全 文 ：华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究＊
王　平　王　勤　冯新梅
(华中农业大学农业部农业微生物重点开放实验室 , 武汉 430070)
摘要　本文首次报道了华癸根瘤菌在水稻 、小麦 、油菜和棉花 4 种非豆科作物根圈的定殖能力。 分别通过
盆栽试验并采用外源标记基因(luxAB 和 gusA)特异性检测技术进行检测 , 研究发现华癸根瘤菌不但可以在这 4
种非豆科植物根圈定殖 ,而且还能进入根内 , 其数量可达 103 个/ g 以上。接种华癸根瘤菌对油菜和棉花根系的
生长有一定影响 ,并能显著促进水稻的生长 , 为扩大华癸根瘤菌的应用范围展示了诱人的前景。
关键词　华癸根瘤菌;非豆科植物;luxAB和 gusA 标记基因;根圈定殖;促长作用
中图法分类号　S 154.381
　　近年来的许多研究结果表明根瘤菌不但能够与
豆科植物共生固氮 ,而且有的菌株还能在非豆科植
物根圈定殖 ,甚至进入根内且促进植物生长[ 1] 。根
瘤菌这一作用的发现无疑再次激起了人们对根瘤菌
应用于非豆科作物生产的研究兴趣 。深入开展这方
面的研究 ,不但可以进一步拓展我们对根瘤菌的认
识 ,而且还可以为我们扩大根瘤菌的应用范围提供
指导 。长期以来 ,在长江中下游地区 ,华癸根瘤菌
(Mesorhizobium huakui i)接种剂只是作为提高老区
或新区紫云英绿肥产量的关键性技术措施而加以使
用 ,由于它不能直接应用于农作物 ,没有直接创造出
经济效益 ,近年受到了农民的冷落 。如果我们在证
明华癸根瘤菌能在一些非豆科农作物根圈定殖的基
础上 ,再筛选出一些可以直接促进这些农作物生长
的菌株 ,那么 ,根瘤菌的应用前景将更趋美好 。在长
期的稻肥轮作过程中 ,紫云英在稻田中有较长的一
段生长时间 ,在被翻压入土后 ,根瘤溃败 ,大量根瘤
菌也会进入土壤 ,这些根瘤菌能否在密集的水稻根
系上定殖 ?水稻根系对其是否有根圈效应? 它们之
间是否已形成一种密切而又良好的直接关系 ?这些
根瘤菌与其它一些共处于相同土壤环境中的非豆科
植物关系又如何 ?这都是引起我们的兴趣并试图回
答的问题 。
本研究采用特异性外源基因标记检测技术结合
盆栽试验和 MPN 法结瘤试验初步研究了华癸根瘤
菌在水稻 、油菜 、小麦和棉花根圈的定殖能力及其对
水稻的促长作用 ,为今后进一步研究其定殖动态及
其与非豆科植物的相互关系打下了基础 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株 、作物及土壤
带有发光酶基因(luxAB)标记的华癸根瘤菌
(Mesorhizobium huakuii)JS5A16L ,为华中农业大学微
生物分子生态研究室构建[ 2] ,抗卡那霉素(Km),其野
生型菌株 JS5A16由华中农业大学微生物分子生态研
究室分离自江苏省武进县。带有葡聚糖苷酶基因
(gusA)标记的华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)
JS5A16G ,系华中农业大学微生物分子生态研究室构
建[ 2] ,抗壮观霉素(Sp)。其野生型来源同上 。供试作
物品种:水稻 ,汕优 63;油菜 ,远杂 3号;小麦 ,鄂麦
21;棉花 ,鄂抗 1号。均购自湖北省种子公司。紫云
英种子:购自湖北省农科院 。供试土壤:黄棕壤 ,采自
华中农业大学试验农场玉米地。将土壤晾干 、打散
后 ,过筛 ,装入相应容器内 ,备用。
1.2　培养基 、抗生素及其它
SM 培养基:甘露醇 , 10 g;KNO3 , 0.5 g;
K2HPO3 ,0.5 g;MgSO4 ,0.2 g;NaCl , 0.1 g;Rh 微
量元素液 , 4 ml;混合维生素液 , 10 ml;琼脂 , 15 g;
蒸馏水 ,986 ml;PH ,6.8-7.0。(RH 微量元素液:
H3BO3 ,0.5 g ;Na2MoO4 , 0.5 g ;蒸馏水 , 100 ml。混
合维生素液 ,VitB1 ,10 mg;Vitpp ,10 mg;泛酸钙 , 10
mg;VitH , 1 mg;蒸馏水 , 100 ml。)YMA 培养基的
配方参见文献[ 3] ,卡那霉素(Km)和壮观霉素(Sp)
收稿日期:1999-02-04
＊国家和湖北省自然科学基金资助项目
王　平 ,男 , 1964年生 ,博士 ,副教授.工作单位:华中农业大学生命科学技术学院 ,武汉 430070
第 18卷 第 3期
1999 年　6 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vo l.18　No.3
June　1999
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.1999.03.011
的使用浓度均为 100 μg/ml ,放线菌酮(Cyc)使用浓
度为 200μg/ml。75%酒精 、0.1%HgCl2 、5%NaClO
为表面消毒剂 , 20%癸醛及 50 μg/ml X-GlucA 分别
为 luxAB 和 gusA 标记基因表达的检测底物 。其
它材料:塑料桶 ,口径 20 cm ,底径 15 cm ,深 17 cm ,
