致度(I)(对角线上方)和遗传距离(D) (对角线下方) (居群代号同表1)
Table 7 Nei’s (1978) genetic identity (I, above diagonal) and genetic distance (D, below diagonal) of eight Litsea szemaois popula-
tions.Population codes are given in Table 1.
勐仑 ML
纳板河
NBH
过门山
GMS
小糯友
XNY
曼点
MD
龙林
LL
基诺山
JNS
景洪
JH
勐仑 ML **** 0.9761 0.8882 0.8664 0.9047 0.8579 0.8392 0.8343
纳板河 NBH 0.0242 **** 0.8902 0.8648 0.8976 0.8583 0.8313 0.8233
过门山 GMS 0.1185 0.1163 **** 0.9640 0.9466 0.8944 0.8928 0.8965
小糯友 XNY 0.1434 0.1453 0.0367 **** 0.9318 0.8890 0.8773 0.9151
曼点 MD 0.1002 0.1080 0.0549 0.0706 **** 0.9468 0.9455 0.9280
龙林 LL 0.1533 0.1528 0.1116 0.1176 0.0547 **** 0.9412 0.9415
基诺山 JNS 0.1753 0.1848 0.1134 0.1309 0.0561 0.0607 **** 0.9284
景洪 JH 0.1811 0.1945 0.1093 0.0887 0.0748 0.0603 0.0743 ****





图2 思茅木姜子居群的Nei’s(1978)遗传距离的UPGMA聚类图(居群代号同表1)
Fig. 2 UPGMA dendrogram of Litsea szemaois populations based on Nei’s (1978) genetic distance. Population codes are given in
Table 1.


0.9761; 遗传距离(D)的范围从0.0242–0.1945(表7)。
其中, 勐仑(ML)和纳板河(NBH)居群间的遗传一致
度最高(I = 0.9761), 遗传距离最近(D = 0.0242), 同
时在UPGMA聚类图中也聚在了一起 ; 纳板河
416 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 14卷
(NBH)与景洪居群间的遗传一致度最低(I = 0.8233),
遗传距离最远(D = 0.1945), 在UPGMA聚类图中各
自的分支也距离最远(图2)。经Mantel检测, 居群间
的遗传距离和地理距离之间不存在显著的正相关
关系(r =0.0925, P=0.6931)。
3 讨论
3.1 遗传多样性
通常认为特有种、濒危种和狭域种的遗传多样
性水平较低 (Hamrick & Godt, 1990; Falk &
Holsinger, 1991; 洪德元等, 1995; Li et al., 2002)。但
是也有研究报道表明有些特有种、狭域种甚至濒危
种也能保持较高水平的遗传多样性(Richter et al.,
1994; Ge et al., 1997; Kang et al., 2000; Zawko et al.,
2001; Xue et al., 2004; 宋卫华等, 2004)。
思茅木姜子虽然是仅分布于云南省南部热带
季雨林的特有狭域树种, 却具有较高水平的遗传多
样性。与已有研究报道的樟科其他物种相比, 如舟
山新木姜子 (Neolitsea sericea)的遗传多样性为
PPB=50.5%; 其中自然居群PPB =23.1%(Chung et
al., 2000; Wang et al., 2005); 厚壳桂(Cryptocarya
chinensis)种群ISSR分析的遗传多样性为15.29%(王
峥峰等, 2005), 思茅木姜子的遗传多样性水平明显
较高。与同样利用ISSR技术对其他特有或濒危狭域
分布的物种所进行的遗传多样性分析的研究结果
相比, 思茅木姜子的遗传多样性水平也明显偏高
(表8)。
导致狭域、濒危物种具有高水平遗传多样性的
因素有很多, 如新种形成、繁育系统、形态突变、
多次奠基者效应或者冰期残余种等(Ranker, 1994;
Lewis & Crawford, 1995; Maguire & Sedgley, 1997;
Zawko et al., 2001)。朱华和蔡琳(2005)的研究表明,
思茅木姜子所属的云南热带季雨林是在晚第三纪
(中新世)以后、青藏高原强烈隆升到相当高度、东
亚季风气候形成以后才发育的。因此, 思茅木姜子
的种群发生与居群分化的时间较晚。同时我们推测
它可能拥有一个广泛连续分布且具丰富遗传基础
的祖先, 随着人类活动的日益频繁, 生境的片断化




