全 文 ：HPLC法测定番荔枝科植物中番荔素含量
孙　兰 , 余竞光＊ , 李德宇 , 李　进 , 杨学东 , 杨世林
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所 , 北京 100094)
摘要:目的　建立番荔枝科植物中抗肿瘤活性成分番荔素的 HPLC 含量测定方法。方法　Squamostatin-B(1),
squamocin(2)和 annonin-VI(3)为标准品 。色谱柱:反相 C18柱;流动相:甲醇-水(90∶10);流速:1.0 mL·min-1;检测波
长:220 nm。结果　进样量在 2.3-13.8μg 有良好的线性关系。(1),(2)和(3)的回收率分别为 100.3%, 100.3%和
100.0%。结论　本法快速 、简便 、灵敏和分离度好 , 适用于番荔枝科植物中抗肿瘤活性成分番荔素的含量测定。
关键词:番荔枝科;番荔枝属;番荔素;HPLC
中图分类号:R917;TQ460.72　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2001)09-0683-03
　　番荔素(annonaceous acetogenins或称 polyketides)
是番荔枝科(Annonaceae)植物所含的抗肿瘤活性成
分。1982年发现第一个化合物 ,至今已报告 400 多
个类似物。我国番荔枝科植物资源丰富 ,其中番荔
枝属(Annona L.)植物的种子含有丰富的番荔素 ,有
望从中开发抗肿瘤新药。该类化合物的定量分析方
法尚未见报道。本文以番荔枝属 4种及不同产地的
7种植物种子样品 ,即 4个产地(汕头市 ,深圳市 ,珠
海市和阿拉伯联合酋长国)的番荔枝(A.squamosa)、
圆滑番荔枝(A.glabra)、刺果番荔枝(A.muricata)和
牛心番荔枝(A.reticulata)等 ,探索了番荔素的含量
测定方法。本法既适用于分析 ,也可用于制备分离。
番荔素的结构如图 1所示。
Figure 1　Chemical structures of squamostatin-B(1), squamocin(2)and annonin-VI(3)
材 料 与 方 法
　　仪器 　高效液相色谱仪 洗脱液泵:Waters
600E ,进样器:U6K-7725 ,检测器:Waters 2487 ,色谱
处理器:Waters Millennium 32。
　　试剂　对照品 squamostatin-B(1), squamocin(2)
和 annonin-VI(3)为本实验室制备[ 1-3] 。甲醇(色谱
纯 ,Fisher),重蒸馏水(实验室制备)。
收稿日期:2001-02-08.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(29572087).
作者简介:孙　兰(1961-),女 ,主管技师;
余竞光(1937-),男 ,教授.
＊通讯作者　Tel:(010)62899728 , Fax:(010)62896313 ,
E-mail:yujingguang@163.com
　　色谱条件　色谱柱:Dikma Diamonsil C18(150
mm×4.6 mm ,5μm);流动相:甲醇-水(90∶10);流速:
1.0 mL·min-1;检测波长:220 nm;柱温:20℃。
结 果 与 讨 论
1　标准曲线及线性范围
精密 称取 对 照品 squamostatin-B 3.86 mg ,
squamocin 8.66 mg 和 annonin-VI 3.96 mg ,分别用甲
醇定容于 10 mL 量瓶内 ,各精密吸取 0.6 ,0.8 , 1.0 ,
1.2 ,1.4和 1.6 mL于 2 mL量瓶中 ,甲醇定容 。制成
不同浓度的标准溶液 ,依次取 20 μL 进样 ,作 HPLC
分析 。以峰面积对进样量回归处理 , 3种番荔素对
照品的峰面积与进样量均呈良好的线性关系。
·683·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2001 , 36(9):683-685
DOI :10.16438/j.0513-4870.2001.09.012
Table 1　The regression equation of annonaceous
acetogenins
Acetogenin Regression equation γ Linearity
range μg
Squamostatin-B Y =5.76×105X+2.92×104 0.9994 2.3-6.2
Squamocin Y =6.17×105X+4.95×104 0.9998 5.2-13.8
Annonin-VI Y =4.76×105X-2.54×104 0.9995 2.3-6.3
2　提取条件优化
比较了甲醇 、95%乙醇 、二氯甲烷和乙酸乙酯等
4种提取溶剂。结果表明生药以甲醇提取 ,番荔素
提取率最高 ,且样品中杂质干扰较少 ,所以选用甲醇
为提取溶剂 。为了优化提取条件 , 以超声时间 A
(10 ,20 ,30 min),提取次数 B(1 , 2 , 3次)和溶剂用量
C(10 ,15 , 20倍量mL)为 3个因素 ,设计 L9(34)正交
实验 。
　　样品溶液制备:精密称取汕头产番荔枝(A.
