全 文 ：微生物学通报 Sep. 20, 2013, 40(9): 17231732
Microbiology China © 2013 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn
基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30971875); 国家公益性行业(农业)科研专项项目(No. 201003067); 中央高
校基本科研业务费资助项目(No. CDJXS112300)
*通讯作者：Tel/Fax: 86-23-65120489; : zkwang646@sina.com
收稿日期：2012-11-07; 接受日期：2013-01-25
生物实验室
基于 EMA-qPCR的茄科青枯菌活体
检测技术的建立
熊书 殷幼平 王芳 王中康*
(重庆大学 生命科学学院 重庆市杀虫真菌生物农药工程技术中心
重庆市基因功能与调控重点实验室 重庆 400030)
摘 要: 【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与
实时荧光定量 PCR 技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方
法】样品 DNA 制备前经 EMA 渗透预处理, 再进行实时荧光定量 PCR 特异扩增菌体
DNA。【结果】终浓度为 2.0 mg/L的 EMA能有效排除 1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞
DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的 DNA扩
增均没有影响。当每个定量 PCR反应体系中的活细胞在 5.0×100−5.0×104 CFU范围内时,
扩增 Ct值与定量 PCR反应体系中活细胞 CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比
较 EMA-qPCR 法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样
品可在 24 °C与 4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的 EMA-qPCR方法能有
效检测青枯菌 VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌 PCR检测的假阳性和假
阴性。
关键词: 茄科青枯菌, 叠氮溴乙锭, 活的非可培养状态, 活体检测, 实时荧光定量 PCR
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Establishment of a new method to detect viable cells of
Ralstonia solanacearum by EMA-qPCR
XIONG Shu YIN You-Ping WANG Fang WANG Zhong-Kang*
(College of Life Science, Chongqing University, Chongqing Engineering Research Center for Fungal
Insecticide, Chongqing Key Laboratory of Genetic Function and Regulation, Chongqing 400030, China)
Abstract: [Objective] A novel method to differentiate viable/dead cells of Ralstonia solana-
cearum was established by using a DNA dye of ethidium monoazide bromide (EMA) in com-
bination with the real-time polymerase chain reaction (EMA-qPCR). [Methods] Samples were
pre-treated with EMA prior to DNA extraction. DNA from dead cells was bound by EMA, so
that only DNA from viable R. solanacearum cells can be amplified by real-time PCR. [Re-
sults] A final concentration of 2.0 mg/L EMA was demonstrated to completely inhibit the PCR
amplification from DNA derived from 1.0×107 CFU/mL dead cells, but no inhibition to viable
and viable but non-culturable (VBNC) cells. A standard curve was generated relating the Ct
values of the EMA-qPCR to the log number of genomic targets per PCR. A linear range of
DNA amplification was observed from 5.0×100 to 5.0×104 genomic targets per PCR.
EMA-qPCR method was used to evaluate the survival rate of R. solanacearum treated with
different temperatures for a short time, compared with the method of plate count. The results
indicate that samples can be stored for a short time under room temperature and 4 °C. [Con-
clusion] The EMA-qPCR method established in this work can effectively avoid false positive
and false negative results of the R. solanacearum detection.
