全 文 ：华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
陈景荣　　　　　　　韩素芬
(福建省森林病虫害防治检疫总站　福州 350003)(南京林业大学　南京 210037)
摘　要:　华东地区 51 个豆科树种(含羞草亚科 5 属 , 蝶形花亚科 18 属)根瘤中分离获得的 66 个菌株经形
态 、生理生化 、抗逆性等性状测定 ,对 42个性状进行了聚类分析 ,除 92-78-2 菌株外 , 65个菌株在 0.75 的相似
水平上可划分为 6 个菌群。根据菌株的生长速度 , 6 个菌群可以分为快生和慢生两个类群 , 但两类群的某些
性状与目前根瘤菌分类系统中的分属辨别特征不完全符合 , 如部分菌株能利用其淀粉。聚类分析结果还表
明 ,菌群划分的主要依据是表型特征 , 与寄主的种类 、来源没有相关性。 66 个菌株在形态 、生理生化 、抗逆性
以及交叉结瘤试验结果存在明显差异 ,表明了豆科树种根瘤菌的多样性。
关键词:　华东地区 , 豆科树种根瘤菌 , 多样性
收稿日期:1998-06-08。
基金项目:国家自然科学基金(39670601)。
DIVERSITY OF NODULE BACTERIA ISOLATED FROM THE
ROOT NODULESOF LEGUMINOUS TREES IN EAST CHINA
Chen Jingrong
(Forest Pest Quarant ine &Control S tat ion of Fuj ian Province　 Fuzhou350003)
Han Sufen
(Nanjing Forest ry Un iversity 　Nanj ing210037)
Abstract:　Six ty-six rhizobial st rains , isolated f rom root nodules of f if ty-one species of w oody legumes
(five genera in subfamily M imosoideae and eighteen genera in subfamily Papilionoideae)in East China ,
were studied by performing a fuzzy analysis of 42 phenotypic characteristics.Six clusters w ere formed be-
low the boundary level of 0.75 average distance except 92-78-2 strain.
We consider that six clusters should belong to the fast grow ers and slow grow ers.However , the prop-
erties of the two g row ers are correspond incompletely with the differential characters of the 4 genera in the
rhizobial taxonomic system , for example , some st rains can utilize starch as the sole carbon source.The re-
sults of numerical analysis also suggest that the primary basis of the division of the clusters is the phenotypic
characteristics , and has nothing to do with the category and o rigin of the hosts.Our results indicate that
tree rhizobia are very diverse w ith respect to thei r phy siological and biochemical properties.
Key words:　East China , Rhizobia from w oody legumes , Diversity
　　多年来 ,人们对生物共生固氮的研究多偏重于豆科作物 、绿肥 、牧草与根瘤菌的共生固氮体系 ,一直到
现在为止 ,根瘤菌的分类也大多仅涉及农业上的豆科植物(王素英 ,1997)[ 1] 。对于大量野生的豆科植物 ,
尤其在热带和亚热带分布的豆科树种根瘤菌很少见有报道 ,对其在形态 、生理代谢 、共生体系等方面表现
出来的差异缺乏了解 ,有关豆科树种根瘤菌分类方面的资料更为罕见。1980年 ,Basak(Basak MK et al .,
