全 文 ： 研究报告
Research Report
豆科六种牧草 DNA 条形码鉴定技术研究
李永青 1 赵生国 1 焦婷 2*
1 甘肃农业大学动物科学技术学院, 甘肃兰州, 730070; 2 甘肃农业大学草业学院, 草业生态系统教育部重点实验室, 中-美草地
畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃兰州, 730070
*通讯作者, jiaot@gsau.edu.cn
摘 要 DNA 条形码技术是基于物种种内特异性和种间多样性利用一个或几个标准的 DNA 片段(DNA
barcode)构建生物鉴别数据库。本研究根据 GenBank 中豆科牧草 matK 和 rbcL 基因的核苷酸序列，设计 4
对通用引物对豆科五个主要牧草属(苜蓿属 Medicago、车轴草属 Trifolium、红豆属 Onobrychis、小冠花属
Coronilla、野豌豆属 Vicia)的六种牧草进行扩增。扩增产物进行测序和分析，筛选出六种牧草的四个标记
位点 5’端和 3’端保守序列，并对各标记位点保守区内的核苷酸进行单核苷酸多态性(SNPs)的单倍型分
析，数据表明： matK1、matK2、matK3 均有 5 个单倍型，五个牧草属有其特有单倍型；rbcL 基因有 6 个
单倍型，车轴草属白三叶和红三叶有其特有单倍型。根据 matK(matK1，matK2，matK3)和 rbcL 基因筛选
的四个标记位点为六种牧草建立了相对应的特异 DNA 识别码。说明 matK 和 rbcL 组合后可作为豆科六种
牧草的潜在条形码。
关键词 单倍型组合, matK 基因, rbcL 基因, DNA 条形码
Establishment of DNA Barcode of Leguminosae Forages’ Six Species
Li Yongqing 1 Zhao Shengguo 1 Jiao Ting 2*
网络出版时间：2016-07-20 11:46:12
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20160720.1146.004.html
1 Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou, 730070; 2 College of Pratacultural Science,
Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Lanzhou, 730070
*Corresponding author, jiaot@gsau.edu.cn
Abstract DNA barcoding is an emerging technology based on specificity within a species and diversity
between species to build biological identification database by using one or more standard DNA barcode. In the
study, we designed four universal primers to amplify six species in five major genera (Medicago, Trifolium,
Onobrychis, Coronilla, Vicia) of leguminosae forages, according to nucleotide sequence of leguminosae forages’
matK and rbcL genes in GenBank. 5’ end and 3’ end conservative fragments in four marked fragments were
selected by amplification products’ sequencing and analyzing. Single nucleotide polymorphism (SNP) haplotype
analysis was conducted on each marker loci’s conservative fragments’ nucleotide sequences and the results
showed that there were 5 haplotypes among matK1、matK2、matK3 respectively. By the same token, rbcL gene
has 6 haplotypes, Trifolium repens Linn and Trifolium pretense Linn have unique haplotypes. According to the
haplotypes about matK (matK1, matK2 and matK3) and rbcL, we had constructed the DNA barcoding for six
species leguminosae forages. It proved that the combination of matK and rbcL could be used as candidate DNA
barcode for six species leguminosae forages.
Keywords Haplotype combination, MatK gene, RbcL gene, DNA barcoding
物种的鉴定是生物多样性研究的基石之一。在 DNA 双螺旋结构发现 50 年之际，加拿大学者提出了
通过 DNA 条形码，即标准化的、较短的 DNA 序列对物种进行快速、准确鉴定的动议(Hebert et al.,
2003)。由于植物线粒体基因的进化速率相对较慢，rbcL+matK 片段组合被国际生命条形码联盟植物工作
组建议作为陆地植物的核心 DNA 条形码，用于构建植物物种鉴定的统一框图(CBOL Plant Working Group,
2009; China Plant BOL Group et al., 2011)。作为国际生命条形码计划(International Barcode of Life Project)的
4 个中心节点之一，我国也积极参与了该计划的发展，并于 2012 年启动了新一代植物志 iFlora 研究计划
(曾春霞等, 2013)，计划 5 年内完成中国 80%维管植物属级水平 DNA 条形码标准数据库的构建。王晓玥等
人基于 ITS2 序列，快速并有效地从豆蔻属 Amomum 和山姜属 Alpinia 中鉴别出中药材(Xiao et al., 2014)。
植物 DNA 条形码分析方法与动物有所不同，其处于对片段的研究阶段。首先进行序列比对和人工校
正；通常采用 pairwise uncorrected p-distance (Newmaster et al., 2008)或 Kimura-2-parameter distance (K2P)模
型(Meyer and Paulay, 2005; Lahaye et al., 2008)计算种间距离，通过 MEGA 或 PAUP 计 算 种 内 和 种 间 的
K2P 距离；采用分子系统学方法，通过构建多种系统发育树对条形码进行分析(如 NJ、UPGMA、ML 和
MP 等)并检验每个物种的单系情况。
豆科牧草具有粗蛋白含量高、生长期间营养物质衰减速率慢、饲用及经济地位重要等特点(张凡凡等,
2013)。然而 DNA 条形码技术在豆科牧草鉴别中应用较为罕见，本研究借助 DNA 条形码候选片段，尝试
建立豆科六种牧草的 DNA 条码，为进一步开展品种鉴别提供理论依据和方法参考。






