全 文 ：养禽与禽病防治 !! 年第 期
四川草科鸡
IL-15cDNA的克隆与序列分析
黄 勇 刘蕊娜 邹年莉 王红宁 柳 萍
! 四川农业大学动物预防医学生物工程实验室 四川雅安 625014
摘 要:根据 #$%&’%( 上登录的鸡 )*+, 基因序
列#设计合成了一对特异性引物#以 -.%/ 诱导的鸡
脾淋巴细胞提取的总 01/ 为模板进行 02+3-0 技
术扩增#并克隆到 456,!+2 载体测序$ 测序结果表
明#四川草科鸡 )*+, 开放阅读框! 708由 9: 个核
苷酸组成#编码 ,!; 个氨基酸#与 #$%&’%( 中公布的
-<)*+, 基因进行比较# 核苷酸和氨基酸同源性为
=!>9?#==>?$ 生物信息学分析表明#该基因编码的
蛋白具有亲水性#有很强的抗原性#共有 @ 个潜在的
1+糖基化位点# 可能存在 @ 个蛋白激酶 - 磷酸化位
点A存在 B 个酪蛋白激酶!磷酸化位点$
关键词%四川草科鸡 白细胞介素+, 基因克
隆 序列分析
白介素 ,C)%D$EF$G(H% ,#)*+,I是 #E’JKD$H% 等 L,M
于 ,==: 年发现的一种结合人 )*+B 受体 &# 亚基的
免疫因子#由成纤维细胞&上皮细胞&单核细胞和肌
细胞产生$ 它具有与 )*+B 相似的生物学活性#人 )*+
, 不仅能够维持 )*+B 依赖的 2 细胞株 -2**+ B 的
生长#对 2 淋巴细胞有激活和促生长作用 LBM#还可以
诱导 & 细胞增殖反应 L@M’并且诱导外周血单个核细胞
的活性# 同时也是 1N 细胞成熟过程中重要的因子#
在免疫系统中起着重要的作用$ )*+, 有可能在肿瘤
的免疫治疗&类风湿性关节炎治疗中发挥作用 L:M$ 尽
管 )*+, 和 )*+B 具有生物学的相似性# 但它们也存
在差别#如基因和氨基酸同源性很低$ )*+, 已成为
目前研究热点之一#多种哺乳动物 LO9M的 )*+, 被成功
克隆$ 但鸡 )*+, 研究较晚# BPP, 年*HFF$<.Q 等L;M首次
和 /GJGE% 大学兽医学院的研究人
员将禽呼肠孤毒株 R,,@@ 的单克
隆抗体用于间接免疫过氧化物酶
试验#检测感染鸡组织和鸡胚成纤
维细胞培养物中的呼肠孤病毒$该
方法简便&快速&经济#可在确诊时
作为病理组织学的一个重要辅助
试验$
随着分子生物学技术在禽病
上的广泛应用#02+3-0&地高辛标
记 S61/ 探针技术&放射性标记的
S61/ 探针技术等也逐渐应用到
疾病检测上来$
6 PCR方法
半套式 3-0% 所谓半套式
3-0 就是利用内外两对引物先后
进行两次 3-0 扩增# 以从微量的
模板中获得高浓度和高纯度的目
的片段$ 它比常规 3-0 更加敏感
和特异#已被用于多种畜禽病毒的
检测#特别是早期诊断$
多重 3-0% 多重 3-0 可以在
一次试验中检测出不同的病原$因
此具有高效&省时&特异&敏感等特
点#并已经运用至养禽业$ NEHKD$%
5 等建立了一种多重 3-0 方法 #
可以从肛门棉拭子中同时检测禽
腺病毒&禽呼肠孤病毒&传染性法
氏囊病病毒和鸡传染性贫血病毒#
而普通的 3-0 则检测不到如此微
量的病毒$
实时 *- 02+3-0%#G’% 5> N$
等建立的实时 *- 02+3-0 方法能
将 01/ 模板扩大到 @= 倍#所以具
有很高的敏感性# 比普通 3-0 的
检出率高# 并且结果特异性高#工
作时间短#污染机会少$
7 地高辛核酸探针技术
地高辛核酸探针技术和 02+
3-0 技术都适合于感染早期诊断$
谢芝勋等研制出禽呼肠孤病毒地
高辛核酸探针#并建立了地高辛核