用于水稻栽培;陶钵 ,直径 15 cm ,深 20 cm ,用于小
麦 、油菜和棉花栽培 。
1.3　盆栽试验
接种剂的制备:从 SM 斜面上挑取已活化的
JS5A16L 和 JS5A16G 菌苔各一环分别接种至 100
mlYMA液体培养基中 , 28 ℃、150 r/min 摇床培养
3 d后 ,测菌数 ,待用 。用于小麦和油菜盆栽试验接
种的菌液中 JS5A16L 及 JS5A16G 的数量分别为3.1
×108 cfu/ml和 7.2×108 cfu/ml ,用于水稻和棉花
盆栽试验接种的菌液中 JS5A16L 及 JS5A16G 的数
量分别为 1.6×108 cfu/ml和 6.8×108 cfu/ml。
种子催芽 、接种及播种:分别选取颗粒饱满的水
稻 、小麦和油菜种子先水浸 12 h ,再置于 28 ℃温室
保湿催芽。棉种则先经浓 H2SO4 脱绒 、自来水冲
洗 ,余下处理同其它种子。将露芽的种子数粒分别
与 2种菌液(各 80 ml)混合并浸泡 1 h 。将种子与
80 mlYMA液体培养基混合作为对照 。先将种子播
入盛有土壤的容器内 ,再倒入剩余菌液及培养液 。
对于水稻 ,则补充水分至淹没土壤 。将各容器置于
自然光照条件下 ,按常规方法加以管理。每个处理
设 3个重复。
1.4　根圈中标记菌株的检测
称取 10 g 粘附有少量土壤的植物根系 ,按稀释
平板测数法作系列稀释 。取合适稀释度涂相应 SM
抗性平板(JS5A16L 采用 SM+Cyc+Km 抗性平板 ,
JS5A17G采用 SM +Cyc+Sp抗性平板),28 ℃培养
5 ～ 7 d。待平板上长出可计数菌落后 ,在 SM +Cyc
+Km 抗性平板盖内加入 2 μl 20%癸醛 ,于暗室中
计数发光菌落;对于 JS5A17G ,则选取菌落数适度
的平板 ,将所有近似华癸根瘤菌的菌落用无菌牙签
点种至加有 X-GlucA 的平板上 , 28 ℃培养 5 ～ 7 d
后 ,观察并计数蓝色菌落 。
1.5　根内标记菌株的检测
先用自来水将根冲洗干净 ,以吸水纸将水吸干
后晾一会儿 ,再称取 1 g 根置于 3%～ 5%NaClO 溶
液中 ,浸泡 3 ～ 5 min 。取出根 ,用无菌水洗涤 7 ～ 8
次 ,并将最后一次洗液涂相应抗性平板 ,以检测表面
灭菌效果 。在无菌研钵中将根研碎 ,加入9 ml无菌
水得 10-1样品悬液 。再按稀释平板测数法涂相应
抗性平板 ,按 1.4 所述方法分别计数 JS5A16L 及
JS5A16G菌落数 。
1.6　MPN法紫云英结瘤试验
先将 1∶1(V/V)的砂土混合物装到 18 mm ×
180 mm 试管中至 1/3管长处 ,加水湿润后 ,121 ℃
湿热灭菌 2次 ,间隔24 h灭1次 ,每次 1 h。选取颗
粒饱满的紫云英种子经 75%酒精和 0.1%HgCl2 各
处理 5 min ,用无菌水洗涤 10 次后 ,于 28 ℃催芽 。
将露芽的种子按每管 2粒播入砂土管中 ,每管接 1
ml 1.5项所述的不同稀释度的菌悬液并尽量滴在
种子上 ,每个稀释度设 4个重复 ,另设每管加入 1 ml
无菌水的 4支砂土管作为空白对照 。将砂土管置于
自然光照下培养 ,并定期加水保持湿润。20 d后 ,
取出紫云英植株 ,洗净根系后 ,记录结瘤阳性管数 ,
查 MPN 法统计表 ,计算结果[ 4] 。
2　结果与讨论
2.1　JS5A16L及 JS5A16G在非豆科植物根圈的定
殖能力
在小麦和油菜播种后 12 d开始取样进行检测 ,
以后每隔 10 d检测 1次 ,共 5次 ,测定结果如表 1 。
表 1　JS5A16L及 JS5A16G在小麦和油菜根圈的数量1)
Table 1　Populations of JS5A16L and JS5A16G in the rhizosphere
of wheat and rapeseed logcfu/g
菌株
S trains
作物
Crops
播种后天数　Days af ter Sow ing
12 22 32 42 52
JS 5A16L 小麦 Wheat 7.51 7.37 7.61 6.91 6.56
油菜 Rape seed 7.45 7.02 7.57 7.06 6.86
JS5A16G 小麦 Wheat 7.65 7.02 7.50 7.23 7.08
油菜 Rape seed 7.44 7.22 7.38 7.23 7.04
　　1)表中数据为 3个重复的平均值 ,且 2种作物的对照处理样品
中均未检出标记菌株
Each datum in the table is average of 3 repeats , no genes-marked
strain was detected in the samples of uninoculated t reatments of 2 crops
从表 1可知 , JS5A16L 和 JS5A16G 都能在小麦
和油菜的根圈定殖 ,且二者间的差异不大。其总体
变化趋势为根圈定殖密度随着生长时间的增加而缓
慢下降。
在水稻播种后 21 d开始取样 ,以后每隔14 d取
1次样 ,共 3次;在棉花生长至 35 d时开始第1次取
样 ,第 49 d时取第 2 次样 ,检测标记根瘤菌在水稻
和棉花根圈的定殖情况。检测结果如表 2所示。
