全 文 ：作者简介:蒋锦琴 ,女 ,实验师 ,主要从事医学微生物学的教学和研究工作。
　*通讯作者:杭州延安路 353号;电话:0571 -87217385;传真:0571 - 87217044;电子信箱:yanchen@m ai.l hz. z.j cn
蔷薇科植物果核油性提取物的体内外抗幽门螺杆菌作用
蒋锦琴 1 ,罗冬娇 2 ,严杰 3*(1.浙江医学高等专科学校 ,杭州 310053;2. 杭州师范学院基础医学部 ,杭州 310018;3. 浙江大学医学院病
原生物学教研室 ,杭州 310031)
摘要:目的　观察蔷薇科植物果核油性提取物初提液和提纯液体内外抗幽门螺杆菌(Helicobacter py lori, Hp)的作用。方法　
从胃炎和消化性溃疡患者胃黏膜活检标本中分离 Hp临床菌株。分别采用二倍平皿稀释法和试管法测定油性提取物初提液
和提纯液对 96株 Hp的 M IC和 MBC。建立 Hp小鼠感染模型 , 检测油性提取物初提液和提纯液体内抗 H p的效果。结果　从
患者胃黏膜活检标本中分离获得 96株 H p。 油性提取物初提液和提纯液对上述 Hp菌株的 M IC
90
分别为体积分数 0. 16%和
0. 32%。体积分数为 0. 16%油性提取物初提液作用 5 m in及体积分数为 0. 16%的提纯液作用 15 m in即可杀灭 H p
NCTC11637株 、临床菌株 75b和 81a株。所有感染小鼠胃窦部组织 Hp SS1株分离培养结果均阳性 , 体积分数为 0. 5%的油性
提取物初提液和提纯液灌小鼠 Hp分离培养结果均阴性。结论　较低浓度的蔷薇科植物果核油性提取物初提液和提纯液即
有体内抗 H p的作用 ,具有进一步开发抗 H p口服液的价值。
关键词:蔷薇科植物果核;油性提取物;幽门螺杆菌;抑菌作用;杀菌作用
中图分类号:R282. 710. 5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1007-7693(2006)05-0355-04
E ffec ts of oiliness extrac ts from rose fam ily plant fruit core againstHelicobacter pylori in vitro and in vivo
JIANG Jin-qin 1 , LOU Dong-jiao2 , YAN Jie3*(1. ZhejiangM edicineCollege, Hangzhou 310053, China;2. D epartm ent ofBasic
M edicine, Hangzhou Teachers College, Hangzhou 310018, China;3. Departmen t of Medica lM icrobiology and Parasitology, College of
M edicine, Zhejiang Un iversity, Hangzhou 310031, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To determ ine the e ffects o f original and pu rified o iliness ex tracts from ro se fam ily plan t fru it co re against
Helicobacter py lori in v itro and in v ivo. METHODS　C lin ica lH. py lori strains we re iso la ted from ga stric biopsy specim ens of patients
w ith gastritis and /or peptic u lce r. Doub ling agar dilution m e thod and te st tube me thod w ere app lied to detec t theM IC andMBC o f the
o rig ina l and purified o iliness ex tracts aga inst the iso la tes ofH. py lori. H. py lori in fe ction m ouse model wa s established to de te ct the ac-
tiv itie s of the orig inal and purified oiline ss extrac ts aga inst them icrobe in v ivo. RESULTS　96 strains ofH. py loriw ere obtained from
the patien tsgastric b iopsy specimens. M IC90 va lues of the orig ina l and purified oiline ss ex trac ts ag ainst the 96 stra ins o fH. py loriw ere
0. 16% and 0. 32% a t vo lume fraction, respective ly. H. py lori stra in NCTC11637 and its c linica l strains 75b and 81a we re killed after
treated w ith vo lum e frac tion 0. 16% o f the o rig ina l oiliness extract fo r 5 m in and vo lum e frac tion 0. 16% of the purified oiline ss ex trac t
for 15 m in. A ll the gastric antrum tissue sam ples from the infec ted m ice we re positive forH. py lori stra in SS1. A fter theH. py lori strain
SS1 infected m ice we re o ra lly taken w ith vo lume fraction 0. 5% of the orig ina l o r purified o iliness ex tract, all the gastric antrum tissue
sam ples from them icew ere nega tive fo rH. pylori strain SS1 iso lation. CONCLUSION　Re lative ly low concen tra tions o f the o rig ina l
and pu rified oiline ss ex trac ts from rose fam ily p lant fruit core show rem a rkable activ itie s to inhibit and killH. py lori in vitro and in vivo.