1 结果分析
1.1 引物筛选
根据本研究设计的 4 对通用引物，并针对豆科六种牧草，建立并优化目的片段 PCR 条件。
表 1 引物 PCR 反应最佳退火温度
Table 1 The optimized annealing temperature of primer’s PCR reaction
标记位点
Fragment marked
引物
Primer
引物序列
Primer Sequence
目的片段长度
Target fragment
length (bp)
退火温度(℃)
Tm
matK1 F-M1 R-M433
5-TATACCCACTTATTTTTCGGGAGTATA-3
5-ATGGATAGGATATGGTATTCGTATATCTG-3 400 56.8
matK2 F-M118 R-M434
5-TTGTAAAACGTTTAATTACTCGAATGTAT-3
5-ATGGATAGGATATGGTATTCGTATATCTG-3 300 58.0
matK3 F-M1262 R-M1472
5-TATATACTTCGGCTTTCTTGTATTAAAACTT-3
5-CGTTTCTGAAAAGAATATCCAAATACCAAA-3 200 55.6
rbcL F-R1 R-R452
5-CCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT-3
5-AGACATTCATAAACAGCTCTACCGT-3 450 54.4

图 1 引物 F-M1/R-M433PCR 扩增凝胶电泳检测
注: 1: 紫花苜蓿; 2: 白三叶; 3: 红三叶; 4: 红豆草; 5: 小冠花; 6: 箭舌豌豆
Figure 1 Detection of primer F-M1/R-M433 PCR products in gel electrophoresis
Note: 1: Medicago sativa Linn; 2: Trifolium repens Linn; 3: Trifolium pretense Linn; 4: Onobrychis viciaefolia Scop; 5: Coronilla
varia Linn; 6: Vicia gigantea Bge

图 2 引物 F-M118/R-M434PCR 扩增凝胶电泳检测
注: 1: 紫花苜蓿; 2: 白三叶; 3: 红三叶; 4: 红豆草; 5: 小冠花; 6: 箭舌豌豆
Figure 2 Detection of primer F-M118/R-M434 PCR products in gel electrophoresis
Note: 1: Medicago sativa Linn; 2: Trifolium repens Linn; 3: Trifolium pretense Linn; 4: Onobrychis viciaefolia Scop; 5: Coronilla
varia Linn; 6: Vicia gigantea Bge
图 3 引物 F-M1262/R-M1472 扩增凝胶电泳检测
注: 1: 紫花苜蓿; 2: 白三叶; 3: 红三叶; 4: 红豆草; 5: 小冠花; 6: 箭舌豌豆
Figure 3 Detection of primer F-M1262/R-M1472 PCR products in gel electrophoresis
Note: 1: Medicago sativa Linn; 2: Trifolium repens Linn; 3: Trifolium pretense Linn; 4: Onobrychis viciaefolia Scop; 5: Coronilla
varia Linn; 6: Vicia gigantea Bge

图 4 引物 F-R1/R-R452 扩增凝胶电泳检测
注: 1: 紫花苜蓿; 2: 白三叶; 3: 红三叶; 4: 红豆草; 5: 小冠花; 6: 箭舌豌豆
Figure 4 Detection of primer F-R1/R-R452 PCR products in gel electrophoresis
Note: 1: Medicago sativa Linn; 2: Trifolium repens Linn; 3: Trifolium pretense Linn; 4: Onobrychis viciaefolia Scop; 5: Coronilla
varia Linn; 6: Vicia gigantea Bge
电泳检测获得清晰的目的条带，片段大小与预期相符，经测序获得较高质量的核苷酸序列，说明本
研究筛选的引物，可用于 DNA 条码的筛选。