239　第 3 期 王　平等:华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究 　
表 2　JS5A16L及 JS5A16G在水稻和棉花根圈的数量1)
Table 2　Populations of JS5A16L and JS5A16G in the rhizosphere
of rice and cotton logcfu/g
菌株
S trains
作物
Crops
播种后天数　Days af ter sow ing
21 35 49
JS 5A16L 水稻 Rice 6.30 6.30 6.35
棉花 Cot ton 6.73 6.71
JS5A16G 水稻 Rice 7.06 7.02 6.34
棉花 Cot ton 6.54 6.45
　　1)表中数据为 3个重复的平均值 ,且 2种作物对照处理中未检
出标记菌株
Each datum in the table is average of 3 repeats , no genes-marked
s train was detected in the samples of uninoculated t reatments of 2 crops
从表 2 可以看出:JS5A16G在水稻根圈的定殖
密度比 JS5A16L 的要高一些 , 2种标记菌株在棉花
根圈的定殖水平相似 。且下降都较缓慢 。
2.2　JS5A16L和 JS5A16G在 4种非豆科作物根内
的定殖能力
在水稻和棉花播种后 49 d ,小麦和油菜播种后
52 d时分别取根样测 JS5A16L 和 JS5A16G 在根内
的数量如表 3。
表 3　JS5A16L和 JS5A16G在 4种作物根内的数量1)
Table 3　Popllations of JS5A16L and JS5A16G in
the root interior of rice , wheat , rape seed and cotton　　logcfu/g
菌株
S trains
作物 C rops
水稻
Rice
棉花
Cotton
小麦
Wheat
油菜
Rapeseed
JS 5A16L 3.32 3.45 4.25 3.60
JS5A16G 3.26 3.41 3.90 3.44
Cont rol 0 0 0 0
　　1)表中的数据均为 3个重复的平均值 ,最后一次样品洗液中均
未检出标记菌株
The datum in the table is average of 3 repeats , no genes-marked
s train was detected in the last washing liquid of root samples
从表 3可以看出:2个标记菌株在 4种非豆科
作物根内的定殖数量均在 3.0 ～ 4.0 logcfu/g 左右 ,
但都比根圈中的数量水平低约 3 个数量级。且
JS5A16L 和 JS5A16G 均表现为在小麦根内的定殖
数量最高 ,在水稻中的最低。
为进一步证实上述经过表面灭菌的植物根组织
内是否含有仍能在紫云英根上结瘤的华癸根瘤菌 ,
我们还采用 MPN 法紫云英结瘤试验 ,测定了 4 种
作物根内标记根瘤菌的数量 ,其结果如表 4。
表 4　JS5A16L和 JS5A16G在 4种作物根内的数量1)
Table 4　Numbers of JS5A16L and JS5A16G in the interior root of
rice , wheat , rapeseed and cotton(MPN method) cell s/g
菌株
S trains
不同作物根内标记菌株的数量
Populat ions of marked strains in interior of
dif ferent crops root s
水稻
Rice
棉花
Cotton
小麦
Wheat
油菜
Rapeseed
JS 5A16L 6.0×103 1.2×104 1.6×104 2.0×104
JS5A16G 1.7×104 3.5×103 3.5×104 6.0×103
　　1)各类对照处理的紫云英根上均未检出根瘤
No nodule w as defected on the root of Astrogulas sinicus in any
cont rol t reatments
从表 4 可以看出:通过 MPN 法紫云英结瘤试
验 ,所测标记菌株在 4种不同作物根内的数量与采
用稀释平板直接测数法所得结果基本相似 ,均在
103 ～ 104个/g 根左右。这也证明了分离培养自根
内的标记根瘤菌确实是华癸根瘤菌 ,符合柯赫原则 。
2.4　标记菌株对 4种非豆科作物生长的影响
当油菜和小麦生长 52 d ,棉花生长 49 d时 ,与
对照处理相比 ,接种了标记菌株的植株 ,从地上部分
看不出差异 ,但根系生长状况差异明显 ,特别是接种
处理的油菜和棉花根系生长异常 ,其侧根短而粗 ,这
一现象与 Reddy 等[ 5] 和 Yanni等[ 6]报道的结果一
致 ,其原因可能是根瘤菌能在这些作物的根圈内产
生脱落酸(IAA),从而影响根系的正常发育。
表 5　接种 JS5A16L和 JS5A16G对水稻生长的影响＊
