全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 November 2008, 27(6): 852-862

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






中国禾本科植物内生真菌研究4. Epichloë yangzii
的人工杂交
亢燕 李伟 纪燕玲 孙相辉 詹漓晖 于汉寿 王志伟*
南京农业大学生命科学学院 南京 210095


摘 要：作者首先研究Epichloë yangzii在植株上的人工杂交，明确了供试菌株的交配型。然后将分离自无
子座鹅观草属植物的23株“Neotyphodium属”真菌孢子分别与E. yangzii的子座杂交，其中发现有21株与
E. yangzii（mat-1，mat-2）杂交不亲和，有2株与E. yangzii（mat-1）杂交亲和。利用tubB基因片段对8株
“Neotyphodium属”真菌菌株进行系统发育分析，结果表明与E. yangzii杂交亲和的2个菌株和E. yangzii聚
为一枝，而其它6个菌株形成独立的分枝，进一步证实了这2个菌株是有时在宿主植物上不形成子座的E.
yangzii。这说明了在宿主植物上的人工杂交是区别有时不产子座的E. yangzii和Neotyphodium属真菌的有效
手段。
关键词：epichloë内生真菌，鹅观草属植物，交配型，子座，tubB

Grass endophyte researches 4. Mating tests of Epichloë
yangzii
KANG Yan LI Wei JI Yan-Ling SUN Xiang-Hui ZHAN Li-Hui YU Han-Shou
WANG Zhi-Wei*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Mating tests between isolates of Epichloë yangzii were conducted and different mating types of
isolates were confirmed. Mating tests between stromata of E. yangzii and spermatia obtained from 23
“Neotyphodium” isolates of non-stromata producing Roegneria spp. were also carried on. Two “Neotyphodium”
isolates were interfertile with E. yangzii (mat-1), while the remained 21 isolates were not interfertile with E.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No. 30070019 和 No. 30670008）
*Corresponding author. E-mail: zwwang@njau.edu.cn
收稿日期：2008-01-11，接受日期：2008-05-08
DOI:10.13346/j.mycosystema.2008.06.003
Vol.27 No.6 853
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
yangzii (mat-1, mat-2). To further verify the result of mating tests, phylogenetic analysis based on tubB
sequences of 8 “Neotyphodium” isolates, including 2 cross-fertile isolates, were conducted. The 2 cross-fertile
isolates clustered with E. yangzii were significantly separated from the clade of the remained six isolates,
indicating they should be E. yangzii. These evidences support that the mating test is an effective way to
distinguish non-stromata producing E. yangzii from Neotyphodium sp.
Key words: epichloë endophyte, Roegneria spp., mating type, stromata, tubB