1980)[ 2]曾提议将豆科树种根瘤菌归属于豇豆族。1984年 ,Bergey 系统细菌学手册中 ,将许多豆科树种根
瘤菌归入 Bradyrhizobium 属 ,而该属实际上代表 1个杂乱的根瘤菌群 ,其中的分类关系还不清楚 。因此 ,
　第 35 卷 第 1期
1 9 9 9 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol.35 , No.1
Jan., 1 9 9 9 　
豆科树种根瘤菌的分类地位至今尚未确定。韩素芬等(1987)[ 3]曾建议将豆科树种根瘤菌分列于 Rhizobi-
um 和 Bradyrhizobium 两属中 。张小平等(1991)[ 4]通过对分离获得的豆科树种根瘤菌进行数值分类研究 ,
得到了 19个类群。可见自然界中豆科树种根瘤菌的多样性相当丰富。前人对于豆科树种根瘤菌的分类
研究目前仍只局限在少数豆科树种 ,对其在根瘤菌科中的分类地位仍然需要做更多 、更深入的工作 。本文
对我国华东地区豆科树种根瘤菌多样性做了探讨 。
1　材料与方法
1.1　菌株来源
从华东地区的豆科树种根瘤中分离获得的 66个根瘤菌菌株 。
1.2　培养基和培养条件
根瘤菌用 YEM 培养基作基础培养基 ,所有试验每种处理均设 3个重复 。除温度试验外 ,培养物均
在 28℃下恒温培养。
1.3　根瘤菌株的形态特征观察
1.3.1　菌落培养性状　存放在冰箱中的根瘤菌株经活化后 ,制备成稀释均匀的菌悬液 ,平板划线培
养。观察记录第 1个单菌落可见时间 、菌落直径以及其它性状。
1.3.2　鞭毛类型　取活化 3 ～ 4次的菌株 ,采用 Blehder Goldberg 鞭毛染色法染色 ,油镜下观察鞭毛的
数量及着生位置 。
1.4　根瘤菌株的生理生化特性研究
1.4.1　碳源利用　以各种碳源代替 YEM 培养基中的甘露醇 ,并用 0.0025%溴百里酚兰作 pH 指示
剂。供试碳源包括 D-半乳糖 、乳糖 、甜醇 、D-木糖 、海藻糖 、麦芽糖 、鼠李糖 、L-(+)阿拉伯糖 、葡萄糖 、可
溶性淀粉 、山梨糖 、蔗糖 、肌醇 、纤维二糖 、棉子糖 、木糖 、琼脂糖 、L-甲硫氨酸 、DL-α-丙氨酸 、L-精氨酸 、
水杨酸钠 、乙酸钠 、苯甲酸钠。
1.4.2　氮源利用　以各种氮源代替 YEM 培养基中的酵母汁 ,并用 0.0025%溴百里酚兰作 pH 指示
剂。测定的氨基酸包括 L-甲硫氨酸 、L-半胱氨酸 、L-胱氨酸 、L-谷氨酸 、DL-α-丙氨酸 、L-精氨酸 、L-赖氨
酸 、L-天冬氨酸 、L-苏氨酸 、L-苯丙氨酸 、L-瓜氨酸 、DL-酪氨酸 、L-脯氨酸 。
1.4.3　温度对生长的影响　选择测定温度为 10 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃。在上述不同设定温度下恒温
培养 。
1.4.4　pH 值对生长的影响　选择测定的 pH 值分别为 4 、5 、8.5 、10 。
1.4.5　NaCl浓度对生长的影响　配制浓度有 0.5%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%。
1.4.6　抗生素耐受性的测定　参考 Josey 方法。测定的抗生素包括林肯霉素(100μg/mL)、卡那霉素
(10μg/mL 、50μg/mL 、100μg/mL)、链霉素(10μg/mL 、50μg/mL 、100μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)、
青霉素(10μg/mL)、红霉素(30μg/mL)。
1.4.7　石蕊牛奶试验　根据《微生物分类学》(张纪忠 , 1990)[ 5]一书中的方法进行接种根瘤菌 ,培养
5 d 、10 d 、15 d分别观察记录相应特征 。
1.5　聚类分析
根据聚类分析类平均连锁法原理 ,应用 BAS IC 语言自行编制系统聚类分析程序。
2　结果与分析
所有菌落均为无色或乳白色 ,表面光滑 ,具光泽 ,不吸收刚果红 ,为典型的根瘤菌菌落 。根据试验
结果 ,最后选取 42个性状进行聚类分析 ,得 UPGMA 树状图(图 1)。从图 1 上可见 ,除 92-78-2菌株
外 ,供试的 65个菌株和对照的豌豆根瘤菌在 62.9%的相似水平上归为一群 ,在 75%相似水平上 , 65个
菌株可划分为 6个表观群 ,而豌豆根瘤菌单独为一类。6个表观群中 ,第 1 、2 、3 、4菌群的单菌落可见时
间为 6 ～ 7 d ,第 5 、6菌群的单菌落可见时间为 2 ～ 5 d。
第 1菌群包括 36个菌株 ,采集地点没有地域性 ,寄主广泛分布在含羞草亚科和蝶形花亚科各属的
豆科树种内 ,最小相似值 S =0.779。第 2菌群包括 3个菌株 ,可分为两个亚群。第 1亚群包括 92-115-
