全 文 ：农业环境科学学报 2010,29(6):1156-1163
Journal of Agro-Environment Science
摘 要：从生长在西北部分矿区的豆科植物根瘤中分离筛选到对重金属有抗性的 38株根瘤菌，采用 PCR-RFLP分子技术进行 16S
rDNA指纹图谱分析，选取每种类型的代表菌株进行 16S rDNA全序列测定，建立系统发育树状图，并对 38株菌进行 Zn、Hg、Cu、Cd
和 Pb 5种重金属的抗性研究。结果表明，供试菌株分别归属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根瘤菌属（Rhizobium）和土壤杆菌属
（Agrobacterium）。代表菌株 CCNWSX1277 和 CCNWSX1294 可耐受 2.0 mmol·L-1的 Zn2+，CCNWSX1277 可耐受 0.25 mmol·L-1的
Hg2+，多数代表菌株可耐受 1.6 mmol·L-1的 Cu2+，仅 3株代表菌株可以耐受 Cd2+，其中 CCNWSX1277能耐受 1.4 mmol·L-1的 Cd2+，
所有代表菌株能耐受 2.5 mmol·L-1的 Pb2+。Agrobacterium属的 2株代表菌株对 5种重金属均有较强的耐受性；而 Rhizobium属的 4
株菌和 Sinorhizobium属的 3株菌对 5种重金属的耐受性不同，表现出较大的差异。总体来看，供试菌株对重金属的耐受性顺序
为 Agrobacterium>Rhizobium>Sinorhizobium。
关键词：矿区；根瘤菌；重金属抗性；16S rDNA RFLP；系统发育
中图分类号：X172 文献标志码：A 文章编号：1672-2043(2010)06-1156-08
西北部分矿区豆科植物根瘤菌重金属抗性
及 16S rDNA RFLP分析
曹 莹，马 宁，常佳丽，赵龙飞，孔召玉，李哲斐，韦革宏
（西北农林科技大学生命科学学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西 杨凌 712100）
Identification and Heavy Metal Toxicity of Rhizobia Isolated from Leguminous Plants in Some Mining Areas
of Northwest China
CAO Ying, MA Ning, CHANG Jia-li, ZHAO Long-fei, KONG Zhao-yu, LI Zhe-fei, WEI Ge-hong
（College of Life Science, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Northwest A & F University, Yangling 712100,
China）
Abstract：The aim of this experiment is to study the phylogeny of rhizobial strains, their resistance to heavy metals and the relationship be－
tween these two aspects. Thirty-eight rhizobial strains were isolated from the leguminous plants which grew in some mining areas of Northwest
China. The genetic diversity of these strains was analyzed by using 16S rDNA PCR-RFLP and the complete 16S rDNA sequences of the rep－
resentative strains to establish the phylogenetic tree. Response to increasing levels of Zn, Hg, Cu, Cd, Pb in media by these strains was ob－
served. The result of the genetic diversity analysis was that these strains belonged to Sinorhizobium, Rhizobium and Agrobacterium based on
16S rDNA phylogenetic tree. Nine strains were selected as representative in the phylogenetic tree. The two strains CCNWSX1277 and CCN－
WSX1294 survived at Zn2+ concentration of 2.0 mmol·L-1. Only one of the nine strains, CCNWSX1277, survived at Hg2+ concentration of 0.25
mmol·L-1. Most of the nine strains survived at Cu2+ concentration of 1.6 mmol·L-1. Only three representative strains could survive any expo－
sure to Cd2+ of which CCNWSX1277 could survive at the highest level of the three（1.4 mmol·L-1 Cd2+）. All nine of these strains survived
at Pb2+ concentration of 2.5 mmol·L-1. Two representative strains, both belonging to Agrobacterium had strong and stable tolerance to all five
kinds of heavy metals. But four representative strains belonging to Rhizobium and three representative strains belonging to Sinorhizobium had
different tolerances to all five kinds of heavy metals. Overall, the genus order of the tolerance to all five heavy metals was Agrobacterium>
Rhizobium>Sinorhizobium.