麦角菌科Clavicipitaceae中的Epichloë（香柱菌属）真菌是以能在冷季型禾本科植物叶
鞘或茎秆上形成子座为基本特征的内生真菌类群，其无性世代以及永远失去有性世代的则
为Neotyphodium属（White et al. 1993；Glenn et al. 1996）。目前Epichloë属有11个种，
Neotyphodium属有17个种（Schardl et al. 2004；Li et al. 2004；Moon et al. 2007）。
Neotyphodium属真菌的绝大多数种是通过Epichloë属真菌之间的杂交或其它原因失去有性
世代后进化而来，而不是简单的Epichloë属真菌的无性世代（Moon et al. 2002；Moon et al.
2004；Moon et al. 2007；Schardl et al. 2004）。实际上Neotyphodium属真菌在遗传上和Epichloë
属真菌的无性世代还是有着严格的区别，如tefA、tubB等基因的拷贝数等（Moon et al. 2002；
Moon et al. 2004；Moon et al. 2007）。由于Neotyphodium属真菌和Epichloë属真菌之间存在
着非常复杂的联系，现在它们被统称为epichloë内生真菌（Schardl et al. 2004；Gentile et al.
2005）。
Epichloë属真菌为异宗配合的子囊菌，通过相同交配群（mating population）不同交配
型（mat-1，mat-2）的菌株之间杂交来完成其有性生殖。在有性生殖过程中，杂交子座上
的菌丝层增厚，4-6周后形成子囊壳，子囊壳内产生可育的子囊和子囊孢子。相同交配型的
菌株之间或不同交配群菌株之间杂交后，杂交子座不产生子囊壳或子囊壳败育（Chung &
Schardl 1997）。在Epichloë属中，亚洲原产的种只有我们从鹅观草Roegneria kamoji Ohwi上
发现的扬子香柱菌Epichloë yangzii W. Li et Z. W. Wang（Li et al. 2006）。至今在欧洲和北美
洲的研究表明：通过和宿主植物及其生长环境的相互作用，Epichloë属真菌在宿主植物旗
叶的叶鞘或茎秆上形成子座，未成熟的子座由一层致密的菌丝层组成，表面密布分生孢子。
Botanophila属的飞蝇取食子座上的菌丝及孢子，将分生孢子传播到其它子座上，帮助真菌
完成杂交（Bultman et al. 1995；Bultman & Leuchtmann 2003），这种现象被称为“三元共
生现象”（three way mutualism）。但是这种现象在E. yangzii上没有得到确认，E. yangzii的
交配途径尚不明了。
交配特征是Epichloë属真菌的重要特征之一（Leuchtmann & Schardl 1998；Schardl &
Leuchtmann 1999；Li et al. 2006）。有些子囊菌的杂交可以在培养基上完成，有些必须依靠
活体植物才能完成。Epichloë属真菌的杂交过程只能在宿主植物的体表完成（Bultman et al.
1995；Bultman & Leuchtmann 2003）。但是，大部分Epichloë属真菌并不是每个年份都能在
宿主植物上产生子座，子座的产生与否，不仅与真菌以及宿主植物的种类有关，而且还与
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植物的生长环境、营养状态等有关。如E. bromicola Leuchtmann et Schardl在宿主植物Bromus
erectus Hudson产生子座，在另两种宿主植物B. ramosus Hudson和B. benekenii (Lange) Trim.
体表不产生子座（Leuchtmann & Schardl 1998）。Neotyphodium属真菌在宿主植物体表不表
现出任何症状（White et al. 1993；Schardl et al. 2004）。因此，在宿主植物上未产生子座的
Epichloë属真菌在形态上和Neotyphodium属真菌没有多大的区别。
作者明确了E. yangzii菌株的不同交配型，建立了E. yangzii的人工杂交体系，为今后E.
yangzii的育种提供了重要手段。作者还发现了分离自无子座鹅观草属植株的“Neotyphodium
属”真菌中有大部分的Neotyphodium属真菌和少量的有时不产子座的E. yangzii，由此提出
这种人工杂交的方法是区别有时不产子座的E. yangzii和Neotyphodium属真菌的有效手段。
1 材料和方法
1.1 生物材料
供试菌株：本实验室保藏的分离自我国无子座鹅观草属植物“Neotyphodium属”真菌
23株和E. yangzii 9株（表1）。Rnj5701（mat-1）和Rnj5201（mat-2）为E. yangzii的标准菌株。
供试植物：带有子座的鹅观草属植物（图1-A）：用于Epichloë属真菌之间杂交的植株
（5株）：PRnj5201、PRnj5202、PRnj5701、PRnj5702和PRnj6102（分别感染Rnj5201、Rnj5202、
Rnj5701、Rnj5702和Rnj6102菌株）。用于Epichloë yangzii和“Neotyphodium属”真菌杂交的
植株（4株）：W1、W2、R3和R8，其中W1和W2植株上的菌株交配型均为mat-1；R3和R8
植株上的菌株交配型均为mat-2。