酸探针检测禽呼肠孤病毒的方法#
该核酸探针最低能检测出 P>:%T
的禽呼肠孤病毒 01/$ 用所建立
的地高辛核酸探针方法对禽呼肠
孤病毒人工感染鸡采集的各种样
品进行检测#并和传统病原分离方
法比较#结果地高辛核酸探针检出
率为 ;:>B$! ,;!UB:P #病原分离鉴
定方法检出率为 $! ,@BUB:P $
特别是核酸探针在感染 B:< 后就
能检测到病料中的病毒核酸#相比
之下# 传统的病毒分离培养需要
B%@ 天后才能分离到病毒#因此核
酸探针方法具有及时的优点$
禽呼肠孤病毒的检测方法很
多#它们优缺点各异#且敏感性和
特异性也不同$随着禽类呼肠孤病
毒研究的日益深入及生物学技术
的发展#传统的检测技术将和现代
生物学技术紧密结合# 为早期&及
时&高效的呼肠孤病毒检测提供一
个更好的平台$
责任编辑%曹伟胜
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
V
O
中图分类号%S831文献标识码%A 文章编号%1008-3847! 200805-0006-04
!
养禽与禽病防治 !! 年第 期
从 #$%& 活化的 ’ 淋巴细胞中获得了鸡的 ()*+,-#
.&! 本文根据 /0%12%3 上的 #4()*+,-.& 序列设
计引物 采用 5’*6#5 方法克隆四川草科鸡 ()*+
基因旨在为进一步研究四川地方优良土鸡品种 ()*
+ 基因的遗传多态性#表达#分子佐剂奠定基础!
1 材料和方法
+7+ 材料
+7+7+ 实验动物
89 日龄健康四川草科鸡 购自四川省石棉县畜
牧食品局!
+7+7: 引物
根据已发表的鸡 ()*+,-.& 序列利用 6;<=0;
79 设计引物>上游引物 6+ 和下游引物 6:?引物序列
如 下 $6+$@ * ’&&#&&/&’/#’////&’/ *8@ 6:A
@* #’’/#/’&’’’’&/’’&/#/’ *8@ !
+7+78 载体与宿主菌
质粒载体 BC-+!*’ 购自 ’2D252 公司%-E! 由
本实验室保存!
+7+7F 工具酶与主要试剂
’;试剂购自 ’(&./M. 公司 %&CN 反转录酶 #5.2J<%#
#$%8C(+OF9#P*Q2H#(6’/#&=B#-.& C2;30;>-)*
:999R购自 ’2D252 公司%柱离心式琼脂糖凝胶回收
试剂盒为 S=0Q2 公司产品!
+7: 方法
+7:7+ 鸡脾淋巴细胞的分离#培养
无菌操作取 89 日龄鸡脾脏 在铜网上捣碎过
滤 细胞悬液加到淋巴细胞分层液上: 999;T=<% 室
温离心 :9=<% 去上清%取中间层的淋巴细胞用 61U
液洗 8 次 去上清 沉淀用含 979==$HT) *巯基乙
醇#+9#QT=) #$%&#+9V小牛血清#+OF9 培养液悬浮
取 +9#) 计数调整细胞浓度至 +$H9WT=)V#S:培
养箱 F+%培养 :F4!
+7:7: 5.& 的提取
参照 ’;+7:78 5’*6#5 体外扩增
取 X#) 总 5.&用 H#) SH加入 +9=C Z.’6 :#)#$&CN [\]]0; F#)#+== CQ#
#H: 8#)#&CN 97#)#5.& 酶抑制剂 97#)置于 89%
+9=<%F:% H4XF% =<%冰浴冷却备用! 6#5 反应
体系为$:$’2I 6#5 C2JK0;C下游引物各 :#)无菌 ZZE:S +X#)!反应条件为预热
X% =<%XF% +=<%:% +=<%W:% +=<% 共 89 个
循环W:%延伸 +9=<%! 6#5 产物用 +79V琼脂糖凝胶
电泳进行检测!