Keywords：mining areas; rhizobia; resistance to heavy metals; 16S rDNA RFLP; phylogeny
收稿日期：2009－12－24
基金项目：国家自然科学基金（30970003,30900215）
作者简介：曹 莹（1985—），女，硕士，主要从事重金属污染土壤的微生物修复技术研究。E-mail：nov1110cy@163.com
通讯作者：韦革宏 E-mail：weigehong@yahoo.com.cn
第 29卷第 6期 农 业 环 境 科 学 学 报
我国西北地区地域广阔，矿产资源丰富，生态环
境却十分脆弱。随着人们对矿物质需要的增加，人类开
采矿物的活动范围逐渐扩大，受到重金属污染的土壤
面积也日趋增加，若依赖自然修复能力使受到污染的
土壤自行修复，要经过一个漫长的过程。据报道，我国
受采矿业影响的土地大约有 300万 hm2，其中受乡镇
企业影响的占 1/3，20世纪末每年因采矿造成的废弃
地面积达 313万 hm2[1]；受重金属污染的耕地面积近
2 000万 hm2，约占总耕地面积的 1/5，由此造成的粮食
减产达 1 000万 t，每年受重金属污染的粮食达 1 200
万 t，年经济损失超过 200亿元[2]。因此，矿区土壤修复对
生态环境的保护与可持续利用有重要的意义。生物修
复具有无污染、超富集、成本低等优点[3]。在生物改良
中，植物与微生物联合修复技术效果较为明显[4]，而根
瘤菌-豆科植物形成的共生体具有很好的研究价值。
同时，利用豆科植物固定矿区废弃物，可控制风蚀和水
蚀，从而改善土壤物理、化学和微生物的性质[5]。
西北地区同时也是一个生物多样性非常集中的
地区，微生物数量庞大，很多尚未被人们所认知，这其
中就包括很多根瘤菌。根瘤菌与其宿主植物形成的共
生体系在环境较为恶劣的西北矿区重金属污染地能
很好地生存，表明它们是一类生命力旺盛且具有强适
应性的生物群落。因此，本实验对分离自矿区的 38株
根瘤菌采用 16S rDNA PCR-RFLP技术进行遗传多样
性研究以确定其系统发育地位，并研究其重金属抗性
以发掘重金属抗性的优良菌株，为根瘤菌及其共生体
系在污染环境修复中的应用提供重要的种质资源和
依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株及分离纯化
供试菌株共 38株，分别来自陕西、甘肃部分矿区
的大豆属、野豌豆属和苜蓿属 3种宿主植物。采用
YMA（yeast-manitol agar）培养基 [6]培养，进行分离纯
化。菌株编号及地理来源见表 1。
1.2 16S rDNA PCR-RFLP
1.2.1 总 DNA的提取
根据 Terefework[7]的提取方法进行提取，用 1%的
琼脂糖凝胶进行检测。
1.2.2 PCR扩增
以总 DNA为模板，选取来源于 E. coli 16S rRNA
基因序列保守区域的两段引物 P1和 P6，配制成 10
μmol·L-1浓度备用。正向引物 P1：5′-CGg gat ccA GAG
TTT GAT CCT GGC TCA GAA CGA ACG CT-3′，对应于
E. coli的第 8~37碱基位置；反向引物 P6：5′-CGg gat
ccT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT CAC CCC-3′，
对应于 E. coli的第 1 479~1 506碱基位置[8]。所用引物
由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为：
ReactionBuffer（10×）5.0μL、dNTPs（10mmol·L-1）4.0 μL、
正向引物 P1（10 μmol·L-1）1.0 μL、反向引物 P6（10
μmol·L-1）1.0 μL、Taq聚合酶（5 U·μL-1）0.25 μL、MgCl2
3.0 μL、重蒸去离子水 33.75 μL、模板 DNA（约 50 ng）
2.0 μL，总体积为 50 μL。PCR反应条件为：95℃预变
性 5 min、94℃变性 1 min、55℃退火 1 min、72℃延伸 2
min、72℃最终延伸 10 min、4℃保藏，36个循环。
1.2.3 RFLP分析
选用 4种限制性内切酶进行酶切，分别为 Hinf
Ⅰ、HaeⅢ、MspⅠ和 Hha I，酶切反应体系均为 20
μL，分别取 8 μL PCR扩增产物，各加入适量的限制
性内切酶缓冲液和 1μL的限制性内切酶，充分混匀后
37℃酶切 4 h。酶切产物用 2％的琼脂糖凝胶，70 V、4
h电泳，凝胶成像系统拍照。
1.2.4 16S rDNA全序列测定
根据供试菌株的 16S rDNA-RFLP 图谱类型组
合，选取符合每种图谱类型组合的代表菌株，其扩增
产物送北京奥科生物技术有限公司进行测序。将测得
的 16S rDNA 的全序列与从 GenBank（NCBI）中获得
的根瘤菌已知种进行多重序列比对，数据用 Clustal X
和 Treeconw软件包分析，构建出以 16S rDNA全序列
为基础的系统分类树状图，并使用 DNAMAN计算各