The oiline ss ex trac ts have an value for furthe r deve lop ing an anti-H. py lori oral-taken medic ine.
KEY WORDS:ro se fam ily p lant fruit core;o iline ss ex tract;H elicobacter py lori;bacteriostasis;ste riliza tion
　　幽门螺杆菌(Helicobacter py lori, Hp)感染与胃炎 、消化
性溃疡 、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤以及肠
型胃癌密切相关 [ 1] , WHO已于 1994年将其列为胃癌的 I类
生物致癌因子 [ 2] 。为了探寻具有良好抗菌效果 、不良反应小
抗 H p药物 ,本实验检测了蔷薇科植物提取物体内外抗幽门
螺杆菌效果 , 以作抗幽门螺杆菌新型中医药开发依据。
1　材料与方法
1. 1　受试药物
试验药蔷薇科植物山楂 (Crataegu s)果核油性提取物由
北京中庆奇方生物科技有限公司提供 , 有粗提液和提纯液两
种制品 , 外观棕色透明 , 有辛辣味和挥发性。对照药乳酸左
氧氟沙星由浙江省医药股份有限公司新昌制药厂生产 , 批号
0203222,纯度为 98. 5%。
1. 2　菌株及培养
采集浙江大学医学院附属邵逸夫医院和浙江省中医院
各种胃炎或消化性溃疡患者胃黏膜活检标本 ,尿素酶试验阳
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DOI牶牨牥牣牨牫牱牬牳牤j牣cnki牣issn牨牥牥牱牠牱牰牴牫牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牥牫
性者匀浆后 , 接种于含 8%脱纤维羊血的选择性哥伦比亚琼
脂 (bioM erieux)(含终浓度分别为 5 mg /L TM P、10 mg /L万古
霉素 、 2500 u /L多粘菌素和 2 m g /L两性霉素 B)平板上 ,
37℃微需氧培养 3 ～ 5 d。挑取疑似菌落增菌 ,若染色镜检为
弧形或 “海鸥”状革兰阴性杆菌 、尿素酶 (HPUT, 福建三强生
物)和氧化酶试验(杭州天和微生物试剂有限公司)阳性 、与
H p全菌抗体(DAKO)发生凝集者鉴定为 H p[ 3] 。采用哥伦比
亚血琼脂平板 37℃微需氧培养所获得的 96株 Hp临床菌株
及浙江大学医学院病原生物学教研室提供的 Hp NCTC11637
和 SS1株。
1. 3　H p感染小鼠模型的制备
BALB /c小鼠由上海复旦大学动物中心提供 ,清洁级 ,雌
性 , 6 ～ 8周龄 ,体重(18±1)g。用 pH 7. 4的 0. 01 mo l /L PBS
收集 H p SS1株新鲜培养物 ,采用麦氏比浊法及布氏肉汤(bi-
oM e rieux)配制成浓度为 5×1010 CFU /m L的菌液。小鼠 H p
感染前 12 h禁食不禁水 , 感染前 30 m in灌喂 0. 1 mo l /L NaH-
CO 3 0. 2 m L中和胃酸 , 感染后 4 h内禁食禁水 [ 4] 。然后灌喂
上述菌液 0. 2 mL, 共灌喂 3次 ,每次间隔 1 d [ 5] 。
1. 4　体外抑菌试验
采用二倍平皿稀释法测定各药物的 M IC。该油性提取
物用无水乙醇助溶 , 然后用灭菌生理盐水稀释。在平皿中定
量加入各药物 , 在高压蒸汽灭菌后冷却至 50 ～ 60℃的哥伦比
亚琼脂中加入 8%羊血 (不含任何抗生素), 定量倾注平板 ,
使平板中油性提取物初提液和提纯液最终体积分数均分别
为 5, 2. 5, 1. 25, 0. 64, 0. 32, 0. 16, 0. 08, 0. 04, 0. 02, 0. 01%,对
照药乳酸左氧氟沙星浓度分别为 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0. 5, 0. 25,
0. 12, 0. 06, 0. 03μg /mL。新鲜培养的 H p用灭菌生理盐水配
制成 2×108CFU /mL的菌液 ,取 5 μL点种于平板上 , 每点菌
数为 1×106CFU。实验中以 H p NCTC11637株为质控菌株 ,
并设置在不含任何药物平板上接种等量 H p作为正常对照。
在 5%O2 , 10%CO2和 85%N2条件下 , 37℃培养 3 d后观察结
果 , 以 50%和 90%的菌株未生长的药物最高稀释度为其
M IC50和 M IC90值。
1. 5　体外杀菌试验
采用试管法进行 M BC测定。参考 M IC结果 ,在 2%胎牛
血清布氏肉汤(bioMe rieux)中加入合适浓度的试验药和对照