48 林 业 科 学 35 卷　
图 1　66 个豆科树种根瘤菌聚类分析树状图(UPGMA树状图)
Fig.1　Dendrogram of six ty-six rhizobial strains by UPGMA
Rpseudoacacia f .decaisneana:红花刺槐;Rpseudoacacia f .inermis:无刺槐。
1和 92-113两个菌株 ,均来源于福建 ,寄主为刺桐 、藤黄檀 ,在 S =0.853处相连;第 2亚群只有 92-64-1
一个菌株 ,来源于南京 ,寄主为胡枝子。两个亚群在 S =0.78处相连 。第 3菌群包括 8个菌株 ,采集自
江苏省和山东省 ,寄主植物分布于含羞草亚科和蝶形花亚科内 ,最小相似值 S =0.862 。第 4菌群有两
个菌株 ,来源于南京 ,寄主为苦参 、紫藤 ,最小相似值 S =0.829 。第 5 菌群包括 13个菌株 ,采集地点无
地域性 ,寄主植物分布于含羞草亚科和蝶形花亚科内 ,最小相似值 S =0.782。第 6菌群有 3个菌株 ,可
49　1期 陈景荣等:华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
分为两个亚群。第 1亚群包括 92-78-1和 92-73两个菌株 ,均来源于南京 ,寄主为铁马鞭 、毛叶怀槐 ,在
S =0.926处相连;第 2亚群只有 92-1-8一个菌株 ,来源于山东 ,寄主为刺槐。两个亚群在 S =0.787处
相连 。豌豆根瘤菌与第 6 菌群在 S =0.718处相连 。92-78-2菌株在树状图上表现很特别 ,最小相似值
S =0.464 。
各菌群的生理生化特征见表 1。根据计算结果 ,可确认第 1菌群以 92-64-2菌株为模式菌株 ,选取
的代表株有 93-158 、92-93 、93-144 、93-142 、92-108 、93-143 、92-56 、92-97 、92-159 等。其他菌群由于菌株
量少 ,群内各菌株的平均相似值未能超过 75%,因而不能选出模式菌株 。
3　结论及讨论
通过聚类分析研究 , 65个豆科树种根瘤菌在 75%的相似水平上初步分为了 6个菌群 ,表明了豆科
树种根瘤菌在形态 、生理生化 、抗逆性等方面的多样性 。
以前认为与热带豆科植物结瘤的多为慢生型根瘤菌 ,并根据“互接种族”的关系 ,将豆科树种根瘤
菌归属于豇豆族 。通过对 66个豆科树种根瘤菌聚类分析的研究和交叉结瘤试验(韩素芬 ,1996)[ 6]结
果表明 ,豆科树种根瘤菌的共生寄主范围已超出了豇豆族的植物范围 ,其分类与寄主植物没有很大的
关系。因此 ,本研究认为应把豆科树种根瘤菌从杂乱的豇豆族中分出来 。这与韩素芬 、周湘泉的研究
结果一致。另外 ,韩素芬在同一寄主根瘤中分离获得了快 、慢生型根瘤菌也更说明了根瘤菌与寄主植
物之间复杂的共生关系。
表 1　菌群的生理生化特征
Tab.1　The physiological and biochemical characteristics of six clusters
特　　征
Characteri stics
群 1
Cluster1
群 2
Cluster2
群 3
Cluster3
群 4
Cluster4
群 5
Cluster5
群 6
Cluster6
菌落
观察
Colo-
ny
Prope-
rties
单菌落可见时间
Visual time of
single colony
6～ 7d　Six ～ seven days
2～ 5d　Tw o ～ five days
颜色
Color
无色 Transparent
乳白色 Ivory
凸起程度
Prominence degree
平凸 Flat
高凸 High
粘度
S tickiness
大 Big
小 ～ 中等 Litt le～ Middle
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
1
2
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
1
2
-
4
-
-
-
3
-
+
-
+
1
2
-
+
-
+
-
+
1
2
鞭毛类型
Type of flagellum
单鞭毛 Single flagellum
多鞭毛 Many flagellum
11
25
1
2
2
6
+
-
+
-
2
1
温度实验
Grow th temperatu re
10℃
32℃
37℃
-
24
5
-
+
-
-
4
-
-
+
-
8
+
1
2
+
+
pH 值实验
pHage sensi tivity
pH=8.5
pH=10
1
-
-
-
-
-
1
-
+
-
+
+
NaCl耐受性
NaCl tolerance