测试菌株间 16S rDNA序列的相似性。
1.3 菌株的重金属抗性测定
对 38株供试菌株进行不同浓度 Cu、Hg、Zn、Cd、
Pb的耐受性测定，筛选抗性菌株。将不同浓度的重金
属母液与 YMA培养基分别湿热灭菌（121℃，30 min），
倒皿前混合均匀。使终浓度分别为（单位 mmol·L-1）：
0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 Zn2+；0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 Hg2+；
0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 Cu2 +；0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 Cd2 +；
0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 Pb2+。采用多点接种法，吸取 100
μL菌悬液到多点接种器槽内，然后接种到含不同浓
度重金属离子的 YMA平板培养基上，培养 3~5 d，观
察菌株的生长情况。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA PCR-RFLP分析
将 38株供试菌株的 16S rDNA用 HinfⅠ、HaeⅢ、
MspⅠ和 HhaⅠ4种限制性内切酶进行酶切，对应每
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表 1 供试菌株及其 16S rDNA PCR-RFLP图谱类型
Table 1 The tested strains and their types of 16S rDNA PCR-RFLP fingerprint patterns
注：黑体表示 16S rDNA测序菌株。The boldfaces are the strains for sequencing.
菌株 Strain 宿主 Host 来源 Origin 生境 Habitat
酶切类型 Restriction enzyme pattern 酶切组合类型
Fingerprint pattern of 16S rDNAHinfⅠ HaeⅢ MspⅠ HhaⅠ
CCNWSX1293 大豆 陕西宁强 铁矿 a a a a Ⅰ
CCNWSX1287 野大豆 陕西宁强 铁矿 a a a a Ⅰ
CCNWSX1277 广布野豌豆 陕西略阳 镍矿 a a a a Ⅰ
CCNWSX1270-1 山野豌豆 陕西凤县 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1270-2 山野豌豆 陕西凤县 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1271-1 山野豌豆 陕西凤县 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1271-2 山野豌豆 陕西凤县 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1278-1 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1278-1-1 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1278-1-2 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1281 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1283 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1280 大豆 陕西略阳 金矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1289 四籽野豌豆 陕西宁强 铁矿 b b b a Ⅱ
CCNWSX1290 四籽野豌豆 陕西宁强 铁矿 b b b a Ⅱ
CCNWGS0752 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0753-1 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0753-2 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0754 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0755-1 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0755-2 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0756-1 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0756-2 