全 文 ：真藓科植物 ISSR-PCR反应体系的优化及 ISSR指纹图谱的初步构建
汪琛颖1，赵建成2 (1．郑州师范学院生命科学系，河南郑州 450044;2．河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050016)
摘要 ［目的］试图通过 ISSR指纹图谱的构建，为真藓科(Bryacae)植物的种类鉴定提供分子分析数据。［方法］为获得标准试验程序，
首先利用正交试验设计的方法对真藓科植物的 ISSR-PCR反应的5因素(Mg2 +、dNTPs、引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶)4 水平进行试
验。［结果］最适扩增条件是:在 20 μl PCR反应体系中，5 ng模板 DNA，0． 2 μmol /L 引物，2． 25 mmol /L MgCl2，0． 6 U Taq DNA 聚合酶，
0． 4 mmol /L dNTPs;最适退火温度为 48 ～50 ℃。利用此结论使用 6条 ISSR引物对 14种真藓科及相关的提灯藓科(Mniaceae)植物分别
进行 PCR扩增，共扩增出 86 条带，多态性带为 86条，多态率达 100%。根据扩增结果进行 NJ聚类分析，得到的支序图呈星状。［结论］
ISSR指纹能够在种级分类水平提供适度的多态性，利用引物 UBC808、811以及 826构建的 ISSR指纹图谱能够区分所有供试植物，为利
用 ISSR指纹技术解决真藓科植物种级水平分类关系问题时提供了分子辅助证据的可行性。
关键词 真藓科;ISSR;反应体系优化;种级水平;分类关系
中图分类号 Q949 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)27 －16490 －04
Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Preliminary Construction of ISSR Fingerprinting of Some Species in Bryaceae
WANG Chen-ying et al (Department of Life Science，Zhengzhou Teachers College，Zhengzhou，Henan 450044)
Abstract ［Objective］The aim was to provide molecular basis for the identification of species in the moss family Bryaceae by the construc-
tion of inter simple sequence repeats (ISSR)fingerprinting． ［Method］ In order to seek standardizing PCR reaction set-up，orthogonal design
was used to optimize ISSR-PCR amplification system of Bryaceae in five factors (Mg2 +，dNTPs，primer，DNA template，Taq DNA polymer-
ase)at four levels respectively． ［Result］A suitable ISSR reaction system was obtained，namely:20 μl reaction system containing 5 ng DNA
template，0． 2 μmol /L primer，2． 25 mmol /L MgCl2，0． 6 U Taq DNA polymerase，0． 4 mmol /L dNTPs． Proper annealing temperature was 48
－ 50 ℃ ． The above system and six ISSR-PCR primers were used for the PCR amplification of 14 samples from Bryaceae and the related species
in Mniaceae． A total of 86 bands were amplified，of which 86 (100%)was polymorphic． NJ cluster analysis showed a stellate cladogram．
［Conclusion］The results manifested that ISSR fingerprinting could provide the appropriate degree of polymorphism at low taxonomic level，so
it would be a useful tool to provide additional evidence for resolving taxonomic relationships at the species level of Bryaceae．