0.5%
0.8%
1.0%
3
-
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
+
7
3
+
+
+
石蕊牛奶实验
Litmus milk culture
产酸 Acid-produced
产碱 Alkaligenous
酸凝 Acid curd
凝乳酶沉淀 Rennet curd
无反应 No reaction
-
34
-
-
2
-
2
-
-
1
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
-
+
-
1
2
1
2
-
50 林 业 科 学 35 卷　
　　　　续表 1
唯一碳源利用
Utility of sole carbon
resource
乳糖 Lactose
甜醇 Dulci tol
D-木糖 D-xylose
海藻糖 T rehalose
麦芽糖 Maltose
可溶性淀粉 Soluble starch
山梨糖 Sorbi tol
肌醇 Inosi tol
L-谷氨酸 L-Glutamic acid
L-甲硫氨酸 L-Methionine
19
7
35
26
31
28
29
18
35
33
-
-
-
-
-
-
-
1
+
1
+
+
1
+
+
7
1
+
+
+
+
+
1
+
+
-
-
+
+
+
12
11
8
+
+
7
3
+
+
+
+
+
2
+
+
+
1
+
+
+
唯一氮源实验
Utilit y of sole nit rogen
resource
L-甲硫氨酸 L-Methionine
L-半胱氨酸 L-Cysteine
L-精氨酸 L-Arginine
DL-α-丙氨酸 DL-α-Alanine
L-赖氨酸 L-Lysine
DL-酪氨酸 DL-Tyrosine
35
+
35
33
35
34
+
+
+
2
+
-
+
3
+
4
7
-
+
+
+
-
1
-
+
+
+
10
+
1
+
+
+
+
+
2
抗生素抗性
An tibiotic resistance
50μg/mL卡那霉素 Kanamycin
100μg/mL卡那霉素 Kanamycin
10μg/mL青霉素 Penicillin
10μg/mL链霉素 St reptomycin
50μg/mL链霉素 St reptomycin
100μg/mL链霉素 St reptomycin
50μg/mL庆大霉素 Gentamycin
22
1
35
35
27
17
35
2
-
+
+
1
1
+
6
-
-
1
-
-
-
1
1
+
-
-
-
-
+
9
7
6
4
-
-
2
-
+
+
-
-
-
　　　　①“ +”表示阳性反应;“ -”表示阴性反应;“ 1 , 2 , … , 35”等数字表示阳性反应的菌株数。“ +”means posit ive react ion;
“ -”means negative reaction;“ 1 , 2 , … , 35”means the number of strains of positive reaction.
在Bergey 鉴定细菌学手册中 ,豆科树种根瘤菌被认为是属于慢生型根瘤菌 ,并作为豇豆类群归入
Bradyrhizobium 属中 。从本试验聚类分析的 UPGMA 树状图上可见 ,单菌落可见时间为 2 ～ 5 d的菌
株归入菌群 5 、6中 , 6 ～ 7d菌株归入菌群 1 ～ 4中 ,据此 ,本研究认为豆科树种根瘤菌并不都是慢生型 ,
它们也可以分为快生类群和慢生类群(见图 1中水平虚线)。
研究还发现 ,快 、慢生类群中的豆科树种根瘤菌在形态 、生理生化特性上存在明显差异 ,其中在石
蕊牛奶试验中表现得尤为明显 。慢生类群菌株在石蕊牛奶试验中 ,凡产碱的菌株归为第 1 、2菌群 ,产
碱并有凝乳酶沉淀现象的菌株归为第 3菌群 ,产酸并有酸凝现象的菌株归为第 4菌群 。因此 ,本研究
认为还可将豆科树种根瘤菌分为不同的亚群 ,它们在亚群分类水平上具有多样性。
研究结果证明 ,豆科树种根瘤菌分群的主要依据是菌株的表型特征 ,与寄主植物的种类 、来源没有
相关性。
对照根瘤菌科目前的分类系统 ,发现豆科树种根瘤菌的快 、慢生类群菌株在某些性状上与 4属辨
别特征存在差异:(1)在慢生类群根瘤菌中 ,除 3个菌株菌落为乳白色 、不透明外 ,其余菌株的菌落均为
无色 、透明;(2)快 、慢生类群菌株在矿盐-甘露醇或其它碳水化合物培养基上不产碱 ,多数菌株产酸 ,
因此本研究认为 pH值变化不能作为衡量快 、慢生类群根瘤菌的指标;(3)在碳源试验中发现某些菌株
能以可溶性淀粉作为唯一碳源 ,这与张小平的研究结果相同 ,而与 D.C.Jordan提出的根瘤菌不利用淀
粉的观点不一致 。该现象的产生说明某些豆科树种根瘤菌的代谢方式和以往研究的根瘤菌不同 ,对其