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWSX1273-1 天蓝苜蓿 陕西凤县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWSX1273-2 天蓝苜蓿 陕西凤县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWSX1275 大豆 陕西凤县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWSX1276 大豆 陕西凤县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0750-1 大豆 甘肃成县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWGS0750-2 大豆 甘肃成县 铅锌矿 c b d a Ⅲ
CCNWSX1279 野大豆 陕西略阳 金矿 c b c a Ⅳ
CCNWSX1282 广布野豌豆 陕西略阳 金矿 c b c a Ⅳ
CCNWSX1291-1 天蓝苜蓿 陕西宁强 铁矿 c b c a Ⅳ
CCNWSX1291-2 天蓝苜蓿 陕西宁强 铁矿 c b c a Ⅳ
CCNWSX1272-1 山野豌豆 陕西凤县 金矿 a c b a Ⅴ
CCNWSX1272-2 山野豌豆 陕西凤县 金矿 a c b a Ⅴ
CCNWGS0751-2 野大豆 甘肃徽县 铅锌矿 b b c a Ⅵ
CCNWSX1288 野大豆 陕西宁强 铁矿 b d e a Ⅶ
CCNWSX1294 大豆 陕西宁强 铁矿 a e b a Ⅷ
一个酶切电泳图谱照片，凡是电泳图谱上不同菌株间
迁移率相同的带被认为是同一个性状，随机标记为
a→e，如图 1所示。从图谱中可以看出：38株供试菌
株的 HinfⅠ酶切类型有 3 种，HaeⅢ酶切类型有 5
种，MspⅠ酶切类型有 5种，HhaⅠ酶切类型有 1种，
其酶切组合类型列于表 1。
综合以上结果分析可知：供试菌株共有 8种酶切
图谱类型，其中大豆根瘤菌的酶切图谱有 aaaa、aeba、
曹 莹等：西北部分矿区豆科植物根瘤菌重金属抗性及 16S rDNA RFLP分析1158
第 29卷第 6期 农 业 环 境 科 学 学 报
bbba、cbda 4 种类型，野大豆根瘤菌的酶切图谱有
aaaa、bbca、bdea、cbca、cbda 5 种类型，山野豌豆根瘤
菌的酶切图谱有 acba、bbba 2种类型，广布野豌豆根
瘤菌的酶切图谱有 aaaa、bbba、cbca 3种类型，四籽野
豌豆根瘤菌的酶切图谱有 bbba 1种类型，天蓝苜蓿
根瘤菌的酶切图谱有 cbca和 cbda 2种类型。它们的
酶切图谱类型存在部分一致的现象，属于 aaaa的有
大豆根瘤菌、野大豆根瘤菌和广布野豌豆根瘤菌；属
于 bbba的有大豆、广布野豌豆、山野豌豆和四籽野豌
豆根瘤菌；属于 cbca的有野大豆、广布野豌豆和天蓝
苜蓿根瘤菌；属于 cbda的有大豆、野大豆和天蓝苜蓿
根瘤菌。总体来讲，供试菌株 16S rDNA酶切图谱存在
一定的差异，表明 16S rDNA具有丰富的遗传多样性。
2.2 16S rDNA全序列分析
根据代表菌株的 16S rDNA全序列与已知种的模
式根瘤菌序列比较，计算各菌株之间的遗传距离，采用
Neighbor-joining的方法构建出系统分类树状图（图
2）。从树状图可以看出，38株供试根瘤菌在系统分类
上分别归属于：中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根瘤菌
属（Rhizobium）与土壤杆菌（Agrobacterium）形成的交
叉分支和根瘤菌属（Rhizobium）的系统发育分支上。
在中华根瘤菌属（Sinorhizobium）分支上，分离自
野大豆的供试菌株 CCNWGS0755-1为代表的菌株与
参比菌株 S. fredii和 S. xinjiangense构成一个小的发
育分支，其序列相似性分别为 99.64%和 99.78%；以
分离自天蓝苜蓿的供试菌株 CCNWSX1291-1为代表
的菌株与参比菌株 S. meliloti构成一个小的分支，相
似性为 99.93%；分离自野大豆的 CCNWGS0751-2与
参比菌株 S. morelense构成一个独立的发育分支，其
序列相似性为 99.42%。
在根瘤菌属（Rhizobium）与土壤杆菌属（Agrobac-
terium）形成的交叉分支上，以分离自野大豆的CCN－
WSX1288为代表的菌株与 R. galegae 形成一个小的
分支，其序列相似性为 98.91%；以 CCNWSX1277 和
CCNWSX1287与 Ag. tumefaciens 形成一个小的发育
分支，CCNWSX1277与 CCNWSX1287的序列相似性
为 100%，这两株供试菌株与参比菌株 Ag. tumefa-
ciens的序列相似性均为 99.21%。
根瘤菌属（Rhizobium）分支上，以分离自四籽野
豌豆的供试菌株 CCNWSX1289 为代表的菌株与 R.