表8 思茅木姜子与其他特有或狭域濒危物种的ISSR遗传多样性分析结果比较
Table 8 Genetic diversity comparison between Litsea szemaois and other endemic or narrow endangered species based on ISSR
data
物种
Species
生态现状
Ecological position
多态位点百分
率
PPB(%)
有效等位基
因数
Ne
Nei’s 基因多
样性
H
Shannon’s 信
息指数
Ho
文献
References
思茅木姜子
Litsea szemaois
特有、狭域、濒危
Endemic, narrow and endangered
87.01 1.4006 0.2466 0.3826 本研究
The present study
明党参
Changium smyrnioides
特有、濒危
Endemic and endangered
84.70 1.4 0.24 0.37 Qiu et al.. (2004)
景东报春
Primula interjacens
特有、狭域、濒危
Endemic, narrow and endangered
75.47 – 0.3205 0.4618 Xue et al. (2004)
华木莲
Manglietia decidua
特有
Endemic
17.28 1.1156 0.0649 0.0936 廖文芳等
Liao et al. (2004)
卵叶海桑
Sonneratia ovata
濒危
Endangered
68.65 1.2218 0.1411 0.2292 李海生和陈桂珠
Li & Chen (2004)
黄山梅
Kirengeshoma palmate
濒危
Endangered
79.00 1.55 0.31 0.45 Zhang et al.(2006)
四合木
Tetraena mongolica
特有、濒危
Endemic and endangered
63.30 1.368 0.213 0.324 Ge et al. (2003)
长果秤锤树
Sinojackia dolichocarpa
特有、濒危
Endemic and endangered
72.99 1.3726 0.2255 0.3453 Cao et al. (2005)
五针白皮松
Pinus squamata
特有、濒危
Endemic and endangered
12.30 1.032 0.03 0.02 张 志 勇 和 李 德 铢
Zhang & Li (2005)
Ne, Effective number of alleles; H, Neis gene diversity; Ho, Shannons information index

第 5期 陈俊秋等: 樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的 ISSR分析 417

不断加剧, 形成一些基因交流有限且不连续分布的
居群, 以至于思茅木姜子虽然保留了其祖先丰富的
总体遗传多样性, 但各居群的个体数目和分布范围
变小, 居群间分化小, 遗传基础趋于一致, 并最终
导致了思茅木姜子在居群水平上遗传多样性相对
较低。
3.2 遗传结构
虽然对思茅木姜子繁育系统的研究尚未见报
道, 但Rohwer(1993)认为所有樟科植物都倾向于异
交, 它们具有雌雄蕊同步异熟的开花机制: A型为
雌蕊早晨开放、中午关闭, 雄蕊在当日或次日下午
开放; B型为雌蕊下午开放、晚上关闭, 雄蕊在次日
早晨开放。这种机制有效地防止了自花授粉的发
生。当这种机制因气候条件改变而被打乱时, 可能
发生同株授粉, 但所产生的果实在幼果期就会脱
落。Bussell(1999)曾对35个物种的RAPD研究结果进
行了总结, 发现29个远交物种的居群间变异在总的
遗传变异中占 0.9–41.3%, 而 6个近交物种则为
44.8–66.9%。Hogbin和Peakall(1999)也总结了7个物
种的RAPD分析结果, 发现异交物种的遗传变异主
要分布在居群内, 而居群间的遗传变异分布通常不
足27%。根据本研究得出的思茅木姜子居群间遗传
分化参数 , 即Nei’s基因分化指数Gst=0.37, Shan-
non’s居群分化系数((Hsp–Hpop)/ Hsp)为0.45, AMOVA
分析显示居群间变异占总变异的27.01%, 我们推断
思茅木姜子的繁育系统类型属于异交型, 这正好与
Rohwer(1993)的结论相符合, 并且可能是其居群间
遗传分化较小的原因之一。
樟科植物的种子主要依靠鸟类散布, 也有依靠
重力散布的(Rohwer, 1993)。我们在对思茅木姜子进
行野外考察取样时发现, 在每棵母株下方区域内都
有很多幼苗, 因此我们推断思茅木姜子主要依靠重
力散布种子, 这可能是思茅木姜子基因流较小的主
要原因。现代越来越多的研究证明, 基因流强弱对
群体遗传分化具有重要影响(Hartl & Clark, 1989;
葛颂, 2001)。如果说, 自然选择是导致居群分化最