Key words Bryaceae;ISSR;Optimization of reaction system;Species-level;Taxonomic relationship
基金项目 河北省自然科学基金资助项目(C2006000147) ;郑州市科技
计划资助项目(10PTGN449-6) ;河南省科技计划项目
(112300410018)。
作者简介 汪琛颖(1968 －) ，女，河南南阳人，副教授，博士，从事苔藓
植物分子系统发生及分类学研究，E-mail:okwcy@ yahoo．
com． cn。
收稿日期 2011-08-01
真藓科是藓类植物中一个较大的科。传统上，它的分类
系统主要建立在由可比较的形态学(如孢子体或配子体)特
征作为基础的假说或假设之上。但因不同的学者在真藓科
种的分类上依据的原始假设(假说)不同，所以在种的鉴定上
有许多混淆之处。此外，除非采集到(结构)完整的标本，否
则一些在分类上很关键的形态学特征在种级水平鉴定上也
不总能发挥作用，更不用说一些种的形态学特征还往往容易
受到其所生存环境因素的影响而可能出现的变化。所以，若
想对如此大的、存在分类困难的真藓科植物成功进行分类工
作是有相当难度的［1］。在这种情况下，便需要寻找更为精确
的技术，例如分子标记技术，以提供高度的多态性以及不同
的特征用以解决真藓科植物的分类问题。
Zietkiewicz等于 1994年阐明了简单序列重复区间扩增
多态性(简称 ISSR)方法［2］。ISSR使用锚定的简单序列重复
(简称 SSR)作为引物，扩增由两个相反的微卫星或 SSR界定
的一个 DNA片段，因为微卫星 DNA的进化速率比其他类型
的 DNA要高，ISSR标记应该比其他大多数类型的 DNA(包
括 RAPD)揭示多态性的可能性更大。同时，ISSR 方法因比
RAPD技术具有更长的引物序列和更高的退火温度，Qian
等［3］研究认为，ISSR 会产生更为可靠和可重复性更强的条
带。另外，ISSR方法无需事先知道 DNA序列的信息，还能产
生许多标记，操作简单且经济［4］。研究表明［5］，ISSR技术在
解决种级水平分类关系上是一个有效的工具。但是，ISSR方
法还未应用于真藓科植物的分类问题。
笔者使用 ISSR技术试图寻找 DNA 水平上的一些特征
能直接区分关系相近的种，以便提供进一步解决真藓科植物
种级水平分类关系的基本信息。
1 材料与方法
1． 1 分类抽样 依据《中国苔藓志》［6］相关内容，选择 14种
真藓科及相关科属植物作为试验材料。凭证标本信息见表
1，凭证标本保存于河北师范大学生命科学学院标本馆(HB-
NU)。
1． 2 DNA的提取 样品采集后装于纸制标本袋中，空气干
燥后贮存于 － 80 ℃冰箱中备用。剪取植株绿色部分放入
Eppendorf离心管中，向其中加少许 DNA提取缓冲液，利用电
钻研磨，使用植物基因组 DNA 提取试剂盒［天根生化科技
(北京)有限公司］及其配套方案分别制备各种类的 DNA样
品。提取 DNA 样品的质量和浓度采用 NanoDropTM 1000 超
微量紫外光 /可见光分光光度计(Thermo Scientific)检测，作
为 PCR扩增反应模板。
1． 3 PCR 反应的建立(预试验) 以真藓科银叶真藓的
DNA样品作为模板，参照 Hassel 等［4］的研究报道，建立起最
初的 ISSR-PCR反应体系、扩增程序及 ISSR扩增反应的引物
(表 2)。
20 μl 反应体系包括 2 μl 10 × Taq Plus buffer［200
mmol /L Tris-HCl(pH 8． 4) ，200 mmol /L KCl，100 mmol /L
(NH4)2SO4，15 mmol /L MgCl2 等］，10 ng DNA 模板，10 μl 10
μmol /L 引物，0． 6 μl 25 mmol /L Mg2 +，0． 12 μl 5 U /μl Taq
plus DNA 聚合酶［天根生化科技(北京)有限公司］，0． 4 μl
10 mmol /L dNTPs，补足水分至 20 μl。设置 1次重复，以不加
DNA样品的作为对照。反应在 5331 Mastercycler 梯度 PCR
责任编辑 郑丹丹 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(27):16490 － 16493
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.27.003
仪(Eppendorf，德国)上进行，反应条件是:94 ℃ 预变性 4
min;94 ℃变性 1 min，48 ～ 50 ℃(不同引物)退火 2 min，72
℃延伸 1 min，35 个循环;最后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃贮存备
用。扩增产物在含 Goldview(北京赛百盛基因技术有限公
司)核酸染料的 2%(W/V)的琼脂糖凝胶电泳中分离，电压
为 4． 3 V /cm。电泳结束后在 GeneGenius Super12 全自动凝
胶成像分析系统上观察并拍照记录。