表1 用于杂交试验的供试内生真菌菌株的宿主和来源
Table 1 Host and origin of fungal isolates used in mating tests
菌株
Fungal isolate
菌种
Species
宿主植物
Host
采集地
Geographic origin
采集时间
Sample time
Rnj3302; Rnj3303; Rnj3304;
Rnj4301
E. yangzii
Roegneria
kamoji
江苏南京玄武湖 20030617-20030622
Rnj4201; Rnj5201; Rnj5202 E. yangzii R. kamoji 江苏南京东郊 20040617-20050413
Rnj5701; Rnj5703 E. yangzii R. kamoji 江苏南京东郊 20050423-20050511
Rnj2101 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 江苏南京东郊 20020405
Rts2101; Rts2102 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 河北唐山 20020427
Rfz2101; Rfz2201 “Neotyphodium” sp. Roegneria sp. 福建福州 20020428-20020429
Rwh4501 “Neotyphodium” sp. Roegneria sp. 湖北武汉 20040511
Rxm4102 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 福建厦门 20040425
Rdy4202; Rdy4302 “Neotyphodium” sp. R. japonensis 山东东营 20040813
Ryz5201 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 江苏扬州 20050503
Rnj6607; Rnj6610; Rnj6611 “Neotyphodium” sp. Roegneria sp. 江苏南京南郊 20060415-20060510
Vol.27 No.6 855
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续表1
Rnj6105 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 江苏南京东郊 20060507
Rxy6101; Rxy6103; Rxy6106;
Rxy6107
“Neotyphodium” sp. R. ciliaris 山西孝义 20060725
Rsh6103; Rsh6107 “Neotyphodium” sp. R. kamoji 上海植物园 20060416
Rgd6120; Rgd6122 “Neotyphodium” sp. Roegneria sp. 安徽宣城 20060707
Rhs6883 “Neotyphodium” sp. Roegneria sp. 安徽黄山 20060709
注： “Neotyphodium” sp. 表示无子座鹅观草属植株的内生真菌菌株.
Note: “Neotyphodium” sp. denotes that the endophytes obtained from non-stromata producing Roegneria plants.

1.2 epichloë内生真菌的人工杂交试验
将鹅观草属植物上新抽出的未成熟白色子座进行套袋处理（图1-B），以防自然杂交及
不同菌株之间交叉污染。植株PRnj5201、PRnj5202、PRnj5701、PRnj5702、PRnj6102、R3
和R8移栽到室内，W1和W2留在原地。四月初，确认子座没有自然杂交后，将其作为stromatal
parent用于人工杂交。
将在PDA斜面25℃恒温培养14-21d的菌落用5mL无菌水浸泡3min，经剧烈振荡制成孢
子悬液（2-4×103个孢子/mL），将其作为spermatia parent用于人工杂交。用无菌棉签蘸取
少量孢子悬液，均匀涂抹于子座表面，或将子座间相互充分摩擦。杂交后的子座用纸袋重
新密封，定期观察子座性状变化并记录结果。将野外自然杂交的子座作为阳性对照，自然
杂交前进行套袋处理的子座作为阴性对照。
1.3 杂交结果的检测
1.3.1 子座的表面观察以及子囊壳、子囊和子囊孢子的发育：4-6周后观察子座的颜色及表
面结构的变化。观察人工杂交的子座是否变黄、增生，是否产生黑点，以及这些变化在子
座上的分布。
将变黄、增生、布满黑点的子座做徒手切片或石蜡切片（Li et al. 2006）。10×物镜下
观察是否有子囊壳、子囊和子囊孢子的发育。
1.3.2 子囊孢子弹射和萌发试验：将观察到产生子囊孢子的子座做孢子萌发试验。用灭菌
后的吸水纸、蒸馏水和培养皿制成湿室，在无菌载玻片上制作2%的水琼脂薄层（厚度约
1mm）后置于无菌湿室。取杂交后变黄的子座横切小段约5mm垂直放在水琼脂中央，于25℃
恒温培养。在16h内每隔2h在20×物镜下镜检，观察子囊孢子的弹射，16h后每12h镜检一次。
以72h内子囊孢子的弹射以及萌发的有无决定两个菌株杂交的成功与否。如果观察到
子囊孢子，并且子囊孢子萌发后产生无性结构（分生孢子梗和分生孢子），说明这两株内
生真菌杂交亲和，分属不同的交配型。
1.4 内生真菌tubB片段的扩增、克隆、测序和数据分析
提取8株内生真菌（表2）的总DNA（Li et al. 2006），以tubB通用引物tub2-exon4u和
tub2-exon1d（Gentile et al. 2005）进行PCR扩增。扩增反应在MyGeneTM Series Peltier thermal
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cycler（杭州朗基）中进行。PCR产物电泳后切胶回收，和载体pMD19-T连接后，转化到
预制的E. coli DH5α感受态细胞中，PCR检测，将检测含有目的基因片段的E. coli DH5α菌
液委托上海英骏生物技术有限公司进行测序。
将所得序列在GenBank中进行Blast比对。从已鉴定到种的Epichloë属的代表菌株中共
选取30条tubB序列（表2）。利用ClustalX 1.81（Thompson et al. 1994）软件进行多重比对，
利用MEGA3.1（Kumar et al. 2004），采用最大简约法构建系统发育树。