1.2 DNA 保守区识别
利用 chromas2.33 对测序所得进行校对和编辑后，通过 MEGA5.0 进行序列比对，分别筛选标记位点
5’端和 3’端高度保守区(表 2)
表 2 标记位点保守区识别
Table 2 Identification of conserved region in fragment marked
标记位点
Fragment marked
5’端序列
5’-sequence
3’端序列
3’-sequence
片段长度(bp)
Fragment
length (bp)
matK1 5’-GTAGGTT 3’-AATTCATT 256
matK2 5’-TTAATTAC 3’-CATTCCAT 219
matK3 5’-TATATACTT 3’-GATTCTTTC 131
rbcL 5’-GCAGGTGC 3’-TTTATCCGC 389
1.3 单倍型分析
1.3.1 matK1
基于 Dnasp5.10 进行的单倍型分析表明：六种牧草彼此间有 39 个变异位点，因此界定 5 个单倍型(表
3)：其中 H1A，H1C，H1D 和 H1E 分别为紫花苜蓿，红豆草，小冠花和箭舌豌豆的特有单倍型；H1B 为红
三叶和白三叶的共享单倍型。
表 3 matK1 单倍型多态位点
Table 3 matK1 haplotypes polymorphic sites
单倍型
Haplotypes
变异位点
Variation locuses
8 1 1 1 2 4 5 6 6 7 7 7 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2
2 4 5 8 2 4 2 4 5 8 9 3 0 0 1 1 1 2 2 3 5 5 6 7 7 8 8 8 9 9 9 0 1 2 2 4 4 4
6 7 3 5 7 6 8 3 2 3 5 2 9 5 6 7 0 3 4 1 7 2 5 1 4 9
样品
Samples

H1A CCGTCTAACACACCCGGCGATAGCGCTCCAAATACATAC 紫花苜蓿
Medicago sativa Linn
H1B . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . 红三叶，白三叶
Trifolium repens Linn; Trifolium pretense
Linn;
H1C A . A . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . C T T . G . . . . A 红豆草
Onobrychis viciaefolia Scop
H1D ATA.T.GG.GT. . .GTAG. .GGT. .TCATCTTGGACCCA 小冠花
Coronilla varia Linn
H1E A . A G . G . . A . . C G T . . . G A G . . . G . . . . . C T T . G . C . . A 箭舌豌豆
Vicia gigantea Bge
1.3.2 matK2
六种牧草彼此间有 37 个变异位点，分为 5 个单倍型(表 4)：其中 H2A，H2C，H2D 和 H2E 分别为苜
蓿，红豆草，小冠花和箭舌豌豆四种牧草的特有单倍型；H2B为红三叶和白三叶的共享单倍型。
表 4 matK2 单倍型多态位点
Table 4 matK2 haplotypes polymorphic sites
单倍型
Haplotypes



变异位点
Variation locuses
1 2 2 3 3 3 4 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2
2 0 2 3 6 7 1 5 6 4 5 0 1 3 5 4 6 0 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 5 5 5 7 8 8 9 0 0
0 1 3 5 7 3 4 5 8 1 2 9 1 0 3 9 2 7
样品
Samples



H2A AACACACAACCTGGCGATTAGCTCTCCGAATGCATAC 紫花苜蓿
Medicago sativa Linn
H2B . . . . . . . CC. . G. . A. . GG. . . G. . . . CTT. A. . G. A 红三叶，白三叶
Trifolium repens Linn; Trifolium
pretense Linn
H2C . G. GT. . . . . G. TAG. . . GGT. . TCATCTTG. ACCCA 红豆草
Onobrychis viciaefolia Scop
H2D GG. GT. . . . . G. TAG. . . GGT. . TCATCTTG. ACCCA 小冠花
Coronilla varia Linn
H2E . . A. . CG. . T. . . . GAG. . . . G. . . . . CTT. . . C. . A 箭舌豌豆
Vicia gigantea Bge
1.3.3 matK3
在 matK3 片段上设计的引物扩增得到六种牧草彼此间有 9 个变异位点，分为 5 个单倍型(表 5)：其中
H3A，H3C，H3D 和 H3E 分别为苜蓿，红豆草，小冠花和箭舌豌豆四种牧草的特有单倍型；H3B 为红三叶
和白三叶的共享单倍型。
表 5 matK3 单倍型多态位点
Table 5 matK3 haplotypes polymorphic sites
单倍型
Haplotypes