Table 5　Effects of inoculation of JS5A16L and
JS5A16G on plant growth of rice
处理
T reatm ents
地上部高度/ cm
Shoot length
根长/ cm
Root length
总干重/ g
T otal dry w eight
Cont rol 27.4a 20.4a 2.71a
JS 5A16L 44.3b 19.2a 3.53b
JS5A16G 41.9b 18.8a 3.36b
　　＊数据后不同字母表示显著性检验差异极显著(Duncan法)(P
>0.01)
Mean values follow ed by the letter a or b are siguificant ly diff eren t
(Duncan s test)(P >0.01)
从表 5则可看出 ,与不接种对照相比 ,接种华癸
根瘤菌对水稻根长的影响并不明显 ,但对地上部高
度和植株总干重有显著的促进作用 。
3　小　结
关于根瘤菌与非豆科作物相互作用的研究近年
240　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 18 卷　
来逐渐引起了人们的重视 ,但其研究热点已由过去
的通过人工诱导将根瘤菌引入非豆科作物根内并试
图使之结瘤固氮转向筛选能在某些非豆科作物根圈
或根内自然定殖并能促进作物生长的根瘤菌 PGPR
菌株 ,从而拓宽根瘤菌的应用范围 。迄今已有许多
学者分别研究了 Rhizobium leguminusarum biovar
phaseoli 在玉米和莴苣[ 7] , R .legum inusarum bio-
var tri fol ii 在小麦 , 玉米 , 萝卜 , 芥菜[ 8～ 10] 和水
稻[ 6] , Bradyrhizobium spp., B .elkanii , Rhizobi-
um trifolii , R .meli lot i 等在水稻[ 6]根部的定殖能
力及其对植株根系和地上部生长的影响 。但关于常
年与水稻共处于稻田土壤环境中的华癸根瘤菌在水
稻等非豆科作物根圈的定殖能力及其促长作用的研
究尚未见报道 ,本研究结果表明华癸根瘤菌不但在
供试 4种非豆科植物根圈具有较强的定殖能力 ,而
且即使是在土壤条件下 ,也对植物的生长表现出明
显的影响 ,特别是能提高水稻的生物学产量。
本研究还初步证明供试菌株能进入 4种非豆科
作物的根内 。但要揭示这些菌株是如何进入根内
的 ,具体定殖在根内的什么部位 ,能否进入根组织细
胞内等问题 ,尚待进一步研究 。
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ROOT COLONIZATION OF NON-LEGUME PLANTS BY luxAB and
gusA GENES MARKED huakuii JS5A16
Wang Ping　Wang Qin　Feng Xinmei
(Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070)
ABSTRACT　This paper reported the results of roo t colonization of non-legume plants by luxAB and
gusA genes marked Mesorhizobium huakuii JS5A16 in pot culture experiments.M .huakuii JS5A16 no t on-
ly colonizes the rhizosphere of rice , wheat , rapeseed and cot ton , and the colonization densi ty can reach 107
cfu/g root plus soil , it also enters the interio r root of the above plants , the populations w ere more than 103
cells /g.There w ere obvious effects on roo t g row th of rapeseed and co tton by inoculating M .hukuii
JS5A16 , and i t can promote the g row th of rice plant significant ly.These resul ts showed a bright prospect to
enlarge the scale of Mesohizobium huakui i in ag ricultural production in the future.
KEYWORDS　Mesorhizobium huakuii , non-legume plants , luxAB and gusA marker genes , root col-
onization , g row th promotion
241　第 3 期 王　平等:华癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究