表2 进行tubB序列分析的Epichloë属和Neotyphodium属真菌菌株及其GenBank序列号
Table 2 Endophyte isolates and GenBank accession numbers for their tubB sequences
真菌种 菌株 宿主植物种 宿主植物族 采集地* GenBank
Species Isolate Host Species Host Tribe Geographic origin Accession number
Epichloë amarillans 906 Agrostis perennans Aveneae USA AF457467
E. amarillans ATCC200743 Sphenopholis obtusata Aveneae USA L06958
E. baconii ATCC90167 Agrostis tenuis Aveneae Switzerland L78279
E. baconii ATCC76552 A. stolonifera Aveneae Britain L06961
E. baconii ATCC200745 Calamagrostis villosa Aveneae Switzerland L78270
E. brachyelytri ATCC201561 Brachyelytrum erectum Brachypodieae USA AF062427
E. brachyelytri ATCC201560 B. erectum Brachypodieae USA AF250736
E. bromicola 9630 Bromus erectus Bromeae Switzerland AY033382
E. bromicola 9631 Br. erectus Bromeae Switzerland AY033383
E. clarkii ATCC200741 Holcus lanatus Poeae Switzerland AF250738
E. clarkii ATCC200742 H. lanatus Poeae Switzerland L78281
E. elymi ATCC201553 Elymus virginicus Triticeae USA AF062428
E. elymi 4132 El. hystrix Triticeae USA AF457468
E. festucae ATCC90660
Festucae rubra subsp.
commutata
Poeae Europe AF250746
E. festucae E434 Lolium gigantea Poeae Switzerland L78286
E. glyceriae ATCC200747 Glyceria striata Meliceae USA L78275
E. glyceriae ATCC200755 G. striata Meliceae USA L78276
E. sylvatica ATCC200748 Brachypodium sylvaticum Brachypodieae Japan L78278
E. sylvatica ATCC200751 Bra. sylvaticum Brachypodieae Switzerland L78291
E. typhina ATCC200738 Anthoxanthum odoratum Aveneae Switzerland L78288
E. typhina ATCC200740 Dactylis glomerata Poeae Switzerland L78274
E. typhina ATCC200851 Phleum pratense Aveneae Switzerland L78280
E. typhina ATCC201666 Poa silvicola Poeae Switzerland L78285
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续表2
E. typhina E432 Lolium perenne Poeae France AF250752
E. typhina ATCC201667 Poa nemoralis Poeae Switzerland AF062429
E. typhina ATCC200739 Bra pinnatum Brachypodieae Switzerland L78292
E. typhina ATCC201669 Poa pratense Poeae Switzerland L78284
E. yangzii Rnj3302 Roegneria kamoji Triticeae China DQ134036
E. yangzii Rnj3304 R. kamoji Triticeae China DQ134038
E. yangzii Rnj4201 R. kamoji Triticeae China DQ134039
“Neotyphodium” Ryz5201 R. kamoji Triticeae China EU500924
“Neotyphodium” Rhs6883 Roegneria sp. Triticeae China EU500925
“Neotyphodium” Rnj6610 Roegneria sp. Triticeae China EU500926
“Neotyphodium” Rnj6611 Roegneria sp. Triticeae China EU500927
“Neotyphodium” Rxy6106 R. ciliaris Triticeae China EU409305
“Neotyphodium” Rxy6107 R. ciliaris Triticeae China EU409306
“Neotyphodium” Rts2102 R. kamoji Triticeae China EU409307
“Neotyphodium” Rdy4202 R. japonensis Triticeae China EU409311
*采集地为中国的菌株全部是本研究的供试菌株，其它菌株的序列是从GenBank中下载.
*All isolates from China were tested isolates in this study, DNA data of all isolates from overseas were downloaded from GenBank.
2 结果与分析
2.1 Epichloë yangzii菌株之间的交配
人工杂交4-6周后观察，阳性对照E. yangzii的子座先出现白色的小圆斑，进而蔓延为成
片的淡黄色的痂状突起，中央黑点，粗糙、蜂窝状，并逐渐覆盖整个子座，最后子座增生
并变为黄色或橙色（图1-C）。子座的石蜡切片结果表明有子囊壳产生（图2）；子囊孢子弹
射试验显示，子座中有子囊孢子弹射出并萌发产生分生孢子梗和分生孢子。阴性对照的E.
yangzii的子座几乎没有变化，仍然为白色，表面光滑，没有增生（图1-F）。
不同交配型的E. yangzii菌株杂交亲和，其杂交子座的变化和阳性对照子座变化基本一
致，如stromatal parent Rnj5701 × spermatia parent Rnj3302等。徒手切片的结果表明杂交子
座上有子囊壳和子囊产生，子囊孢子弹射试验显示，子座中有子囊孢子弹射出并萌发产生
分生孢子梗和分生孢子。
相同交配型的E. yangzii菌株杂交的子座杂交不亲和，杂交子座没有变化，与阴性对照
没有区别，如stromatal parent Rnj5201 × spermatia parent Rnj3304等，对徒手切片镜检后没
有发现子囊壳形成。
标准菌株Rnj5701（mat-1）和Rnj5201（mat-2）与7株E. yangzii的杂交结果表明：菌株
Rnj5202和Rnj5703的交配型为mat-1；菌株Rnj3302、Rnj3303、Rnj3304、Rnj4201和Rnj4301
的交配型为mat-2。
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图1 感染E. yangzii的鹅观草植株上的子座、杂交处理的子座及人工杂交后产生的子囊 A: 感染E. yangzii
的鹅观草植株上的子座；B：杂交后套袋处理的子座；C：自然杂交后的成熟子座（阳性对照）；D：子座W1（上部 未杂交，
下部 × Rhs6883）；E：子座W1（上部 × Rnj6610，下部 × Rnj6611）；F：套袋处理的未杂交的子座（阴性对照）；G：人工杂
交后子座产生的子囊（W1 × Rhs6883）（标尺= 40µm）.
Fig. 1 Stroma developed on Roegneria plant infected by Epichloë yangzii, and stromata and asci resulted from mating tests. A:
E. yangzii developed stroma on the culm of Roegneria plant; B: A stroma was covered with paper bag after hybridization; C:
Mature stroma in nature (positive control); D: Stroma of W1 (upper part, not tested; lower part × Rhs6883); E: Stroma of W1
(upper part × Rnj6610, lower part × Rnj6611); F: Stroma in nature covered with paper bag (negative control); G: Asci resulted
from mating test (W1 × Rhs6883) (Bar = 40µm).