变异位点
Variation locuses
1 3 3 5 7 7 9 9 1
8 3 6 4 7 8 3 7 1
1
样品
Samples



H3A TGTTCAAGA 紫花苜蓿 Medicago sativa Linn
H3B . A. . . . . . C 红三叶，白三叶 Trifolium repens Linn; Trifolium pretense Linn
H3C . . CCT. . A. 红豆草 Onobrychis viciaefolia Scop
H3D G. CCT. . . . 小冠花 Coronilla varia Linn
H3E . . . . . TCC. 箭舌豌豆 Vicia gigantea Bge

1.3.4 rbcL 序列
六种牧草彼此间有 54 个变异位点，分为 6 个单倍型(表 6)：六种牧草均存在特有单倍型。
表 6 rbcL 单倍型多态位点
Table 6 rbcL haplotypes polymorphic sites
单倍型
Haplotypes
变异位点
Variation locuses
9 2 3 3 3 4 4 5 6 6 7 8 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3
1 0 3 6 5 8 1 3 9 2 4 3 9 0 0 0 0 1 1 2 2 3 5 6 9 0 0 2 3 3 3 3 4 4 5 5 6 6 6 6 7 7 7 8 9 1 1 1 3 4 4 4 7
0 2 5 8 1 5 6 8 5 6 2 8 1 7 2 1 2 4 7 0 6 2 9 4 7 8 9 7 8 9 5 7 2 5 8 6 2 5 8 2
样品
Samples
H4A ACCTGATGACTTCCCCCATGGCTCCCCAGCTGTTTACCCGTGTTTTATGAATCT
紫花苜蓿
Medicago
sativa Linn
H4B . . . . . . . . . . . . . T. . . G. . T. . . . . T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G. . . .
红三叶
Trifolium
repens Linn
H4C . . . . T. . . . . . . . T. . . G. . T. . . . . T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G. . . .
白三叶
Trifolium
pretense
Linn
H4D T. . . . C. . G. . . A. . . TGC. AGC. T. . T. . . AC. . GA. . CCAC. . . . . . GT. TG
红豆草
Onobrychis
viciaefolia
Scop
H4E T. T. T. C. GT. CA. . . . GCCAGCT. T. . ATCTCC. G. TTAA. . . GGGGAGTCT.
小冠花
Coronilla
varia Linn
H4F . A. AT. . T. . C. . . GGAG. CTG. . . . . . . . . . C. G. . . TAA. . G. . . . . G. . . A
箭舌豌豆
Vicia
gigantea Bge

1.4 DNA Barcoding 数据库的建立
基于 matK 三个标记位点(matK1，matK2，matK3)和 rbcL 基因在牧草种属间表达的特异性建立了八种
牧草的 DNA 条形码数据库，该数据库由 matK 三个标记位点(matK1、matK2、matK3)和标记位点 5’端和
3’端保守序列(表 2)、DNA 识别码(表 7)以及 rbcL 基因的特异性引物(表 8)共同组成。六种牧草均有其特有
的 DNA barcoding,与其他属的牧草 DNA barcoding 完全不同，达到鉴别的标准。



