全 文 ：　　重链可变区.试验克隆序列;CB s t rain. GeneBank中 CB s t rain序
列;n.重链可变区多样性基因。
图 4　鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因序列
耐热 DNA 聚合酶(Taq酶)具有一种非模板依赖性
活性 ,这种活性可在 PCR产物的 3′末端加上一个非
配对的脱氧腺嘌呤核苷(A)[ 3] 。载体 pMD18 T 提
供 3′末端单一的 T 凸出尾 ,使该载体能够直接与
PCR产物高效连接。该 TA 克隆技术比其他 PCR
克隆方法有更高的重组效率 ,一般大于 90%阳性克
隆含有目的 DNA片段[ 4] 。
(4)常规 PCR扩增前需制备 、纯化 DNA 模板 ,
有的操作较繁琐 ,耗时较长 ,且需要昂贵的试剂及一
些特殊处理 ,同时在反复的操作中 DNA 量损失也较
大 , 在提取中残留试剂对 PCR反应中的 Taq酶产生
抑制作用。菌落 PCR是以转化菌单个克隆为模板 ,
采用特异性引物或通用引物对目的基因进行扩增 ,用
来鉴定和筛选阳性转化菌的技术 , 省去抽提模板
DNA这一步 ,节省了大量时间和试验成本 ,是一种经
济 、快速 、准确的方法 。
参考文献:
[ 1] 　曲悦 ,邬向东 ,谌南辉.鸡脾细胞总 RNA 的提取及其 VH 、V L基
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学学报 , 2001 , 39(3):201 202.
Cloning and nucleotide sequencing of hight chain variable
genes from species specific monoclonal antibodies against E. acervulina
KANG Gui ying ,QIN Jian hua* ,Ren Shu guang
(College of Animal Science and T ech nology , Hebei Ag riculture Universi ty , Baoding 071001 , C hina)
Key words:C hicken;E. acervu lina;monoclonal ant ibodies;variable genes
Abstract:To study the function of small molecule antibody , hight chain variable genes w hich was amplified f rom Species specific Monoclonal Antibodies a-
gainst E.acervulina was purif ied , and Cloned into clone vector pMD18 T by gene recombination techniques. The recombinant plasmid w as transformed into
E. col i JM109. By screening , several recombinants that had been inserted wi th the target fragments were obtained. The posi tive clones containing recombina-
t ion were idendif ied by the methods of the gene sequenceing. The resul t demonst rated that hight chain variable genes i s 381 bp. (009)
收稿日期:2005 02 25
基金项目:塔里木大学校长基金重点资助项目(2004 4)
作者简介:张苏江(1968 ), 男 ,副教授 , 硕士.
NaCl胁迫对 4种豆科牧草萌发的影响
张苏江1 ,江承凤1 ,李艳霞2
(1.塔里木大学 动科院 ,新疆 阿拉尔 843300;2.石河子大学 动科院 ,新疆 石河子 832003 )
中图分类号:S541 文献标识码:A 文章编号:1004 7034(2006)03 0013 03
关键词:豆科牧草;盐胁迫;萌发
摘　要:应用室内培养皿萌发试验 ,在 0 、0. 6%、1. 2%、1. 8%、2. 4%5 个浓度梯度的 NaC l溶液胁迫
下 ,对苜蓿 、草木樨 、白三叶草 、红三叶草 4种豆科牧草萌发时的耐盐性进行了检测。结果表明:4 种
牧草种子对盐浓度的耐受性不同 ,苜蓿有较强的耐盐性 ,白三叶草和红三叶草次之 ,草木樨最差;胚根
长度与盐浓度呈负相关 ,同时 ,盐浓度对 4种牧草种子的萌发进程有明显滞后的影响;用四唑染色法
间接测定了种子活力 ,其结果与发芽试验的结果基本一致。
　　为研究盐渍化对 4种牧草种子盐胁迫下发芽成 苗的影响 ,探索不同牧草种子盐胁迫下的萌发表现 ,
试验借鉴农作物研究的理论和方法 ,并在实验室条件
下用不同浓度的 NaCl溶液对种子进行处理 ,并观察
其萌发特性 ,以期为生产实践提供有用的依据 ,减少
13　《黑龙江畜牧兽医》2006年第 3期　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　
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Heilong jiang Animal Science