表 1 凭证标本信息
Table 1 Voucher specimen information
科 Family 属 Genus 种 Species 标本凭证 Herbarium voucher
真藓科 银藓属 Anomobryum 芽孢银藓 Anomobryum gemmigerum Broth 云南泸水县老窝乡，20073730． L． B． Li
Bryaceae 短月藓属 Brachymenium 大孢短月藓 Brachymenium longicolle Thér． 云南泸水县老窝乡，20073687． L． B． Li
真藓属 Bryum 银叶真藓 Bryum argenteum Hedw． 河北平泉县马架子，20050031． J． C． Zhao
黄色真藓 Bryum pallescens Schleich． ex Schwaegr． 河北平泉县辽河源保护区龙母洞，20050088． D． Wang
大叶藓属 Rhodobryum 暖地大叶藓 Rhodobryum giganteum (Schwaegr．)Par． 四川全县喇叭河自然保护区，20070472． J． C． Zhao
平蒴藓属 Plagiobryum 平蒴藓 Plagiobryum zierii (Hedw．)Lindb． 河北隆化县茅荆坝，000514． W． Q． Li
丝瓜藓属 Pohlia 夭命丝瓜藓 Pohlia annotina (Hedw．)Lindb． 日本广岛绿化中心，J004． J． C． Zhao
丝瓜藓 Pohlia elongata Hedw． 四川全县喇叭河自然保护区，20070940． J． C． Zhao
小丝瓜藓 Pohlia crudoides (Sull． ＆ Lesq．)Broth． 新疆乌鲁木齐市南山小渠子林场，070809． J． C． Zhao
黄丝瓜藓 Pohlia nutans (Hedw．)Lindb． 日本广岛绿化中心，J013． J． C． Zhao
卵蒴丝瓜藓 Pohlia proligera (Kindb． ex Limpr．)Lindb． ex Arn． 日本广岛绿化中心，J008． J． C． Zhao
拟长蒴丝瓜藓 Pohlia longicollis (Hedw．)Lindb． 河南省嵩县白云山九龙瀑布，97067． Y． Z． Ye
提灯藓科 提灯藓属 Mnium 提灯藓 Mnium hornum Hedw． 湖南湘潭市韶山冲，20080015． J． C． Zhao
Mniaceae 匐灯藓属 Plagiomnium 匐灯藓 Plagiomnium cuspidatum (Hedw．)T． Kop． 河北平山县驼梁，20070925． C． Y． Wang
表 2 ISSR引物序列(来自 UBC)及其退火温度
Table 2 ISSR primer sequences(from the University of British Colum-
bia)used for Bryum argenteum and their primer specific an-
nealing temperatures
引物
Primer
引物序列(5-3)
Primer sequence(5-3)
退火温度
Annealing temperature∥℃
UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 50
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 50
UBC812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 50
UBC818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 50
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 48
UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 48
1． 4 ISSR-PCR反应体系的优化 为最终获到界限分明、
背景清晰、可重复性好、亮度适宜的扩增条带，选用其中一条
引物 UBC808进一步优化 PCR反应体系。PCR退火温度、底
物浓度等因素会影响一个特定引物的 PCR 扩增片段的数目
和长度，因此采用正交试验设计在 5 因素(Mg2 +、dNTPs、引
物、DNA模板、Taq DNA聚合酶)4水平上(表3)优化 PCR扩
增体系。PCR反应条件同“1． 3”，退火温度为 50 ℃。正交试
表 3 L16(4
5)正交试验设计产生的 ISSR反应体系
Table 3 ISSR reaction system produced by means of orthogonal experi-
mental design method L16(4
5)
编号
No．
Mg2 +
mmol /L
dNTPs
mmol /L
引物
Primer
μmol /L
模板 DNA
DNA Template
ng /20 μl
Taq DNA 聚合酶
Taq DNA