主要的力量, 那么基因流则是对抗选择作用的重要
因素(葛颂, 1994)。居群遗传学理论认为, 当基因流
小于1时, 就不足以抵制居群内因遗传漂变而引起
的居群间遗传分化(Slatkin, 1985)。思茅木姜子的基
因流小于1(Nm=0.8513), 很容易发生遗传漂变, 因
此遗传漂变可能是影响其遗传分化的重要因素之
一。
Harmrick和Godt(1990)的研究表明, 居群的地
理分布和遗传多样性分布没有直接的相关性。经过
Mantel检测, 本研究结果表明思茅木姜子的遗传距
离和地理距离之间同样没有显著的相关性
(r=0.0925, P=0.6931)。比较思茅木姜子的居群分布
图(图1)和UPGMA聚类图(图2), 我们不难看出其地
理距离与遗传距离并没有呈现出显著的相关性, 其
中仅有过门山(GMS)和小糯友(XNY)居群间的地理
距离较近, 在聚类图上也聚在了一起; 曼点(MD)和
纳板河 (NBH)居群间的地理距离最近 , 但在
UPGMA聚类图(图2)中, 曼点(MD)却和地理距离较
远的龙林(LL)聚在一起, 而纳板河(NBH)也和地理
距离较远的勐仑(ML)聚在一起且单独形成一支。因
此, 地理隔离对思茅木姜子居群遗传分化没有显著
影响。
3.3 濒危机制和保护措施
Williamson和Werth(1999)认为狭域分布但遗传
多样性水平特别高的濒危种, 并没有经历过瓶颈效
应 , 而且其居群内的近交不一定导致自交衰退
(inbreeding depression), 因此其濒危状况是原生境
片断化且地理隔离和人类干扰加强的结果, 这正好
符合我们对思茅木姜子致濒的推断。人类活动所导
致的森林片断化、生境恶化甚至丧失, 可能使原来
广泛连续分布的高水平遗传多样性的大种群片断
化分布为地理隔离、范围狭小的各个小种群; 栖息
地的变小造成种群内个体数量的减少, 而个体数量
变小可能导致基因流水平下降和遗传漂变, 这可能
是思茅木姜子濒危的主要原因, 同时也正是许多濒
危物种的致濒因素(Eriksson et al., 1995)。
思茅木姜子虽然在物种水平上具有较高水平
的遗传多样性(PPB=87.01%), 但是在种内居群水平
上其遗传多样性却较低(PPB=37.99%), 而且居群间
基因流有限(Nm=0.8513), 使小群体的遗传多样性降
低, 如景洪(JH)居群仅有4个个体, PPB=18.18%。这
将会危及整个居群的生存。虽然曼点(MD)居群具有
最高的遗传多样性(有31个个体, PPB=72.73%), 但
其分布范围和种群数量相对于其他物种仍然非常
有限, 如果不能有效维持居群大小和自然更新, 同
样可能引起居群的退化甚至灭绝, 使物种的濒危程
度加剧(李昂和葛颂, 2002)。此外, 因缺乏有效的基
因流, 可能导致居群内遗传基础趋于一致和适应度
418 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 14卷
的降低, 随之可能发生的随机漂变将加大居群间分
化(刘占林和赵桂仿, 1999), 这将使思茅木姜子不能
有效地维持目前的遗传多样性水平, 加剧其濒危程
度。
参照其他濒危物种保护遗传学的研究结果
(Hogbin & Peakall, 1999; 葛颂 , 2001; Li et al.,
2002), 我们提出以下保护建议: (1) 针对思茅木姜
子总体遗传多样性水平较高, 但居群数量和各居群
个体数量都较少的现状, 对现存所有居群的所有个
体实施及时有效的就地保护, 尤其是遗传多样性水
平最高的曼点(MD)居群, 以及遗传多样性水平最
低且只有4个个体的景洪(JH)居群, 应该得到林业
部门和保护区的特别重视; (2) 因为遗传变异主要
分布在各居群内的个体间, 所以需要在各居群内进
行大量的采样用于迁地保护研究。而各居群间存在
一定的遗传分化, 因此有必要采用不同居群间进行
混合繁殖和相互移植的方法, 以提高其遗传多样性
水平。
本项研究旨在为思茅木姜子的保护生物学研
究提供遗传变异水平及遗传结构等遗传学信息基
础; 而一个物种的濒危是许多内外因素综合作用的
结果。因此, 尚需进一步深入探讨思茅木姜子的进
化历史、繁育系统、演替阶段等问题, 以进一步准
确揭示它的濒危机制, 从而制定出合理有效的保护
政策和措施。
致谢: 在本项研究的野外实地考察与样品取样阶段
承蒙陶国达老师的鼎力支持, 在随后样品种类的分
类鉴定阶段也得助于李锡文老师的大力协助; 论文
的绘图工作得到了李红梅老师的大力帮助; 此外,
不论是在野外还是在实验室工作中都得到了汪书
丽、田婕、赵建立和钟晋顺等同学的积极帮助, 谨
致谢忱。
参考文献
Bussell JD (1999) The distribution of random amplified poly-
morphic DNA (RAPD) diversity amongst populations of
Isotoma petraea (Lobeiaceae). Molecular Ecology, 8,
775–789.