图2 鹅观草植株上自然杂交后的成熟真菌子座的切片 A：子座（标尺= 250µm）；B：子囊壳（标尺= 100µm）；
C：子囊壳中的子囊（标尺= 25µm）.
Fig. 2 Cross sections of stroma on Roegneria kamoji. A: Stroma (Bar = 250µm); B: Perithecia (Bar =100µm); C: Asci in a
perithecium (Bar = 25µm).
2.2 Epichloë yangzii和“Neotyphodium 属”真菌的杂交
将E. yangzii与来自无子座鹅观草属植物的23个“Neotyphodium属”真菌菌株（表1）进
行了66个组合的杂交试验后发现，21株菌和E. yangzii（mat-1，mat-2）杂交不亲和，2株菌
（Rhs6883和Ryz5201）与E. yangzii（mat-1）杂交亲和（表3）。
在64个杂交不亲和组合中，52个组合的杂交子座没有任何变化，与阴性对照基本一致，
如W1 × Rnj6610，W1 × Rnj6611（图1-E，表3）等，其余12个组合的杂交子座变黄、增生、
有少量的子囊壳产生，子囊壳比成功杂交子座上的小，其中有些会产生较短的子囊但败育，
Vol.27 No.6 859
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如W1 × Rxy6107等。在2个杂交亲和组合中，子座变黄、增生并布满子囊壳，与阳性对照
基本一致（表3），并产生大量子囊（图1-G），弹射大量的子囊孢子并萌发（图3），如W1 ×
Rhs6883（图1-D）和W2 × Ryz5201。这2株菌与E. yangzii（mat-1）杂交亲和，说明它们可
能是有时不产子座的E. yangzii。