polymerase∥U/20 μl
1 1． 75 0． 1 0． 1 5 0． 4
2 2． 00 0． 2 0． 2 10 0． 4
3 2． 25 0． 3 0． 3 15 0． 4
4 2． 50 0． 4 0． 4 20 0． 4
5 1． 75 0． 2 0． 4 15 0． 6
6 2． 00 0． 1 0． 3 20 0． 6
7 2． 25 0． 4 0． 2 5 0． 6
8 2． 50 0． 3 0． 1 10 0． 6
9 1． 75 0． 3 0． 2 20 0． 8
10 2． 00 0． 4 0． 1 15 0． 8
11 2． 25 0． 1 0． 4 10 0． 8
12 2． 50 0． 2 0． 3 5 0． 8
13 1． 75 0． 4 0． 3 10 1． 0
14 2． 00 0． 3 0． 4 5 1． 0
15 2． 25 0． 2 0． 1 20 1． 0
16 2． 50 0． 1 0． 2 15 1． 0
验总组合数为 16。每 PCR 反应管中另加 2 μl 10 × Taq Plus
缓冲液及相应反应物和 DNA模板，补足水分至 20 μl。并设
计重复试验。
1． 5 藓类植物样品 ISSR多态性 使用筛选出的 6个 ISSR-
PCR 引物以及优化的标准 ISSR 反应体系，对来自于真藓科
和提灯藓科的 14 种样品分别进行扩增。每个样品的 ISSR-
PCR扩增条带按有、无记录，有带的记为 1，无带的记为 0。仅
记录可重复和可靠的条带，得到原始数据矩阵。使用 PAUP
Version 4． 0b10［7］软件的邻接法(NJ)进行聚类分析。
2 结果与分析
2． 1 适当引物的筛选 Hassel等［4］提及的 6 条引物在试验
中均能产生条带，但条带的强度和可分辨性对于条带的记录
不理想(图 1) ，表明 PCR反应体系需进一步优化。
注:M．标准分子量参照物(λDNA + BamHⅠ+ HindⅢ) ;2 － 3．引物
UBC808;4 －5． 引物 UBC811;6 － 7． 引物 UBC812;8 － 9． 引物
UBC818;10 －11．引物 UBC825;12．引物 UBC826。
Note:M:Marker (λDNA + BamHⅠ+ Hind Ⅲ) ;2 － 3:Primer
UBC808;4 －5:Primer UBC811;6 － 7:Primer UBC812;8 －
9:Primer UBC818;10 － 11:Primer UBC825;12:Primer
UBC826．
图 1 不同 ISSR引物的扩增
Fig． 1 Amplification results using different primers
2． 2 ISSR-PCR 反应体系的优化 为最终获得界限分明、
背景清晰、亮度适宜、可重复性好的扩增条带，在分析最初
PCR反应结果的基础上，使用引物 UBC808 以及银叶真藓的
DNA样品作为扩增模板进一步对 PCR 反应体系进行优化。
由图 2可知，除了组合 1、6、8、9、10、11、15 和 16外，剩余的组
合均产生条带。其中产生条带最为清晰的是组合 7，产生的
1946139 卷 27 期 汪琛颖等 真藓科植物 ISSR-PCR反应体系的优化及 ISSR指纹图谱的初步构建
条带数为 10条。即最适 PCR反应体系为:20 μl 反应体系包
括 5 ng DNA 模板，0． 2 μmol /L 引物，2． 25 mmol /L Mg2 +，0． 6
U Taq DNA 聚合酶，0． 4 mmol /L dNTPs。
注:M．标准分子量参照物(λDNA + BamHⅠ+ HindⅢ) ;(a)1 －2、3 －4、5 －6、7 － 8、9 － 10、11 － 12、13 － 15 分别对应表 3 中的组合 1、2、3、4、5、6、
7，16为对照组;(b)1 －2、3 －4、5 －6、7 －8、9 －10分别对应表 3中的组合 6、8、9、10、11，11 为对照组;(c)1 － 2、3 － 4、5 － 6、7 － 8、9 － 10 分别
对应表 3中的组合 12、13、14、15、16，11为对照组。
Note:M:Marker(λDNA + BamHⅠ+ HindⅢ) ;(a)． 1 －2，3 －4，5 －6，7 －8，9 －10，11 －12，13 －15 refer respectively to treatments 1，2，3，4，5，
6 and 7 in Table 3，lane 16 is negative control; (b)． 1 －2，3 －4，5 －6，7 －8，9 －10 refer respectively to treatments 6，8，9，10 and 11 in Table
3，lane 11 is negative control; (c)． 1 －2，3 －4，5 －6，7 －8，9 －10 refer respectively to treatments 12，13，11，14，15 and 16 in Table 3，lane
11 is negative control．
图 2 ISSR-PCR正交试验设计电泳结果