Cao PJ, Yao QF, Ding BY, Zeng HY, Zhong YX, Fu CX, Jin
XF (2005) Genetic diversity of Sinojackia dolichocarpa
(Styracaceae), a species endangered and endemic to
China, detected by inter-simple sequence repeat (ISSR).
Biochemical Systematics and Ecology, 33, 1246–1257.
Chung MG, Chung MY, Oh GS, Epperson BK (2000) Spatial
genetic structure in a Neolitsea sericea population (Lau-
raceae). Heredity, 85, 490–497.
Doyle JJ, Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure
for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical
Bulletin, 19, 11–15.
Eriksson G, Namkoong G, Robert J (1995) Dynamic conserva-
tion of forest tree gene resources. Forest Genetic Re-
sources, 23, 2–5.
Excoffier L (1993) Analysis of Molecular Variance (AMOVA)
Version 1.55. Genetics and Biometry Laboratory, Univer-
sity of Geneva, Switzerland.
Falk DA, Holsinger KE (1991) Genetics and Conservation of
Rare Plants. Oxford University Press, New York.
Fu LK (傅立国), Jin JM (金鉴明) (1992) The Red Data Book
of China’s Plants: Rare and Endangered Species Vol.1.
(中国植物红皮书 : 稀有濒危植物 (第一卷 )), pp.
242–260. Science Press, Beijing. (in Chinese)
Ge S (葛颂) (1994) Allozyme and plant evolutionary biology
study. In: Plant Evolutionary Biology (植物进化生物学)
(eds Chen JK (陈家宽), Yang J (杨继)), pp. 153–208.
Wuhan University Press, Wuhan. (in Chinese)
Ge S (葛颂) (2001) Application of DNA molecular marker in
conservation biology. In: Molecular Markers in System-
atic and Evolutionary Botany (系统与进化植物学中的分
子标记) (eds Zou YP (邹喻苹), Ge S (葛颂), Wang XD
(王晓东)), pp. 140–149. Science Press, Beijing. (in Chi-
nese)
Ge S, Zhang DM, Wang HQ, Rao GY (1997) Allozyme varia-
tion in Ophiopogon xylorrhizus, an extreme endemic spe-
cies of Yunnan, China. Conservation Biology, 11,
562–565.
Ge XJ, Yu Y, Zhang NX, Chen HS, Qi WQ (2003) Genetic
variation in the endangered Inner Mongolia endemic shrub
Tetraena mongolica Maxim. (Zygophyllaceae). Biological
Conservation, 111, 427–434.
Guo XR (郭晓荣), Cao KF (曹坤芳), Xu ZF (许再富) (2004)
Response of photosynthesis and antioxygenic enzymes in
seedlings of three tropical forest tree species to different
light environments. Chinese Journal of Applied Ecology
(应用生态学报), 15, 377–381. (in Chinese with English
abstract)
Hamrick JL, Godt MJW (1990) Allozyme diversity in plant
species. In: Plant Population Genetics, Breeding and Ge-
netic Resources (eds Brown AHD, Clegg MT, Kahler AL,
Weir BS), pp. 43–63. Sinauer, Sunderland, MA.
Hartl DL, Clark AG (1989) Principle of Population Genetics,
2nd edn. Sinauer, Sunderland, MA.
Hogbin PM, Peakall R (1999) Evaluation of the contribution of
genetic research to the management of the endangered
plant Zieria prostrate. Conservation Biology, 13,
514–522.
Hong DY (洪德元), Ge S (葛颂), Zhang DM (张大明), Wang
XQ (汪小全), Cheng SZ (程树志) (1995) Principle and
approaches to studying the mechanisms of plant rarity and
第 5期 陈俊秋等: 樟科濒危植物思茅木姜子遗传多样性的 ISSR分析 419
endangerment principles and methods of plant endanger-
ing mechanism. In: Advances in Biodiversity Re-
search—Proceedings of the 1st National Symposium on
the Conservation and Sustainable Use of Biodiversity Ad-
vances in Biodiversity Research (生物多样性研究进展
——首届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文
集) (eds Qian YQ (钱迎倩), Zhen RD (甄仁德)), pp.