squamosa)种子粉末(过 60 目)2 g ,根据 L9(34)正交
表的要求 ,加入甲醇 C 量 ,超声 A min ,提取 B次 。
提取液过滤 ,弃去残渣 ,蒸干滤液后用甲醇定容于
10 mL 量瓶内 ,经微孔滤膜(0.45μm)过滤 ,弃去初滤
液 ,取续滤液 10μL 进行 HPLC 分析 。
　　正交实验结果的方差分析表明 , 3个因素中提
取次数对番荔素提取率影响最大 ,其次是超声时间
和溶剂用量。试验表明 ,样品量2 g时 ,用15倍量甲
醇 ,超声 20 min ,提取 2 次的条件较为理想 ,提取率
最高 。
　　在以上试验的基础上 ,进一步对超声提取前溶
剂的的浸泡时间进行了试验 。精密称取 2 g 样品 5
份 ,加 15倍量甲醇 ,分别浸泡 2 ,4 , 6 ,8和 10 h ,超声
20 min ,提取 2次 ,按前述处理及 HPLC 分析。结果
表明 ,浸泡4 h与浸泡 6 h或更长时间无显著差异 ,
故选取浸泡 4 h。综上所述 ,样品提取的最佳条件为
15倍样品量甲醇 , 浸泡 4 h , 超声 20 min 和提取 2
次 。
3　精密度和重复性
在上述色谱条件下以 squamocin标准液 ,连续进
样 6次 ,每次10 μL进行 HPLC 分析 ,测定峰面积的
RSD为0.4%。精密称取番荔枝种子 2 g 样品 6份 ,
按照“提取最优化条件”进行样品处理和分析。
squamostatin-B RSD 为 1.4%, squamocin RSD 为
0.3%, annonin-VI RSD为 1.2%。
4　加样回收率
精密称取3种已知番荔素含量的番荔枝种子样
品 ,6 份 , 每份 1 g , 加入一定量的 squamostatin-B ,
squamocin和 annonin-VI标准品 。按照“提取最优化
条件” 进 行样 品 处 理和 HPLC 分 析 。结 果 ,
squamostatim-B 回收率为 100.3%, RSD 为 1.4%;
squamocin回收率为 100.3 %, RSD为 1.1%;annonin-
VI回收率为 100.0%,RSD为 1.2%。
5　样品分析
番荔枝属植物 4种 ,收集不同产地的 7个样品 ,
每个样品平行测定 3次 ,以“提取最优化条件”即 15
倍样品量的甲醇 ,浸泡 4 h ,超声 20 min ,提取 2次处
理和进行HPLC分析。结果见表 2。色谱图见图 2。
Figure 2　Chromatography of samples from the Annona sp.
A.Standard sample:1.Squamostatin-B(tR 6.2 min);2.Squamocin(tR 14.0min);3.Annonin-VI(tR 19.5 min);
B.Annona squamosa (Shantou);C.A.squamosa (Shenzhen);D.A.squamosa (Zhuhai);E.A.squamosa (The
United Arab Emirates);F.A.glabra (Hainan);G.A.reticulata (Yunnan);H.A.muricata (Hainan)
·684· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2001 , 36(9):683-685
Table 2 　Content of annonaceous acetogenins in
sample of Annona sp.
Sample (origin) Content of acetogenins %
Squamostatim-B Squamocin Annonin-VI
A.squamosa (Shantou) 0.10 0.68 0.15
(Shenzhen) 0.16 1.47 0.47
(Zhuhai) 0.12 0.65 0.04
(The United Arab 0.16 0.67 0.31
　　Emirates)
A.glabra (Hainan) 0.08 3.19 0.20
A.muricata (Hainan) 0.07 0.04 0.01
A.reticulata (Yunnan) 0.06 0.02 0.04
讨 论
　　番荔枝种子中含油脂量很高 ,经石油醚脱脂处
理对番荔素提取和处理较为方便 ,但不脱脂样品的
番荔素含量较脱脂样品高 ,说明了石油醚脱油脂同
时也能提出一部分番荔素 。
　　不同产地的 4个番荔枝(A.squamosa)中 3种番
荔素的含量较高 ,各含量略有不同 。但不同种植物
的其他 3 种样品番荔素含量差异较大 , 特别是
A.muricata和A.reticulata中 3 种番荔素含量均小于
0.07%,显然后两种植物的化学成分与 A.squamosa
不一样 , 这与我们以前关于其化学成分研究结
果[ 3-5] 是一致的 。
REFERENCES:
[ 1] Yu JG , Lu XZ , Sun L , et al.Squamostatin-B , a new
polyketide of the seeds from Annana squamosa (Annanaceae)
[ J] .Chin Chem Lett , 1993 , 4(5):423-426.
[ 2] Yu JG , Lu XZ , Sun L , et al.Studies on the chemical
constituents of the seeds from Annona squamosa [ J] .Acta
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constituents of the seeds from Annona muricata [ J] .Acta
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[ 4] Li DY , Yu JG , Sun L , et al.Muricatenol , a linear
acetogenin from Annona muricata (Annonaceae)[ J] .Chin
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[ 5] Liu D , Yu JG , Sun L , et al.Studies on the chemical
constituents of the seeds from Annona reticalata [ J] .Nat
Prod Res Dev(in Chinese), 1998 , 10(2):1-3.
DETERMINATION OF ANNONACEOUS ACETOGENINS IN
ANNONACEAE PLANTS BY HPLC
SUN Lan , YU Jing-guang , LI De-yu , LI Jin , YANG Xue-dong , YANG Shi-lin
(Institute of Medicinal Plant Development , Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College , Beijing 100094 , China)
ABSTRACT:AIM　To develop a method for analysis of antitumor annonaceous acetogenins in Annonaceae plants
by HPLC.METHODS　Squamostatin-B(1), squamocin(2)and annonin-VI (3)were used as standard substances.
Chromatography column was a Rp-18;the mobile phase was methanol-water(90∶10);the flow rate was 1.0mL·min-1
and the detecting wavelength was 220 nm.RESULTS　A linear range was obtained from 2.3 to 13.8 μg with a good
correlation.The recoveries of(1), (2)and(3)were 100.3%, 100.3% and 100.0%, respectively.CONCLUSION
This method was developed for the analysis of acetogenins by HPLC for the first time.The method is rapid , accurate and
suitable for the analysis of the antitumor acetogenins in Annonaceae plants.
KEYWORDS:Annonaceae;Annona L;annonaceous acetogenins;HPLC
·685·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2001 , 36(9):683-685