leguminosarum构成一个小的系统发育分支，序列相
似性为 99.64%；以分离自山野豌豆 CCNWSX1272-2
为代表的菌株与 R. mongolense构成一个小的发育分
支，其序列相似性为 99.42%；分离自大豆的 CCN－
WSX1294与 R. sullae构成一个小的发育分支，序列
相似性为 98.83%，相似性较低，为根瘤菌属内的一个
潜在新种，需要扩大菌株数做进一步的研究。
2.3 菌株的重金属抗性
能在含有重金属的 YMA 培养基上生长的根瘤
菌均具有共同的菌落特征：表面皱缩，干燥，呈现对应
金属的色泽。28.9%的菌株能在含 2.0 mmol·L-1 Zn2+的
YMA培养基上生长，23.7%的菌株能在含 0.25 mmol·
M. DL 100bp；A. HinfⅠ酶切图谱；B. HaeⅢ酶切图谱；C. MspⅠ酶切图谱；D. HhaⅠ酶切图谱
M. DL 100bp; A. digested by HinfⅠ; B. digested by HaeⅢ; C. digested by MspⅠ; D. digested by HhaⅠ.
图 1 供试菌株的 16S rDNA酶切图谱类型
Figure 1 16S rDNA-RFLP fingerprint patterns of the tested strains
M a b c M a b c d e M a b c d e M a
A. HinfⅠ B. HaeⅢ C. MspⅠ D. HhaⅠ
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L-1Hg2+的 YMA 培养基上生长，42.1%的菌株可在含
2.0 mmol·L-1 Cu2+的 YMA培养基上生长，仅 1株菌能
在含 1.4 mmol·L-1 Cd2+的培养基上生长，所有菌株均
能在含 2.5 mmol·L-1 Pb2+的培养基上生长。其中用于测
序的代表菌株对各种重金属的耐受水平如表 2所示。
3 讨论
菌株的宿主植物生长的土壤环境大多数是铅锌
0.02 S. fredii USDA205（D14516）
S. xinjiangense IAM14142（D12796）
CCNWGS0755-1（GU645015）Ⅲ型
S. kostiense HAMBI1489205（Z78203）
S. saheli LMG7837（X68390）
S. terangae LMG6463（X68387）
S. aboris HAMBI1552（Z78204）
S. medicae A321（L39882）
S. medicae LMG6133（X67222）
S. morelense LC04（AY024335）
CCNWSX1291-1（GU645020）Ⅳ型
CCNWGS0751-2（GU645022）Ⅵ型
R. giardinii H152（U86334）
R. gadegae ATCC43677（D11343）
CCNWSX1288（GU645018）Ⅶ型
R. huautlense SO（AF025852）
Ag. vitis LMG8750（D14502）
Al. undicola LMG11875（Y17047）
Ag. albertimagni AOL15（AF316615）
Ag. rubi IF013261（D14503）
Ag. tumefaciens LMG196（X67223）
CCNWSX1277（GU645014）Ⅰ型
CCNWSX1287（GU645017）Ⅰ型
R. hainanense I66（U71078）
CCNWSX1294（GU645021）Ⅷ型
R. sullae IS123（Y10170）
R. yanglingense CCBAU71623（AF003375）
R. gallicum R602（U86343）
R. mongolense USDA1844（U89817）
CCNWSX1272-2（GU645016）Ⅴ型
CCNWSX1289（GU645019）Ⅱ型
R. leguminosarum USDA2370（U29386）
R. tropici CFN299（X67234）
R. tropici CIAT899（U89832）
1 000
1 000
1 000
679
940
882
659
811
909
1 000
562
916
655
601
737
931
997
712
1 000
999
470
587
784
974
954
968
594
1 000
图 2 供试菌株 16S rDNA全序列系统发育树
Figure 2 Phylogenetic tree on the basis of 16S rDNA full-length sequence
图中分枝上数字表示树形可信度，括号内为 GenBank登录号
The numbers on the nodes stand for bootstrap values. GenBank accession numbers are shown in parentheses.
1 000
曹 莹等：西北部分矿区豆科植物根瘤菌重金属抗性及 16S rDNA RFLP分析1160
第 29卷第 6期 农 业 环 境 科 学 学 报
表 2 代表菌株的重金属抗性测定结果
Table 2 Heavy metal toxicity testing of the representative strains
注：“-”表示菌株在所设重金属浓度下不能生长。”-”is that the strains couldn＇t grow at this concentration of heavy metal.