125–133. Chinese Science and Technology Press, Beijing.
(in Chinese)
Huang JC, Sun M (2000) Genetic diversity and phylogenetic
relationships of sweet potato and its wild relatives in Ipo-
moea series Batatas (Convovulaceae) as revealed by in-
ter-simple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis
of chloroplast DNA. Theoretical and Applied Genetics,
100, 1050–1060.
Joshi SP, Gupta VS, Aggarwal RK, Ranjekar PK (2000) Ge-
netic diversity and phylogenetic relationship as revealed
by inter-simple sequence repeat(ISSR) polymorphism in
the genus Oryza. Theoretical and Applied Genetics, 100,
1311–1320.
Kang U, Chang CS, Kim YS (2000) Genetic structure and con-
servation considerations of rare endemic Abeliophyllum
distichum Nakai (Oleaceae) in Korea. Journal of Plant
Research, 113, 127–138.
Kojima T, Nagaoka T, Noda K (1998) Genetic linkage map of
ISSR and RAPD markers in Einkorn wheat in relation to
that of RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics,
96, 37–45.
Lewis PO, Crawford DJ (1995) Pleistocene refugium endemics
exhibit greater allozymic diversity than widespread con-
geners in the genus Polygonella (Polygonaceae). Ameri-
can Journal of Botany, 82, 141–149.
Li A (李昂), Ge S (葛颂) (2002) Advances in plant conserva-
tion genetics. Biodiversity Science (生物多样性), 10,
61–71. (in Chinese with English abstract)
Li HS (李海生), Chen GZ (陈桂珠) (2004) Genetic diversity of
Sonneratia ovata (Sonneratiaceae) in China detected by
inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis. Guihaia (广
西植物), 24, 17–22. (in Chinese with English abstract)
Li J, Christophel DC, Conran JG, Li XW (2004) Phylogenetic
relationships within the ‘core’ Laureae (Litsea complex)
(Lauraceae) inferred from sequences of the chloroplast
gene matK and nuclear ribosomal DNA ITS regions. Plant
Systematics and Evolution, 246, 19–34.
Li J (李捷), Li XW (李锡文) (2006) Notes on the plants of the
genus Litsea Lam. (Lauraceae) from China. Acta Botanica
Yunnanica (云南植物研究), 28, 103–107. (in Chinese
with English abstract)
Li QM, Xu ZF, He TH (2002) Ex situ conservation of endan-
gered Vatica guangxiensis (Dipterocarpaceae) in China.
Biological Conservation, 106, 151–156.
Liao WF (廖文芳), Xia NH (夏念和), Deng YF (邓云飞),
Zheng QY (郑庆衍) (2004) Study on genetic diversity of
Manglietia decidua (Magnoliaceae). Acta Botanica Yun-
nanica (云南植物研究), 26, 58–64. (in Chinese with Eng-
lish abstract)
Liu ZL (刘占林), Zhao GF (赵桂仿) (1999) Population genet-
ics and its implications for conservation of rare and en-
dangered plants. Chinese Biodiversity (生物多样性), 7,
340–346. (in Chinese with English abstract)
Maguire TL, Sedgley M (1997) Genetic diversity in Banksia
and Dryandra (Proteaceae) with emphasis on Banksia
cuneata, a rare and endangered species. Heredity, 79,
394–401.
McDermott JM, McDonald BA (1993) Gene flow in plant
pathosystems. Annual Review of Phytopathology, 31,
353–373.
Miller MP (1997) Tools for Population Genetics Analysis
(TFPGA), Version 1.3. Department of Biological Sci-
ences, Northern Arizona University, Flagstaff.
Nei M (1973) Analysis of gene frequencies in subdivided
populations. Proceedings of the National Academy of Sci-
ences, USA, 70, 3321–3323.
Nei M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic
distance from a small number of individuals. Genetics, 89,
583–590.
Nei M (1987) Molecular Evolutionary Genetics, pp. 187–192.
Columbia University Press, New York.
Prevost A, Wilkinson MJ (1998) A new system of comparing
PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cul-
tivars. Theoretical and Applied Genetics, 98, 107–112.