药 , 然后 分 别接 种终 浓度 为 1 × 106 CFU /mL 的 H p
ATCC11637株 、H p临床菌株 75b和 81a,分别作用为 5, 15, 30
和 60m in。实验中同时设置在不加任何药物培养基中接种上
述 H p菌株的对照。各培养物取 0. 05mL涂布于不含药物的
哥伦比亚血琼脂平板上 , 培养条件同上 , 以菌株未生长的药
物最高稀释度为其 MBC值。
1. 6　体内抗 Hp试验
上述小鼠末次接种 Hp两周后 , 将其分为 4组 , 每组 8
只。参考 M IC和 M BC测定结果 , 各组小鼠处理如下:两组试
验组小鼠分别灌喂体积分数为 0. 5%的初提液和提纯液 0. 5
mL;药物对照组灌喂 4 μg /mL乳酸左氧氟沙星 0. 5 m L;剩余
一组小鼠灌喂生理盐水 0. 5 m L;每日 2次 , 连续 5 d。末次灌
喂后 24 h,每只小鼠剖取胃窦部组织标本 2块 , 1块匀浆后接
种于上述含 8%脱纤维羊血的选择性哥伦比亚琼脂平板上进
行 H p分离培养 ,另 1块用 10%甲醛溶液固定 ,用于W arthin-
S ta rry镀银染色法检查 Hp[ 6]。 H p分离培养条件 、鉴定标准
与上述人胃黏膜活检标本相同。
2　结果
2. 1　M IC测定结果
正常对照中各株 H p均生长。 Hp NCTC11637株对乳酸
左氧氟沙星的 M IC100为 0. 5μg /mL在 NCCLS规定的范围内。
油性提取物初提液 、提纯液及对照药乳酸左氧氟沙星对 96
株 H p临床菌株的 M IC范围 、M IC50和 M IC90见表 1。
表 1　蔷薇科植物果核油性提取物体外抑制幽门螺杆菌的效
果
Tab 1　 Effects of the oiliness ex tracts from ro se fam ily plan t
fruit co re on inhibitingH. py lori in v itro
受试药品 菌种(株数) M IC(μg /m L, 试验药 )
*
M IC范围 M IC50 M IC90
初提液 幽门螺杆菌(96) 0. 01～ 0. 32 0. 08 0. 16
提纯液 幽门螺杆菌(96) 0. 01～ 0. 32 0. 08 0. 32
左氧氟沙星 幽门螺杆菌(96) 0. 03～ 4 0. 25 2
注:*乳酸左氧氟沙星 M IC以 μg /mL表示 ,两种试验药 M IC以体积
分数 表示
Note:The m in im al inh ib itory concen tration of levofloxacin lactate w as ex-
p ressed asμg /m L, wh ile the test d rug w as exp ressed as volum e f raction
2. 2　MBC测定结果
油性提取物初提液 、提纯液及对照药乳酸左氧氟沙星对
H pNCTC11637株 、H p临床菌株 75b和 81a株体外杀菌效果
见表 2。
2. 3　体内抗 Hp试验结果
生理盐水对照组小鼠胃窦部组织 Hp分离培养均阳性 ,
所分离的 H p革兰染色和胃窦部组织 W arth in-Starry镀银染
色法检查结果见图 1和 2。油性提取物初提液和提纯液灌喂
小鼠 H p分离培养结果均阴性 , 乳酸左氧氟沙星灌喂小鼠中
仅有 1只(12. 5%)Hp分离培养结果阳性 , 无显著性差异 (χ2
=1. 07, P >0. 05),见表 3。
图 1　从小鼠胃黏膜活检标本中分离的 H p菌株革兰染色后
的形态
F ig 1　Them orphosis ofH. py lori iso lated from mouse gastric bi-
opsy specimen
356 C hin JMAP, 2006 O ctober, Vo.l 23N o. 5　　　　　　　　　　　　　　　中国现代应用药学杂志 2006年 10月第 23卷第 5期
图 2　镀银染色法显示的感染小鼠胃小凹中的 H p(×1000)
F ig 2　TheH. py lori in gastric pits o f the in fec ted m ice by silve r
sta in ingm e thod
表 2　蔷薇科植物果核油性提取物体外杀幽门螺杆菌的效果
Tab 2　 Effects of the oiliness ex trac ts from ro se fam ily plan t
fru it co re on killingH. py lori in vitro
受试药品 药物浓度(μg /m L, 试验药 )* 菌株
药物作用时间(m in)**
5 15 30 60
初提液 0. 16 11637 - - - -
75b - - - -
81 a - - - -
0. 08 11637 + - - -
75b - - - -
81 a + - - -