菌株 Strain 寄主 Host
重金属浓度/mmol·L-1 Heavy metal concentration
生境 Habitat
Zn2+ Hg2+ Cu2+ Cd2+ Pb2+
CCNWSX1277 广布野豌豆 2.0 0.25 2.0 1.4 2.5 镍矿
CCNWSX1287 野大豆 1.6 0.15 2.0 0.2 2.5 铁矿
CCNWGS0751-2 野大豆 0.4 0.05 1.6 - 2.5 铅锌矿
CCNWGS0755-1 野大豆 0.4 - 2.0 - 2.5 铅锌矿
CCNWSX1291-1 天蓝苜蓿 1.2 0.1 1.2 - 2.5 铁矿
CCNWSX1272-2 山野豌豆 - - 1.6 - 2.5 金矿
CCNWSX1288 野大豆 1.2 0.1 2.0 - 2.5 铁矿
CCNWSX1289 四籽野豌豆 1.2 0.1 1.6 - 2.5 铁矿
CCNWSX1294 大豆 2.0 0.15 2.0 0.2 2.5 铁矿
矿、金矿和铁矿，并且分布在年均降雨量少的甘肃和
陕西两省，长期的盐碱、干旱、低温及较大的昼夜温差
等选择性压力使得这些地区的根瘤菌具有以下特性，
而这些特性中所蕴含着的丰富基因资源，对尾矿区重
金属污染治理具有重要的意义。
3.1 供试菌株的遗传多样性
本实验对西北矿区大豆属、野豌豆属和苜蓿属根
瘤菌进行了遗传多样性和系统分类地位研究。结果
表明，同一种植物在不同生态环境中可与不同的根
瘤菌结瘤固氮，同一生态环境同种植物的根瘤菌可
以属于不同种属，根瘤菌与豆科植物的共生关系因
生态环境的差异而具有种的多样性 [9]。天蓝苜蓿根
瘤菌 CCNWSX1273-1和 CCNWSX1273-2，经过对系
统发育树状图的分析，它们属于 S. fredii；分离自天
蓝苜蓿的 CCNWSX1291-1 和 CCNWSX1291-2 属于
S.meliloti。天蓝苜蓿的根瘤菌都聚在中华根瘤菌属
内，说明与天蓝苜蓿共生的根瘤菌较为专一[10-11]。大
多数野豌豆属根瘤菌与 R. leguminosarum聚成一类，
少数属于 R. mongolense和 S. meliloti；同样，大豆属根
瘤菌也存在此种情况，多数属于 S. xinjiangense，少数
属于 S. morelense、R. galegae和 R. sullae，这些野豌豆
属和大豆属根瘤菌采集自陕西和甘肃；而分离自甘肃
徽县的野大豆根瘤菌 CCNWGS0755 -1 和 CCN－
WGS0751-2却又分别属于 S. xinjiangense和 S. more－
lense。此外，分离自山野豌豆的 CCNWSX1272-2属于
R. mongolense，而 R. mongolense是来自内蒙古花苜蓿
的根瘤菌，CCNWSX1272-2 可能与内蒙古花苜蓿形
成共生体。从 16S rDNA全序列分析的结果中可以看
出，供试菌株分布在中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根
瘤菌属（Rhizobium）和土壤杆菌属（Agrobacterium），表
明这些菌株具有较为丰富的遗传多样性。
3.2 不同菌株与重金属抗性的关系
从实验结果可以看出，根瘤菌对重金属较为敏
感，随着重金属的浓度增大，耐受菌株的数量减少，不
同菌株对重金属的抗性不同，重金属污染使耐受菌富
集而敏感菌丧失[12]，这使得微生物群落对环境胁迫的
适应能力增强。M. Díaz-Ravi觡a[13]证明了污染土壤中细
菌的金属抗性模式与土壤中金属浓度有关，且这些细
菌对多种金属的耐受性得到了论证，这与本实验结果
相互映证。
综合图 2和表 2分析可以看出，供试菌株均能耐
受两种以上的重金属。这可能是根瘤菌可通过分泌质
子、氨基酸以及各种有机酸，提高体系的酸度，溶解重
金属，或者利用代谢产物与重金属配合改变形态，使
其对多种重金属具有耐受性[14]。所有菌株都能耐受较
低浓度的 Pb2+（2.5 mmol·L-1），与何新华等[15]采用生长
抑制法从杨梅根瘤中分离得到的 10株 Frankia菌对
重金属 Pb2+抗性结果一致。低浓度铅能促进抗铅菌株
的生长且可能增强其酶活性，高浓度铅对其生长有一
定的抑制作用，说明这些菌株具有耐受更高浓度 Pb2+
的潜在能力。所有供试菌株均对 Cu2+有耐受性，多数
达到 2.0 mmol·L-1。实验获得能耐受 1.4 mmol·L-1 Cd2+