Qian W (钱韦), Ge S (葛颂), Hong DY (洪德元) (2000) As-
sessment of genetic variation of Oryza granulata detected
by RAPDs and ISSRs. Acta Botanica Sinica (植物学报),
42, 741–750. (in Chinese with English abstract)
Qiu YX, Hong DY, Fu CX, Cameron KM (2004) Genetic
variation in the endangered and endemic species Chan-
gium smyrnioides (Apiaceae). Biochemical Systematics
and Ecology, 32, 583–596.
Ranker TA (1994) Evolution of high genetic variability in the
rare Hawaiian fern Adenophorus periens and implications
for conservation management. Biological Conservation,
70, 19–24.
Richter TS, Soltis PS, Soltis DE (1994) Genetic variation
within and among populations of the narrow endemic
Delphinium viridescens (Ranunculaceae). American
Journal of Botany, 81, 1070–1076.
Rohwer JG (1993) Lauraceae. In: The Families and Genera of
Vascular Plants Vol. II (eds Kubitzki K, Rohwer JG,
Brittrich V), pp. 366–391. Springer-Verlag, Berlin.
Slatkin M (1985) Gene flow in natural populations. Annual
Review of Ecology and Systematics, 16, 393–430.
Sankar AA, Moore GA (2001) Evaluation of inter-simple se-
quence repeat analysis for mapping in Citrus and exten-
sion of the genetic linkage map. Theoretical and Applied
Genetics, 102, 206–214.
Song WH (宋卫华), Li XD (李晓东), Li XW (李新伟), Huang
HW (黄宏文), Li JQ (李建强) (2004) Genetic diversity
and conservation strategy of Psilopeganum sinense, a rare
420 生 物 多 样 性 Biodiversity Science 第 14卷
species in the Three-Gorges Reservoir area. Biodiversity
Science (生物多样性), 12, 227–236. (in Chinese with
English abstract)
Wang ZF (王峥峰), Gao SH (高三红), Tian SN (田胜尼), Fu
SL (傅声雷), Ren H (任海), Peng SL (彭少麟) (2005)
Genetic structure of Cryptocarya chinensis in fragmented
lower subtropical forests in China based on ISSR markers.
Biodiversity Science (生物多样性), 13, 324–331. (in Chi-
nese with English abstract)
Wang ZS, An SQ, Liu H, Leng X, Zheng JW, Liu YH (2005)
Genetic structure of the endangered plant Neolitsea
sericea (Lauraceae) from the Zhoushan Archipelago using
RAPD markers. Annals of Botany, 95, 305–313.
Williamson PS, Werth CR (1999) Levels and pattern of genetic
variation in the endangered species Abronia macrocarpa
(Nyctaginaceae). American Journal of Botany, 86,
293–301.
Xue DW, Ge XJ, Hao G, Zhang CQ (2004) High genetic diver-
sity in a rare, narrowly endemic primrose species: Primula
interjacens by ISSR analysis. Acta Botanica Sinica(植物
学报), 46, 1163–1169.
Yang SD (杨淑达), Shi SH (施苏华), Gong X (龚洵), Zhou
RC (周仁超) (2005) Genetic diversity of Paeonia delavayi
as revealed by ISSRs. Biodiversity Science (生物多样性),
13, 105–111. (in Chinese with English abstract)
Yeh EC, Yang RC, Boyle TBJ, Ye ZH, Mao JX (1997) POP-
GENE, the user-friendly shareware for population genetic
analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre,
University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada.
Zawko G, Krauss SL, Dixon KW, Sivasithamparam K (2001)
Conservation genetics of the rare and endangered Leuco-
pogon obtectus (Ericaceae). Molecular Ecology, 10,
2389–2396.
Zhang FM (张富民), Ge S (葛颂) (2002) Data analysis in
population genetics.Ⅰ. Analysis of RAPD data with
AMOVA. Biodiversity Science( 生 物 多 样 性 ), 10,
438–444. (in Chinese with English abstract)
Zhang XP, Li XH, Qiu YX (2006) Genetic diversity of the
endangered species Kirengeshoma palmate (Saxifra-
gaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 34, 38–47.
Zhang ZY (张志勇), Li DZ (李德铢) (2003) Conservation
genetics of an extremely endangered pine, Pinus squa-
mata. Acta Botanica Yunnanica (云南植物研究), 25,
544–550. (in Chinese with English abstract)
Zhu H (朱华), Cai L (蔡琳) (2005) Biogeography of the tropi-
cal rain forest of Yunnan and some implications to geo-
logical history. Advances in Earth Science (地球科学进
展), 20 (Suppl.), 1–57. (in Chinese with English abstract)

(责任编委: 王艇 责任编辑: 时意专)