0. 04 11637 + + - -
75b + + - -
81 a + + - -
提纯液 0. 16 11637 - - - -
75b - - - -
81 a + - - -
0. 08 11637 + - - -
75b - - - -
81 a + + - -
0. 04 11637 + + + -
75b + + - -
81 a + + + -
左氧氟沙星 1 11637 - - - -
75b - - - -
81 a + - - -
0. 5 11637 + - - -
75b - - - -
81 a + + - -
0. 25 11637 + + + -
75b + + - -
81 a + + + +
注:*左氧氟沙星浓度以 μg /m L表示 ,两种试验药浓度均以体积分数
表示;** +:细菌生长, -:未生长
Note:Th e con cen tration of levofloxacin lactate w as expressed asμg /mL,
w hi le the test drug w as exp ressed as volum e f raction;+:w ith bacteria,
-:w ithou t bacteria
表 3　蔷薇科植物果核油性提取物体内抗幽门螺杆菌的效果
Tab 3　 Effects of the oiliness ex tracts from ro se fam ily plan t
fruit co re againstH. py lori in vivo
组　别 动物数(n) 幽门螺杆菌阳性例数(n) 阳性率(%)
初提液 8 0 0
提纯液 8 0 0
左氧氟沙星 8 1 12. 5
生理盐水 8 8 100
3　讨论
为了减少 H p感染相关疾病的发病率 , 目前临床上普遍
采用根除 H p疗法 [ 7] 。但以抗生素为主的联合用药方案治
疗 H p感染 ,易诱导 Hp菌株产生耐药及耐药菌株的流行 [ 8] 。
开发不易形成耐药性 、高效无毒抗幽门螺杆菌新药具有积极
的现实意义 , 从天然植物中研制此类新药无疑是有效途径之
一 [ 9] 。
从表 1可见 , 乳酸左氧氟沙星对 96株 H p临床菌株的
M IC
90
为 2μg /m L, 油性提取物初提液和提纯液对上述 Hp菌
株的 M IC90分别为体积分数 0. 16%和 0. 32%。从表 2可见 ,
1μg /mL乳酸左氧氟沙星作用 15 m in能杀灭 Hp NCTC11637
株 、临床菌株 75b和 81a株 , 体积分数为 0. 16%的油性提取
物初提液作用 5 m in, 体积分数为 0. 16%的提纯液作用 15
m in可杀灭上述 3株 Hp。上述实验结果表明 ,蔷薇科植物果
核油性提取物在极低浓度和较短时间内即可抑制或杀灭
H p, 显示了强大的体外抗 H p效果。 油性提取物提纯液对
H p菌株的 M IC90略低于初提液 , 可能与其中抗菌有效成分在
提纯过程中有所损失有关。
目前认为蒙古沙鼠是 H p最为敏感的动物模型 , 但蒙古
沙鼠至今尚无品系 , 其质量无法控制 [ 5] 。H p一般不易在小
鼠胃组织中定植 , Lee等 [ 10]筛选出一株称之为悉尼 I株(Syd-
ney strain I, SS1)的 H p, SS1株 H p能在 BALB /c等品系小鼠
胃中定植 , SS1株感染 BALB /c小鼠目前已成为标准的 H p感
染动物模型。我们所建立的 Hp感染小鼠动物模型 , 用镀银
染色法可观察到胃小凹中的 Hp,胃窦部组织 H p分离培养均
阳性。采用体积分数为 0. 5%的油性提取物初提液和提纯液
灌后 , 小鼠 Hp分离培养结果均阴性 , 表明该提取物有很强的
体内抗 H p感染的作用。
蔷薇科植物果核油性提取物是从其可食用果实废弃核
中蒸馏获得 , 上述实验结果也证实其在较低浓度时即有较强
的抑制和杀灭 H p及体内抗 Hp作用 , 因此该提取物具有进
一步开发为高效 、安全无不良反应 、廉价抗 Hp口服液的价
值 , 但其有效抗菌成分及其机制不明 , 值得进一步探讨。
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收稿日期:2005-04-06
基金项目:国家 863计划创新药物重大专项资助项目 (No. 2002AA2Z3318, No. 2004AA2Z3C 60);广州市科技计划资助项目 (No. 2005 J1-
C 0151)。
重组人酸性成纤维细胞生长因子的稳定性研究
姚成灿 ,郑青 ,许华 ,赵文 ,吴晓萍 ,苏志坚 ,黄亚东 ,李校堃(暨南大学药学院 ,广州 510632)
摘要:目的　研究重组人酸性成纤维细胞生长因子( rhaFGF)在不同温度下的存放稳定性。方法　 rhaFGF冻干粉和溶媒在 4,