Fig． 2 Electrophoresis of ISSR-PCR orthogonal design
2． 3 ISSR多态性 为确保 ISSR 的可重复性，根据优化建
立的 PCR反应体系，使用 6个 ISSR引物对 14个样品逐一进
行 PCR扩增(图3)。6条引物共扩增出86 条带，长度大小范
围为 200 ～2 000 bp，每条引物平均产生 14． 3条带，多态性带
为 86条，多态率达 100%。结果表明，ISSR指纹能够在种级
分类水平提供适度的多态性，利用引物UBC808、811以及
注:1 －14分别代表样品芽孢银藓、大孢短月藓、暖地大叶藓、平蒴藓、丝瓜藓、匐灯藓、黄色真藓、黄丝瓜藓、夭命丝瓜藓、银叶真藓、卵蒴丝瓜藓、
提灯藓、小丝瓜藓、拟长蒴丝瓜藓;15 －16．对照;M． 100 bp标准分子量参照物。
Note:Lanes 1 －14 represent samples Anomobryum gemmigerum，Brachymenium longicolle，Rhodobryum giganteum，Plagiobryum zierii，Pohlia elongata，
Plagiomnium cuspidatum，Bryum pallescens，Pohlia nutans，Pohlia annotina，Bryum argenteum，Pohlia proligera，Mnium hornum，Pohlia crudoides，
Pohlia longicollis;Lanes 15 －16:Negative control;M:Marker (100 bp DNA ladder)．
图 3 ISSR扩增产物电泳结果
Fig． 3 Electrophoresis map of ISSR amplification products
29461 安徽农业科学 2011年
826构建的 ISSR指纹图谱能够区分所有供试植物。
2． 4 聚类分析 根据扩增结果进行 NJ聚类分析，得到的
支序图呈星状(图 4)。其中，夭命丝瓜藓(P． annotina)和拟
长蒴丝瓜藓(P． longicollis)形成一支，与黄丝瓜藓(P． nu-
tans)区分明显;丝瓜藓(P． elongata)和提灯藓(M． hornum)
形成一支，而卵蒴丝瓜藓(P． proligera)和匐灯藓(P． cuspida-
tum)聚为一支;小丝瓜藓(P． crudoides)和芽孢银藓(A． gem-
migerum)聚为一支，而与其他丝瓜藓属植物区分开。
图 4 ISSR数据分析产生的 NJ无根邻接树
Fig． 4 Unrotted neighbor-joining tree resulting from the analysis
of ISSR dataset
3 讨论
正交试验设计对于多因素试验设计来讲是一种有效的
数学方法，它的便利之处在于检验多个因素的同时，容易通
过直觉发现最佳的试验方案。为了获得稳定的和可重复的
扩增结果，有必要对不同种的 ISSR-PCR反应体系进行优化。
有多重因素会影响 PCR 扩增，例如 Mg2 +浓度、dNTPs 浓度、
Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度及 DNA模板浓度等，为寻找
到一套适合的 PCR反应参数，同时缩小试验的规模，采用正
交试验设计的方法。通过 L16(4
5)正交表设计的试验结果显
示，2． 25 mmol /L Mg2 +是获得强度和清晰度均合适的条带所
必需的;0． 03 U /μl Taq DNA 聚合酶能确保扩增条带的清晰
度;0． 4 mmol /L dNTPs 能平衡 Taq DNA 聚合酶的保真度减
少与 PCR反应有效性减少的矛盾;随模板浓度增大，虽然条
带强度能增加，但是条带变得弥散，5 ng /20 μl 的 DNA 模板
浓度能平衡每个 PCR反应条带强度和可确认性。
提取微量的 DNA 就能满足试验分析之需，对于研究藓
类植物特别有意义。对于许多种藓类植物，特别是真藓科植
物，植株通常很小，单个配子体仅有几毫米高，野外采集样品
的量有限。特别对于一些濒危藓类种，影响小的抽样就能解
决样品采集和避免破坏生境的矛盾。
传统分类上，丝瓜藓属植物因叶细胞狭长形、孢蒴有长
的蒴台部、孢蒴垂倾等形态学特征而划归真藓科［6，8 －10］。但
Cox等［11 －13］使用叶绿体基因组、核基因组及线粒体基因组的
DNA序列数据的分子系统发育分析研究认为丝瓜藓属与传
统上划归提灯藓科的属排列更近。Crosby 等［14］提出将丝瓜
藓属移至提灯藓科。丝瓜藓属植物的归属问题存在争议。
虽然目前该研究所呈现的丝瓜藓属中种与种的系统发育关
系有待进一步探讨，但结果显示出的 ISSR 标记高水平的多
态性为整个基因组提供了区分关系相近的藓类种的可行性。
特别是当形态学特征不足以鉴定真藓科植物种的时候，由
UBC808、811、826引物构建的 DNA 指纹能进一步提供额外
的信息，这无疑为真藓科以及丝瓜藓属等植物的分类问题的
最终解决带来了希望。
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