表3 鹅观草属植物“Neotyphodium属”真菌与Epichloë yangzii之间部分杂交结果
Table 3 Results of mating tests between “Neotyphodium sp.” and Epichloë yangzii
真菌孢子 子座 Stromatal parent 真菌孢子 子座 Stromatal parent
Spermatia parent W1 W2 R3 R8 Spermatia parent W1 W2 R3 R8
Rxy6106; Rxy6107 （+） （+） — Ryz5201 + — —
Rnj6607; Rwh4501;
Rfz2101
（+） — — Rhs6883 + — —
Rdy4202; Rsh6107 — （+） Rnj6105 （+） — （+）
Rdy4302; Rnj2101;
Rsh6103
— — Rts2102 （+） — — —
Rnj6610; Rnj6611;
Rxy6103; Rfz2201;
Rxy6101; Rxm4102;
Rgd6120; Rgd6122
— — — Rts2101 — — — —
交配型* Mating type mat-1 mat-1 mat-2 mat-2 交配型* Mating type mat-1 mat-1 mat-2 mat-2
阴性对照
Negative control
NR NR NR NR
阴性对照
Negative control
NR NR NR NR
注：*根据交配群为MP-VI的国外标准菌株确定. W1和W2表示室内植株W1和W2上产生的子座；R3和R8表示野外植株R3和R8
上产生的子座；+ = 生成可育的子囊孢子；（+）= 生成子囊壳但败育；— = 没有反应；空白 = 未做.
Note: *Tested by the isolates belonging to MP-VI. W1 and W2, stromata produced by the plant W1 and W2 in laboratory; R3
and R8, stromata produced by the plant R3 and R8 in field; + = viable ascospores produced; (+) = perithecia barren; — = no
reaction; blank = no tested.


图3 W2与Ryz5201杂交后形成的子囊壳中弹射出的子囊孢子在水琼脂上的萌发（标尺=20μm）
Fig. 3 Ascospores ejected in chains and germinated on water agar from perithecia of W2 × Ryz5201 (Bar = 20µm).
2.3 系统发育学分析
用于系统发育分析的38个菌株（表2）的tubB基因序列片段约590bp。在最大简约树中，
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除ETC（Epichloë typhina complex）外，基本上每一个种都形成一个独立的分枝，而且自
展支持率（bootstrap value）较高，同一个种内的菌株绝大多数来自相同属的宿主植物（图
4），与前人（Moon et al. 2004；Li et al. 2006）研究较为一致。根据tubB基因序列构建的
邻接树和最大简约树的拓扑结构相似（数据未显示）。从我国的鹅观草Roegneria kamoji
中分离的菌株E. yangzii形成一个单独的分枝，自展值为88。和E. yangzii杂交亲和的菌株
（Rhs6883和Ryz5201）均与E. yangzii聚为一枝，和其余的分离菌株明显不同，说明这两个
菌株并不是Neotyphodium属真菌，而是有时不产子座的E. yangzii。