表 7 六种牧草的 DNA Barcoding 数据库
Table 7 The Databas of DNA Barcoding for 6 species pasture
物种
Species
碱基变异
Variance of base pair DNA 识别码
DNA barcoding
matK1 matK2 matK3 rbcL
紫花苜蓿
Medicago sativa Linn H1
A H2A H3A H4A MRH1A2A3AH4A
红三叶
Trifolium repens Linn H1
B H2B H3B H4B MRH1B2B3BH4B
白三叶
Trifolium pretense Linn H1
B H2B H3B H4C MRH1B2B3BH4C
红豆草
Onobrychis viciaefolia Scop H1
C H2C H3C H4D MRH1C2C3CH4D
小冠花
Coronilla varia Linn H1
D H2D H3D H4E MRH1D2D3DH4E
箭舌豌豆
Vicia gigantea Bge H1
E H2E H3E H4F MRH1E2E3EH4F
注: “M”代表“matK 基因”，“R”代表“rbcL 基因”，“H”代表“单倍型”，其后的“1、2 和 3”分别代表“matK1、matK2 和 matK3”
三个标记位点，“4”代表 rbcL 的标记位点，上标字母代表对应标记位点核苷酸单倍型类别。
Note: “M” means “matK gene”, “R” means “rbcL gene”, “H” means “haplotype”, “1, 2 and 3” mean the three fragment marked
matK1, matK2 and matK3, respectively, and “4” means rbcL fragment marked. The letter superscripts means nucleotide haplotypes
for fragment marked.
1.5 系统发育树的构建
利用 Kimura2-parameter(K2P)模型构建的 NJ 系统发育树(白瑞等, 2008) (图 5)。四个标记位点(matK1，
matK2，matK3 和 rbcL) 5’端和 3’端保守序列按照首尾相接的方式组合而成，全长为 995 bp，六种牧草分
列于不同的进化支，而同一属牧草的聚在同一进化枝上，亲缘关系近。

图 5 NJ(Neighbor-joining)系统发育树
Figure 5 NJ (Neighbor-joining) phylogenetic tree
2 讨论
针对 DNA 条形码研究中的热点问题，本实验以常见六种豆科牧草为研究对象筛选豆科牧草候选条形
码序列，并对 DNA 条形码技术在豆科牧草鉴定中的应用进行探讨。
2.1 DNA 条形码筛选标准及豆科牧草各序列优缺点比较
理想的 DNA 条形码应当符合以下几个标准：(1)必须是一段标准的 DNA 区来尽可能鉴别不同的分类
群；(2)具备足够的变异以划分不同的物种，同时具有相对的保守性；（3）目标 DNA 区应该包括足够的
系统进化信息以定位物种在分类系统中的位置。(宁淑萍等, 2008)；(4)为了便于设计通用引物，应该是高
度保守的引物设计区。DNA 条形码的应用解决了许多类群的物种鉴定问题(Liu et al., 2011; Yang et al.,
2013)，但其他研究表明：由于多倍化、杂交和辐射进化等因素，在不少类群中利用现有的核心条形码对
物种进行鉴定仍然存在局限性(Collins and Cruickshank, 2013; Percy et al., 2014)。本研究对豆科六种牧草的
不同序列分析发现，综合 PCR 扩增和测序成功率及鉴定成功率指标，matK 可有效的鉴别豆科牧草五种常
见属(苜蓿属，车轴草属，红豆草属，小冠花属和野豌豆属)，但无法鉴别同一属的不同种，例如，红三叶
和白三叶具有相同的单倍型。rbcL 不仅能鉴别豆科牧草不同属，而且对同一属的不同种(红三叶，白三叶)
也能准确鉴别。通过比较 matK 和 rbcL 目的片段的变异位点，可知在保守区内，rbcL 存在 54 个变异位
点，明显高于 matK，因此，两种片段单倍型组合后可对豆科六种常见牧草进行准确鉴别。该现象符合
rbcL 基因需与其他片段组合使用的结论(Newmaster et al., 2006)。
2.2 豆科牧草 DNA 条形码通用引物设计
本研究以 matK 和 rbcL 基因组合方式进行豆科牧草 DNA barcoding 研究，高度保守的通用引物设计是
理想的 DNA barcoding 序列获得的前提(Taberlet et al., 2007)。通过对 GenBank 中苜蓿属、车轴草属、红豆
草属、小冠花属和野豌豆属等豆科牧草叶绿体 matK 基因和 rbcL 基因的多重比对，筛选出高度保守区
域，并进行引物设计。获得的 matK(matK1、matK2、matK3)和 rbcL 四个标记位点的引物(表 2)实现了目
的片段的成功扩增和测序，较理想，为 DNA barcoding 数据库的建立提供了可能性。DNA 条形码的核心
是 PCR 扩增，而退火温度是影响 PCR 扩增的重要因素，在 Tm 值范围内，较高的复性温度可以减少引物
和模板间的非特异性结合，提高 PCR 扩增的特异性(李阳等, 2014)。电泳表明所设计引物扩增效率高，成
功率高，反应条件适宜，为物种的鉴别奠定了基础。
2.3 六种常见豆科牧草物种单系性检验
系统发育多样性不受物种分类地位变更的影响，是生物多样性研究的一个里程碑式的指数(Winter et
al., 2013; Cardoso et al., 2014; Davies, 2015)。本研究通过分析 matK 和 rbcL 目的片段多态位点，界定单倍
型，通过单倍型组合形成每种牧草特有的 DNA 条形码。依据叶绿体 matK 和 rbcL 序列制作的系统发育树
分析可见，五种属各自聚为一支，且红三叶和白三叶处于同一分支的不同亚支，这与传统分类所得是一
致的，充分证明了豆科牧草各物种的单系性。
2.4 结论
试验表明：matK 基因(matK1，matK2，matK3)和 rbcL 基因单片段在豆科牧草属水平上的鉴定成功率
均为 100%，但在种水平上，matK 鉴定成功率为 66.7%，对部分物种仍不能较好的鉴别。两种片段组合后
能将豆科六种牧草完全区分，鉴定效率达到 100%。因此，将 matK 与 rcbL 联合应用作为豆科牧草的
DNA 条形码通用序列组合。本实验为混合豆科牧草饲料中的紫花苜蓿、红三叶、白三叶、红豆草、小冠
花和箭舌豌豆的准确识别提供分子水平上的科学依据。
3 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 样品
本研究共采集到豆科牧草六个样品，样品信息详见表 8。
表 8 样品信息
Table 8 Information of samples
属名
Genera
种名
Species
品种
variety
采样地点
Location
苜蓿属
Medicago
紫花苜蓿
Medicago sativa Linn
未知
unknown