属于 Agrobacterium的 CCNWSX1277，该菌株是梁建
强[16]筛选出的根瘤菌对 0.2 mmol·L-1 Cd2+抗性水平的
7倍。属于 Agrobacterium 的 CCNWSX1287 和 CCN－
WSX1277分别可以耐受 0.15 mmol·L-1和 0.25 mmol·
L-1的 Hg2+，有 2株属于 Sinorhizobium的菌耐受 0.05~
0.1 mmol·L-1的 Hg2+，有 3株属于 Rhizobium属的菌
耐受 0.1~0.15 mmol·L-1的 Hg2+。属于 Agrobacterium
的CCNWSX1287和 CCNWSX1277分别可以耐受 1.6
1161
2010年 6月
mmol·L-1和2.0 mmol·L-1的 Zn2+，有 3株属于 Sinorhi－
zobium的菌耐受 0.4~1.2 mmol·L-1的 Zn2+，有 3株属
于 Rhizobium 属的菌耐受 1.2~2.0 mmol·L-1的 Zn2+。
通过比较可以看出，Agrobacterium属的 2株菌对 5种
重金属均有较强的耐受性；而 Rhizobium属的 4株菌
和 Sinorhizobium的 3株菌对 5种重金属的耐受性各
不相同。这表明，根瘤菌对重金属的抗性因其种属不
同呈现较大的差异，这可能与不同种属的重金属抗性
机制有关，有待于进一步研究。
3.3 根瘤菌的生境与其对重金属抗性的关系
E. B覽覽th[17-18]认为重金属可能对存在于污染土壤
中的细菌具有选择性压力，使得它们生存的土壤中存
在抗性细菌。在菌株的重金属抗性实验中，分离自陕
西宁强铁矿的野大豆根瘤菌 CCNWSX1288、四籽野
豌豆根瘤菌 CCNWSX1289、天蓝苜蓿根瘤菌 CCN－
WSX1291-1 和大豆根瘤菌 CCNWSX1294 对 5 种重
金属的抗性存在差异；来自甘肃徽县铅锌矿的野大豆
根瘤菌 CCNWGS0751-2和 CCNWGS0755-1，以及来
自陕西宁强铁矿的野大豆根瘤菌 CCNWSX1287 和
CCNWSX1288，对 5种重金属的抗性也不尽相同。表
明分离自同一地区不同豆科植物的根瘤菌对同一种
重金属的抗性有一定差异，甚至是分离自同一地区同
一种属豆科植物的根瘤菌对同一种重金属的抗性也
不尽相同。这些根瘤菌-豆科植物共生体生长在金矿、
铁矿和铅锌矿等地，由于矿区土壤受到重金属元素
Pb、Zn、Cr、As 和 Cd 等的污染 [19]，长期受到重金属的
胁迫使得根瘤菌对不同的重金属产生了不同的耐受
性。本实验中分离自镍矿附近的测序菌株 CCN－
WSX1277 对重金属 Hg、Cu、Cd、Zn 和 Pb 耐受性较
强，可能是由于生境中重金属的胁迫造成的。
此外，还有学者研究了根瘤菌抗性、重金属土壤
污染和蛋白质选择这三者之间的关系，结果表明，蛋
白质选择的分析可能成为一个估计重金属污染对根
瘤菌种群选择性压力水平的很好指标[20]。基于各种因
素的影响及复杂性，对于重金属的抗性研究还需进一
步深入。
4 结论
（1）分离自陕西宁强、略阳、凤县、甘肃徽县和成
县的大豆属、野豌豆属和苜蓿属的 38株根瘤菌在系
统分类上归属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根瘤
菌属（Rhizobium）与土壤杆菌（Agrobacterium）形成的
交叉分支和根瘤菌属（Rhizobium）的系统发育分支上。
（2）根瘤菌对重金属的抗性因其种属及生境不同
呈现较大的差异。Agrobacterium属的 CCNWSX1287
和 CCNWSX1277 对 Zn、Hg、Cu、Cd和 Pb 5种重金属
均有较强的耐受性；而 Rhizobium属的 4株菌 CCN－
WSX1288、CCNWSX1289、CCNWSX1294和 CCNWSX-
1272-2以及 Sinorhizobium的 3株菌 CCNWGS0755-
1、CCNWGS0751-2 和 CCNWSX1291-1 对 5 种重金
属的耐受性各不相同。总体来看，供试菌株对重金属
的耐受性顺序为 Agrobacterium>Rhizobium>Sinorhizo－
bium。其中分离自镍矿附近的 CCNWSX1277对重金
属 Hg、Cu、Cd、Zn和 Pb的耐受性最强。
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