图4 基于tubB基因序列构建的最大简约系统发育树 步长＝95；一致性指数 = 0.853；总留存指数＝ 0.956；总
尺度化一致性指数＝0.815；bootstrap值>70%，1000次重复（正方形：ETC；圆形：与E. yangzii杂交亲和的“Neotyphodium属”
真菌菌株；三角形：与Epichloë yangzii杂交不亲和的Neotyphodium属真菌菌株）.
Fig. 4 The tubB phylogram based on maximum parsimony (MP). Tree length = 95; Consistency index = 0.853; Retention index
=0.956; Rescaled consistency index =0.815; Bootstrap values>70%; 1000 replicates. (Square: ETC; Circle: “Neotyphodium” isolate
campatible with Epichloë yangzii; Triangle: Neotyphodium isolate imcompatible with E. yangzii).
3 讨论
Epichloë属真菌的11个种中只有1个亚洲种（E. yangzii），因此人工杂交集中在国外，
Vol.27 No.6 861
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
国内研究很少（Li et al. 2006；Schardl & Leuchtmann 1999；Leuchtmann & Schardl 1998）。
我们利用人工杂交的方法，系统研究了E. yangzii的交配特征，明确了供试菌株的交配型。
然后将23株暂定为“Neotyphodium属”真菌的菌株和不同交配型的E. yangzii杂交，结果发
现2株菌与E. yangzii杂交亲和（图1-D，表3），与E. yangzii杂交亲和的2株菌被鉴定为E.
yangzii。在基于tubB基因序列构建的系统发育树中这2株菌和E. yangzii聚类（图4）。这进一
步证实了与E. yangzii杂交亲和的2株菌为E. yangzii，即“Neotyphodium属”真菌中部分菌株
是有时不产子座的E. yangzii。因此，这种人工杂交技术不仅在微生物遗传研究方面有科学
意义，对微生物分类也有一定的应用价值。
在鹅观草属植物上发现两种类型的内生真菌：一种产生子座的E. yangzii；另一种不产
生子座，和E. yangzii有明显区别的Neotyphodium属真菌（王志伟等 2005；Kang et al. 审稿
中）。在基于tubB基因序列构建的系统发育树中，与E. yangzii杂交不亲和的6株菌，形成独
立一枝（图4），进一步说明“Neotyphodium属”真菌中混有Neotyphodium属真菌和有时不
产子座E. yangzii。Leuchtmann和Schardl报道，E. bromicola的在其宿主植物B. ramosus和B.
benekenii上不产生子座（Leuchtmann & Schardl 1998）。因此，仅仅根据是否产生子座来区
分Epichloё属真菌和Neotyphodium属真菌是不充分的，人工杂交是区分Neotyphodium属真菌
和有时不产子座的E. yangzii的有效手段之一。
国外的研究显示，在自然界中Epichloë属之间的交配必须通过飞蝇作为媒介，这些飞
蝇帮助真菌完成交配（Bultman et al. 1995；Bultman & Leuchtmann 2003）。我们在南京发
现了多个感染E. yangzii后产生子座的鹅观草群落，却没有发现类似的Botanophila属飞蝇的
存在。因此，E. yangzii在鹅观草属植物上的自然杂交的传播媒介可能和欧洲有所不同。今
后我们将继续在这方面进行深入的研究。
影响人工杂交的因素较多，试验难度大，结果也往往不稳定，易出现假阳性或假阴性
（表3）。我们通过三年的试验发现，E. yangzii在鹅观草属植物上的人工杂交需注意交配时
间的选择、注意防止昆虫媒介等导致的假阳性结果的出现以及野外不可预测的多种不稳定
因素。此外关于人工杂交某些现象目前无统一的解释。如无子座鹅观草属植物的
Neotyphodium sp.与E. yangzii菌株杂交，部分杂交子座变黄、增生并产生极少量的败育的子
囊壳（W1 × Rts2102）。原因可能是这些Neotyphodium属真菌中存在一些差别，或是自然微
环境的差别造成的，也可能是人工操作刺激子座的发育，这些都是不可预测的不稳定因素。
时间的选择以及多种不稳定因素决定了在植物活体上进行的人工杂交的结果往往不
稳定。这种不稳定性同时也使人工杂交的结果在Epichloё属真菌分类上作为证据力度不可
避免地受到影响（Schardl 私人通讯）。但只要事先作好充分的准备，并在研究的过程中设
置充分的重复，人工杂交还是检验epichloё内生真菌是否具有有性生殖能力的有效手段。

致谢：感谢美国Christopher L. Schardl教授和瑞士Adrian L. Leuchtmann教授对本研究进行的杂交方
法的指导。

862 Mycosystema
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