　　　 and V e te rin a ry M edic in e　№ 3 2006
在生产中的损失 ,提高草业生产的经济效益。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
草木樨购于新疆农业大学 ,苜蓿 、白三叶和红三
叶购于乌鲁木齐种子公司(2002年)。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　种子千粒重的检验[ 1] 　将净度检验后的种子
均匀混合 ,每种牧草随机数取 2 份式样各 1 000 粒 ,
然后称重(小粒种子的精确度要求为 0. 01 g)。检验
结果用 2份式样的重量表示 ,如 2份式样的重量之差
不超过允许偏差的 5%时 ,则 2份式样的平均重量即
为种子千粒重。
1. 2. 2　吸水特性的测定[ 2] 　在 19 ℃室温下 ,称取
5 g 供试种子 ,置于清水中(水温 15 ～ 17 ℃) ,每隔
2 h 取出 ,用滤纸将种子表皮的水分吸干 ,称重 ,直至
种子重量基本稳定为止 , 3次重复 。最后计算种子吸
水率 ,计算公式为种子吸水率(%)=[种子吸水量(g)
×5(g)] ×100%。
1. 2. 3　种子萌发试验　精选 4 种豆科优质饱满种
子各 200粒 ,经臭氧消毒 36 h ,再分别用 0 、0. 6%、
1. 2%、1. 8%、2. 4%5种 NaCl溶液浸泡 18 h 。在培
养皿中垫上 2层滤纸 ,分别加各处理浓度溶液至滤纸
饱和为止 。然后摆种置床 ,每个品种 50粒种子 ,在人
工智能植物培养箱中培养 ,每日定时补充所蒸发水
分 ,保持 90%湿度 ,3次重复。萌发时 ,逐日观察记载
发芽种子数 ,在发芽高峰期测量胚根长度。
1. 2. 4　四唑染色法测种子活力　用四唑法(T TC)
来检验种子发芽力和种子活力。T TC 为氯化三苯基
四氮唑的简称 , T TC测定的原理见参考文献[ 1] 。
取种子 50粒 ,2次重复。在 19 ～ 20 ℃室温下在
水中浸泡 12 h 。将浸过的种子浸入 35 ℃的 TTC 溶
液中[配制浓度为 1%,pH 值为 6. 8 ～ 7. 5(用磷酸缓
冲液调配)] 6 h。取浸过的种子置于 5 mL 95%的乙
醇中 ,置研钵中研磨(冰浴中进行),将研浆移入离心
管 ,3 000 ～ 3 500 r /min 离心 10 min。取上清液 ,用
分光光度计(在 490 nm 处)测定光密度 。光密度值
愈高则种子活力愈高[ 3] 。
2　结果与分析
2. 1　种子千粒重(见表 1)
表 1　4 种豆科牧草种子的千粒重 g
牧草种类 苜蓿 草木樨 白三叶 红三叶
测定千粒重 1. 724 7 1. 764 5 0. 587 8 1. 647 7
千粒重是多项品质的综合指标 ,与种子饱满 、坚
实 、均匀 、粒大呈正相关。千粒重也是种子活力的重
要指标 ,种子千粒重大 ,其内部的贮藏物质多 ,发芽迅
速整齐 ,出苗率高 ,幼苗健壮 ,并能够保证田间的成苗
密度 ,从而增加作物产量 。
2. 2　种子的吸水特性
供试 4种豆科牧草种子 ,在水温 16 ～ 17 ℃的吸
水特性如图 1所示。
图 1　4 种豆科牧草种子的吸水率
由图 1可看出 , 4种豆科牧草种子吸水量均在一
段时间里呈上升趋势 ,然后基本达到稳定。在 4种豆
科牧草种子中 ,不同种子的最大吸水量不同。白三叶
吸水量最多 ,苜蓿次之 ,然后是红三叶 ,最后是草木樨。
如果以吸水量达自重的50%来衡量4种牧草种子的早
期吸水速度 ,由快到慢的顺序为红三叶最快;白三叶和
苜蓿居中且相当;草木樨最慢。如果以吸水速度来综
合衡量种子的吸水能力 ,红三叶和苜蓿的吸水能力最
强;白三叶的吸水能力次之 ,表明白三叶有较强的吸水
能力;草木樨的吸水能力居第三 ,草木樨种子需长时间
不断的供应水分 ,才能满足萌发的需要。
2. 3　盐胁迫对种子发芽率的影响
NaCl胁迫下 4种牧草种子的发芽率见表 2。由
表 2可见 ,随着盐浓度的增加 ,各种牧草种子的发芽
率受到显著影响(P <0. 05), NaCl胁迫对 4 种豆科
牧草种子萌发的影响基本上是一致的 ,即随盐浓度的
增加发芽率逐渐降低 ,呈显著的负相关关系。
表 2　NaCl胁迫下 4 种牧草种子的发芽率 %
浓度 苜蓿 草木樨 白三叶 红三叶
0 95a ±0. 02 67a ±0. 08 97a±0. 03 82a±0. 03
0. 6 92a ±0. 03 33b ±0. 01 47b ±0. 13 61b±0. 05
1. 2 65b ±0. 07 29b ±0. 07 13c±0. 08 25c±0. 14
1. 8 53c ±0. 09 14c±0. 12 9c ±0. 08 22c±0. 09
2. 4 0 0 0 0
　　注:同列肩标字母相同或不标者表示差异不显著(P>0. 05),字
母不同者表示差异显著(P<0. 05)。
进一步得出各自的回归方程 ,见表 3 。因牧草种
类不同 ,发芽率下降的程度有所不同 ,盐分浓度每增
加 0. 1%,苜蓿 、草木樨 、白三叶 、红三叶的发芽率分
别下降 2. 4%、1. 5%、2. 4%和 2. 1%。
表 3　发芽率与盐浓度的回归关系
牧草种类 一元回归方程 r F
苜蓿 Y =136. 41 - 24. 40X 0. 883 22. 70
草木樨 Y =75. 20 - 15. 33X 0. 972 103. 80
白三叶 Y =104. 80 - 23. 73X 0. 856 17. 88
红三叶 Y =101. 80 - 21. 33X 0. 986 213. 63