25和 37℃分别保存 30个月;rhaFGF液体在 4℃保存 56d, 在 25和 37℃分别保存 35d。采用 MTT法测定 rhaFGF的生物活性 ,
同时进行外观性状 、水分含量 、pH 值的测量和无菌试验。结果　4℃时 , rhaFGF冻干粉 、液体和溶媒的各项性质在观察期内都
无变化。 25℃时 , rhaFGF冻干粉 、液体的生物活性分别在存放 18个月和 35d有下降趋势。 37℃时 , rhaFGF冻干粉 、液体的生
物活性分别在存放 12个月和 35d有下降趋势。结论　 rhaFGF冻干粉在 4℃时可有效保存 2年;rhaFGF冻干粉溶解后于 4℃
时保存 28d内使用有效;溶媒在 4℃时保存 2年质量稳定。
关键词:重组人酸性成纤维细胞生长因子;生物活性;稳定性
中图分类号:R915. 2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1007-7693(2006)05-0358-03
The stability of recombinant human ac id fibrob last grow th factor
YAO Cheng-can, ZHENG Q ing, XU Hua, ZHAOW en, WU X iao-ping, SU Zh i-jian, HUANG Ya-dong, LIX iao-
kun(College of Pharm acy, J inan Un iversity, Guangzhou 510632, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the stability o f recom binant human ac id fibroblast g row th factor ( rhaFGF) deposited a t 4℃,
25℃ o r 37℃. METHODS　The freeze-d ried powder of rhaFGF and dissolventw ere deposited a t 4℃, 25℃ and 37℃ for 36 months.
The so lution o f rhaFGF powderw as deposited fo r 56 day s at 4℃ and fo r35 day s a t 25℃ and 37℃ respective ly. The b ioac tivity o f rhaF-
GF w as de term ined by MTT me thod, and the appearance, wa ter content, pH and ste rility test w ere a lso obse rved. RESULTS　A ll
proper ties o f rhaFGF freeze-dried pow de r, rhaFGF so lution and d isso lvent we re no t alte red during the obse rvation pe riod at 4℃. H ow-
eve r, the bioactiv ity of rhaFGF freeze-dried powder and its so lu tion decreased after sto rage for 18 m onths o r 35 day s at 25℃ respective-
ly. The bioac tivity of rhaFGF freeze-dried powder and its so lution decreased afte r sto rage fo r12 m onths o r35 day s a t 37℃ respec tively.
CONCLUSION　The freeze-dried pow de r rhaFGF and d isso lvent can be depo sited e ffec tively for 2 yea rs a t 4℃. The so lution o f rhaF-
GF free ze-dried powder can be depo sited effective ly for 28 days a t 4℃.
KEY WORDS:recombinan t hum an acid fibrob last g row th factor ( rhaFGF);bioactiv ity;stability
　　酸性成纤维细胞生长因子(ac id fibrob la st grow th factor, aFGF)是一种能广泛地促进来源于中胚层及神经外胚层细
358 C hin JMAP, 2006 O ctober, Vo.l 23N o. 5　　　　　　　　　　　　　　　中国现代应用药学杂志 2006年 10月第 23卷第 5期