+7:7F 质粒的克隆与鉴定
将回收的 #4()*+ 基因与 BC-+!*’ 载体连接
转化大肠杆菌 -E! 感受态细胞 涂布于含 P*/2H#
(6’/ #&=B 的 )1 培养基上8W%培养过夜 挑选白
色菌落扩大培养提取质粒应用 6#5 进行进一步的
鉴定! 样品测序由 ’2D252 公司完成!
+7:7 生物信息学分析
采用 6;0Z<,K6;$K0<%#-.&JK2; 和 6;$K62;2= 等工
具对基因序列进行比较和分析!
2 结果与分析
:7+ #4()*+ 基因的扩增
对 #$%& 活化 :F4 的鸡脾淋巴细胞提取细胞总
5.& 再应用 5’*6#5 扩增得到了与预期片段大小
& !+[B’相符的目的片段Y见图 +?!
图1 ChIL-15基因的RT-PCR结果
M.DL-2000;1.RT-PCR产物
图2 ChIL-15基因核苷酸序列同源性分析
:7: #4()*+ 基因的克隆与序列分析
6#5 产物与质粒 BC-+!*’ 连接后以重组质粒
为模板用 6#5 技术鉴定阳性菌落! 序列测定结果
表明扩增出的 ,-.& 长度为 !+[B 包含了草科鸡
[B
!
养禽与禽病防治 !! 年第 期
#$%& 基因全部的开放阅读框 ’()*! 编码 &!+ 个氨
基酸残基! 与基因文库中公布的 ,-#$%& 基因的核
苷酸序列及氨基酸序列同源性均为 .!/’0#../0 见
图 1# $ 四川草科鸡 #$2& 基因编码氨基酸与 345$
6758 上 已 登 录 的 鸡 #$ 2& 基 因 序 列 9:&;<.+%
9:&1.1+%=>1<(+& 推导的氨基酸序列有 1 个氨基
酸的差异!与 9?<<(+’ 有 ’ 个氨基酸的差异!氨基
酸变异位点为第 (&%&11%&;;%&;’%&; 和 &!; 位氨
基酸 @见图 ;A$ 此序列已被 3456758 收录! 收录号
BC<;(<;<$
1D; 生物信息学分析
1D;D& 糖基化位点分析
通过网上 EF4GHIJEFKJ4H5 预测分析!#$L& 氨基酸
序列在 (! 位 =MN3%&(. 位 =ONN%&’’ 位 =:NB 存在
=L糖基化位点 @=LPQRIKSRQ7JHK5 SHJ4A! 在 1< 位 OTM%
&1+ 位 OUM%&1 位 N9M 有蛋白激酶 , 磷酸化位点
@*FKJ4H5 8H57S4 , *-KS*-KFRQ7JHK5 SHJ4AV 在 !; 位 NOBW
和 .’ 位 N?BW 存在酪蛋白激酶!磷酸化位点@I7S4H5
8H57S4!*-KS*-KFRQ7JHK5 SHJ4A$
1/;/1 亲水性%抗原表位的预测
用 4X*7SR 中的工具 EFKJE7F7Y 分析 ,-#$L& 蛋
白分子!#$L& 蛋白分子量为 11 <&!/( W7QJK5SV理论等
电点 *# 为 !/!$ 根据蛋白质的 3U9Z? 值@3F75G 7[$
4F7P4 K\ -RGFK*7J-HIHJRA预测其疏水性!3U9Z? 值的范
围在 1 与$1 之间!正值表明此蛋白为疏水性蛋白!负
值表明为亲水性蛋白$ 从 EFKJE7F7Y 工具统计的结果
可知!,-#$L& 的 3U9Z? 值为L白$ 用 W=9SJ7F 预测氨基酸抗原决定簇& 图 (# !结果
表明 ,-#$L& 氨基酸具有很强的抗原性$
1/;/; 蛋白质二级结构的预测
用 E]W 程序对蛋白进行预测! 结果显示 ,-#$L
& 蛋白分子中至少含有 ’ 个 L螺旋% 个 #L折叠%
;& 个 QKK* 结构 ! 其中 L螺旋区占整个多肽链
& 图 # $
3 讨论
本试验克隆的四川草科鸡 #$L&IW=9 的长度为