　　NaCl胁迫下 4种牧草种子的萌发曲线见图 2。
由图 2可见 ,随着盐浓度增大 ,曲线基本上呈下降趋
14
势 ,即随着盐浓度的增加发芽率呈减小趋势 ,当浓度
达到 2. 4%时 4种牧草均不发芽 。4种牧草萌发的不
同之处在于 ,在相同盐浓度下苜蓿的发芽率均高于其
他 3种。当浓度为 0. 6%时苜蓿的发芽率略高于对
照组 ,而其他牧草却无此现象 ,说明一定的盐浓度对
苜蓿的萌发有一定的促进作用 。
图 2　NaCl胁迫下 4种牧草种子的萌发曲线
供试各种牧草种子发芽率在不同的时间和不同
的浓度梯度下其值各不相同 ,根据其变化分别绘制出
萌发曲线(见图 3)。由图 3可见 ,总的变化趋势是盐
浓度增大 ,曲线高度下降且趋于平缓 ,说明增强胁迫
使种子累计发芽率降低 ,发芽速度下降 ,发芽整齐度
下降;盐浓度增大 ,曲线左端的点往下往右移动 ,表示
发芽始数减少 ,发芽开始时间推后 。
图 3　NaCl胁迫下各种牧草的萌发曲线
由图 3还可看出 ,除苜蓿以外的 3种牧草胚根的
生长随着盐浓度的增加而表现出阶段性的变化 ,而苜
蓿则无此现象 ,说明盐浓度对苜蓿胚根生长的影响是
均匀加强的 ,且不及其他 3种牧草敏感 。
2. 4　四唑法测定种子活力结果(见图 4 、图 5)
图 4　4 种牧草种子的光密度值　图 5　发芽高峰期的根长
影响四唑染色法测定种子活力的主要因素有种
子硬实度 、纯度及成熟度 。有的种子颗粒小 ,不宜剥
胚测试;种子外壳含有色素 ,易对比色测定产生干扰
等 。所以 ,试验用四唑染色测定种子活力的结果与发
芽试验的结果略有不同 ,但 4种牧草种子活力的大小
顺序是一致的。
3　讨论
(1)浸种能使种皮和胚吸收水分 ,软化种皮 ,提高
种子呼吸强度 ,促进种子内部营养物质的转化 ,从而
提高种子的发芽率 。但有试验表明 ,浸种时间过长
(超过 12 h)将不利于种子的呼吸作用而影响种子发
芽 。此试验浸种时间为18 h ,可能影响了4种牧草的
发芽率 。从试验结果来看 ,白三叶和草木樨所受影响
大于苜蓿和红三叶。
(2)试验采用每天加水补充所蒸发水分的方法 ,
使培养皿中的盐浓度在 1 d内变动较大 ,所得数据并
不是在恒定的盐胁迫下的数据 ,其值并非标准值。
(3)草木樨的种皮下有一层胶质层 ,含有糖类等
营养物质 ,容易滋生霉菌 。在试验中 ,草木樨种子发
霉的较多 ,这可能是草木樨发芽率低的另一原因。
(4)供试 4种牧草各自的休眠期不同 ,这对各种
牧草的发芽率有不同程度的影响。
(5)一种植物抗盐能力的大小是多种代谢的综合
表现 ,如果根据单一的指标来评价植物的抗盐性高
低 ,则不能客观地反应植物的真实抗盐性 ,只有经过
多种指标的综合分析 ,才能客观地评价牧草的真实抗
盐性[ 3] 。所以 ,此次试验的结果可以作为这 4种牧草
耐盐性鉴定的参考数据。
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The influence of NaCl stress at germination stage on 4 species leguminous grass
ZHANG Su jiang
1 , JIANG Cheng feng1 , LI Yan xia2
(1. Ins ti tu te of Animal S cience and Technology , Tarim Universi ty , Alar 843300 , China;
2. Inst itute of Animal Science and Tech nology , Shihezi University , Shihezi 832003 , China)
Key words:Leguminous gras s;sal t s tress;germination
Abstract:T he dif ference of salt t olerance at germination s tage of 4 species leguminous gras s w as preliminary s tudied via NaCl level s:0 , 0. 6%, 1.
2%, 1. 8%, 2. 4%. The resul t sh ow ed:the sal t t olerance of the four w as di fference. Medicago s tativa and T ri folium praten se were best . Trifolium
repew s w as the second and Melilotus Adans was the las t;The correlat ion betw een the length of radicle an d sal t concen t rat ion w as negative int i-
m ate;T he germination process w as retarded by the high salt concent ration sharply;S eed vigor w as also determined via 2 , 3 , 5 T riphenyl Tetrazo-
lium C hloridsde (T TC) test . The resu lt s of TZ test and germinating t rial w ere coincidence. (009)
15　《黑龙江畜牧兽医》2006年第 3期