甘肃农业大学草业学院
试验田
College of prataculture science
Gansu agricultural university test
plots
车轴草属
Trifolium
红三叶
Trifolium repens Linn
未知
unknown
白三叶
Trifolium pretense Linn
未知
unknown
红豆属
Onobrychis
红豆草
Onobrychis viciaefolia Scop
未知
unknown
小冠花属
Coronilla
小冠花
Coronilla varia Linn
未知
unknown
野豌豆属
Vicia
箭舌豌豆
Vicia gigantea Bge
未知
unknown
3.1.2 PCR 引物设计
参照 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中叶绿体 matK 和 rbcL 基因的核苷酸序列，采用
Primers5.0 (http://www.bbioo.com/download/58-166-1.html)进行引物设计。其中，matK 基因参照苜蓿属
(AF522102、AF522107)、野豌豆属(AF522155、HM026402)和车轴草属(AY386946、AF522138)等设计 3
对引物；rbcL 基因参照苜蓿属(AF522103、AF522104)、野豌豆属(AF522156、HM026403)和车轴草属
(AY386947、AF522139)等设计 1 对引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。(引物信息见表 2)
3.2 方法
3.2.1 基因组 DNA 提取
利用 CTAB 植物基因组提取试剂盒(BLKW)进行牧草基因组 DNA 的抽提纯化(罗焜, 2010)。
3.2.2 PCR 扩增
PCR 扩增采用 50 μL 体系：dNTP (2.5 mmol/L) 2 μL，10 × Buffer 5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.4
μL，DNA 模板 2 μL，上、下游引物各 1 μL (10 μmol/L)，加 ddH2O 至 50 μL。PCR 反应条件：94 °C 预变
性 2 min；94 °C 变性 40 s，退火 30 s、72 °C 延伸 30 s(30 个循环)；72 °C 延伸 10 min；4 °C 保存。
3.2.3 测序
PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳(30 min，150 V)检测，胶回收(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)目
的条带后，连接 PMD-18T 载体(TAKARA)，转化，克隆后送上海生工生物工程有限公司进行测序。
3.2.4 数据处理
利用 chromas2.33 (http://www.seekbio.com/DownloadShow.asp?id=284)对测序所得进行校对和编辑，并
利 用 MEGA5.0 (http://mega.software.informer.com/5.0/) 进 行 序 列 比 对 ， 同 时 借 助 Dnasp5.10
(http://www.itopdog.cn/soft/4785.html)分析单倍型和变异位点。
作者贡献
李永青对研究进行实施操作、数据与图片整理以及论文撰写；焦婷和赵生国对研究进行设计、指导
和论文审核修改，同时赵生国参与本研究的采样等具体工作。
致谢
本研究由甘肃省高等学校科研项目(2013A-64)和公益性行业(农业)科研专项(201503134)共同资助。
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