机理还应进行深入的研究 。由此可见 ,本研究中豆科树种根瘤菌的表型特征与目前的分类系统不完全
符合 。
此外 ,研究结果表明豌豆根瘤菌与豆科树种根瘤菌在形态 、生理生化 、共生寄主等性状上不完全相
同 ,其在 UPGMA树状图上被单独列为一类 ,这表明豆科树种根瘤菌与草本植物根瘤菌之间有较大的
差异 。
51　1期 陈景荣等:华东地区豆科树种根瘤菌多样性的研究
本研究所用的豆科树种根瘤菌虽大都采自华东地区 ,但从试验结果来看 ,仍具有代表性 。另外 ,研
究所设的对照仅为豌豆快生型根瘤菌 ,若能将试验结果与前人试验所得的豆科草本植物根瘤菌的各种
表型特征进行系统聚类分析 ,将可以对豆科树种根瘤菌在根瘤菌分类系统中的地位作更细致的讨论。
总之 ,对豆科树种根瘤菌分类地位的确定 ,还有待于采集更多的菌株 ,并应用新的技术手段(如 DNA/
DNA杂交 、16SrRNA 等)做进一步的工作 。
从 UPGMA 树状图上可见 ,第 3 、4菌群与第 5 菌群的最小相似值 S =0.73 ,并能利用较广泛的碳
源和氮源 ,这类菌株可能是慢生类群与快生类群豆科树种根瘤菌之间的过渡类型 。第 6 菌群的 3个菌
株与豌豆根瘤菌在 S =0.718处相连 ,也表明这一菌群菌株的某些特性与草本植物根瘤菌较接近。结
合生理生化特征 ,似乎可以这么认为:第 1 、2菌群的菌株较原始 ,生长慢 ,对不良环境的抗逆性较差 ,经
过第 3 、4菌群逐渐进化为快生型根瘤菌 ,抗逆性也逐步增强 。但豆科树种根瘤菌是否有这样的进化趋
势还需要深入的研究 。
92-78-2菌株在 UPGMA 树状图上与其余根瘤菌有很大差异 ,最小相似值 S =0.464。菌株在南京
采集 ,寄主为铁马鞭 ,是唯一的单菌落可见时间为 9d的菌株 。而与该菌株同一寄主根瘤上分离的快生
型92-78-1菌株在各个性状上却表现出对环境很强的适应性 ,对于两个菌株为何都在铁马鞭上结瘤以
及92-78-2菌株在树状图上表现出来的特异现象 ,还有待于进一步从形态解剖和遗传学方法上的研究
来确定。
在碳 、氮源试验中还观察到菌落发生了 4种变化:产酸 、菌落中心产生黄色沉淀 、菌落变黄 、菌落变
绿 ,并且前 3种变化有时交叉。同一菌株在不同碳源上的变化不同 ,各菌株在同一碳源培养基上的表
现也不相同 。菌株在以某些氨基酸为唯一碳源的培养基上生长时 ,菌落会变绿。菌落发生的这种变化
可能与各菌株的代谢途径之间有一定的关系 ,其规律还需在对大量菌株研究后的基础上进行总结。在
氮源试验中 ,有一些菌株的菌落开始为绿色 ,生长一段时间后又转变为黄色 。
在石蕊牛奶试验中还发现 92-1-6 、87-1-1 、87-2 、93-140 、84-21等 5个菌株产生反应所需的时间长达
半个月以上 ,且都产碱 ,所产生的乳清层可分为 2 ～ 3层 ,各层颜色还不相同;92-1-6菌株的乳清层底部
为豆黄色沉淀 ,中间为浅紫色沉淀 ,上部为紫罗兰清液;87-1-1 、93-140 、87-2 3个菌株的各层均较 92-1-6
菌株的各层为深;84-21菌株乳清层的上层为紫罗兰清液 ,下层为淡紫色沉淀。5个菌株的寄主和来源
不固定 ,在菌落形态 、生理生化性状测定试验结果中没有发现其它异常现象。以上现象还未见过报道 ,
产生的原因还需深入研究 。
参　考　文　献
1　王素英.根瘤菌分类的新进展.微生物学通报 , 1997 ,24(1):44～ 47
2　Basak M K and Goyal S K.Studies on t ree legum es Ⅲ.Characterizat ion of the sym bionts and di rect and reciprocal cross inoculat ion studies
w ith tree legumes and cultivated legum es.Plant S oil , 1980 , 56(1):33～ 51
3　韩素芬 ,周湘泉.豆科树种根瘤菌共生体系的研究Ⅱ:豆科树种根瘤菌的分类地位.南京林业大学学报 , 1987(2):28～ 36
4　Zhang X P , Harper R , Karsisto M and Lindst rom K.Diversity of Rhizobium Bacteria Isolated f rom the Root Nodules of Leguminous Trees.
International Journal of Systematic Bacteriology , 1991(1):104～ 113
5　张纪忠主编.微生物分类学.1990 ,上海:复旦大学出版社
6　韩素芬 ,陈景荣 ,谢文娟.豆科树种根瘤菌与四种豆科植物的接种试验.林业科学研究 , 1996 , 9(6):610～ 615
52 林 业 科 学 35 卷