!&)*! 包含了鸡 #$L& 基因全部的开放阅读框
’()*!编码 &!+ 个氨基酸残基!信号肽由 ’’ 个氨基
酸残基组成! 分子量为 11/<&! MW$ 该基因与 345’
6758 上的其他鸡 #$L& 基因序列的核苷酸同源性与
氨基酸序列的同源性均较高V均为 .!/’^(../^$ 该
序列与 9:&;<.+%9:&1.1+%=>_1<(+& 亲缘性较
近$ 与 OJ4*75H78 报道的核苷酸序列 & 9?<<(+’#比
图3ChIL-15氨基酸多序列比较& 框线部分为变异的氨基酸#
图4ChIL-15编码的蛋白质抗原决定簇预测
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养禽与禽病防治 !! 年第 期
较!有 ! 个碱基的差异!其中有两个碱基的差异没有
导致氨基酸的差异碱基的差异对于鸡 #$%& 蛋白的
表达及其生物活性究竟有无影响! 还需要进一步的
研究
应用生物信息学技术和分子生物学软件对
’(#$%& 蛋白质的二级结构进行预测和分析!结果表
明!该蛋白为一中等分子量的碱性蛋白!蛋白质分子
中)物质的量*百分比最高浓度依次为 $+, -&./012# $
$34-5/&2%和 674-!/82* 9 种氨基酸 !不含 :;;$<,=$
67= 9 种氨基酸该蛋白具有亲水性!有 > 个抗原决定
簇!有 1 个保守的半胱氨酸!可形成 0 对二硫键 ?>@!!%
螺旋较多!%折叠相对较少! 碱基突变位点主要在
!%螺旋和 %折叠区 这一结果为进一步对 ’(#$%&
基因的分子生物学研究提供了重要参考 糖基化是
真核生物翻译后重要的修饰之一! 它可以影响蛋白
的抗原决定簇$蛋白质的电荷性质以及酶学性质!特
别是蛋白的热稳定性 潜在糖基化位点的预测可为
进一步研究 ’(#$%& 蛋白的表达提供参考
某些细胞因子 AB< 已被初步证实能够显著增
强病毒和细菌以及寄生虫抗原基因的免疫应答 ?!%&.@!
细胞因子作为高效免疫增强剂的研究已成为免疫佐
剂研究的一个新方向 草科鸡是四川优良的地方土
鸡品种C具有耐粗饲$抗病性强$生长快$肉香美的特
点由于 #$%& 与 #$%0 具有相似的生物学活性!在免
疫系统中同样起着重要的作用! 克隆和分析四川草
科鸡 #$%& 基因对新型禽用免疫增强剂和新型基因
工程疫苗的研究等具有重要的理论和应用价值
参考文献
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5 c;X K!^;F;H;E3 O;7 3SS3OF, QS O+FQPGH3 R3H3, GHf3OF3Z GHFQ ,P373F;7 L4,#
O73/]DGO B;7F &. I4,;P;E73 I #C :G4 I gC I;FQ( JC 3F ;&/ T(3 FGLGHR
QS 6b %’N_ 3=VD3,,GQH V7;,LGZ ;ZLGHG,FD;FGQH GHS74#
3HO3, F(3 T(7hT(0 D3,VQH,3 GHZ4O3Z E+ ;H J#Y%#%NV3#
OGSGO AB< [;OOGH3/ #LL4HQ7C 0...C &81 )8‘W9&.0$9&&&%
责任编辑&任涛
图5 ChIL-15二级结构预测’ 部分氨基酸序列%
1&部分氨基酸序列(2&PHD预测结果) H&!-螺旋(E&-折叠(空格&其他或 loop% (3&预测的可靠性分析
* 0#9代表可靠性的高低% (4&平均可靠性大于82$的预测结果* L&loop(+ %,&预测可靠性值 <5而不作预测
的符号%
!