Keywords: Ralstonia solanacearum, Ethidium monoazide bromide (EMA), Viable but
non-culturable (VBNC), Real-time PCR
细菌性青枯病是由茄科青枯菌(Ralstonia so-
lanacearum)引起的土传病害, 可引起 54多个科,
540 余种植物的病害, 危害多种经济作物、木本
植物和草本植物, 造成巨大的经济损失[1]。自 Xu
等 [2]首次报道了细菌的“活的但不可培养的状
态”(Viable but non-culturable, VBNC)以来, 关于
植物病原细菌的 VBNC 状态研究备受关注。有
研究报道青枯菌能以 VBNC 的状态存在于土壤
中[3−4], 并能在一定条件下从该状态恢复, 且病
原菌能在湿润土壤和水中存活数年 [5−6], 处于
VBNC 状态的菌能逃过常规培养分离法的检测
成为“隐性”传染源。由于青枯病防治难, 一旦发
病, 就会带来巨大损失[1,7]。目前, PCR技术已经
广泛用于青枯菌病原检测中, 而传统的 PCR 检
测技术不仅能扩增活菌DNA, 死细胞DNA或自
由状态的 DNA 也能被扩增[8], 导致检测假阳性
增加; 一些病害防治措施特别是检疫措施也需
要对防治效果的快速检测。因此一种能特异、准
确、快速检测青枯菌活菌和 VBNC 菌的方法成
为迫切需要。
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目前区分死活病原细菌的方法中, 基于能与
DNA 共 价 结 合 的 叠 氮 溴 乙 锭 (Ethidium
monoazide bromide, EMA)的 PCR分子检测技术
备受关注。该方法以 EMA 选择渗透进入死细胞
非正常的细胞膜内, 与死细胞内的 DNA 发生共
价不可逆的结合从而抑制其 PCR扩增, 使得只有
活菌DNA可以作为扩增模板进行 PCR扩增[9−11]。
该方法仅以活的微生物的基因组 DNA 为检测靶
标, 能有效降低传统 PCR检测的假阳性, 使检测
结果更加准确、可靠。为此 , 本研究拟以
EMA-qPCR方法检测不同状态下的青枯菌, 探讨
EMA-qPCR 方法在青枯菌纯培养条件下区分死
细胞与活的可培养细胞以及 VBNC 状态细胞的
可能性, 以为植物青枯病的检验检疫防控提供更
科学、准确的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株: 茄科青枯菌(R. solanacearum)
从番茄病株上分离, 由西南大学植物保护学院提
供。菌株在常温下保存于灭菌蒸馏水中。
1.1.2 培养基: 采用 NA 培养基(g/L)[12]: 牛肉浸
膏 3.0, 酵母浸膏 1.0, 蛋白胨 5.0, 葡萄糖 10.0,
pH 7.0。
1.1.3 试剂和耗材 : 叠氮溴乙锭 (Ethidium
monoazide bromide, EMA, Invitrogen), 吖啶橙(北
京鼎国生物技术有限公司 ), 四甲基偶氮唑盐
(MTT, Sigma), NucleporeTM 黑色聚碳酸酯滤膜
(Whatman), SYBR® Premix Ex Taq TMⅡ Mix
(TaKaRa)。
1.2 方法
1.2.1 青枯菌死活菌悬液的制备: 从 NA 平板上
挑取青枯菌单菌落, 接种于 20 mL NA液体培养
基中, 摇床培养(28 °C、250 r/min)至 OD600约为
3.0 (以NA培养基为对照), 得到活菌细胞悬液(细
胞密度约为 2.0×109 CFU/mL)。将部分活菌细胞
悬液在 100 °C水浴 5 min, 得到青枯菌死菌细胞
悬液。将死菌在 NA 平板上划线, 于 28 °C 培养
24−72 h, 验证其致死效果后备用。
1.2.2 EMA 处理条件的优化和青枯菌死、活细
胞的处理: (1) 死、活细胞的 EMA 渗透处理及
EMA 用量优化: 黑暗中, 3 种不同浓度(108、107
和 106 CFU/mL)的死细胞与活细胞纯菌悬液分别
加入离心管中, 避光添加不同浓度的 EMA, 轻柔
混匀, 黑暗中静置 5 min 使其渗入细胞内[10], 将
离心管取出, 开盖置于冰上, 距离灯管 15 cm,
650 W 卤钨灯持续均匀曝光 10 min[10,13], 激活
EMA。
(2) 死、活细胞混合菌悬液的 EMA渗透处理:
以固定数量的死细胞(5.0×106 CFU)分别与不同
数量的活细胞 (2.5×109、 1.25×108、 2.5×107、
1.25×107、2.5×106、1.25×106、2.5×105、1.25×105、
2.5×104、1.25×104和 2.5×103 CFU)混合形成不同
死、活细胞比例的混悬液, 并用优化出的 EMA
检测浓度处理不同比例的混合菌悬液。轻柔混匀,
按 1.2.2(1)做 EMA静置渗透、激活处理。
1.2.3 青枯菌VBNC状态的诱导: 参考Grey等[3]
的报道, 以寡营养(0.9% NaCl)和重金属(Cu2+)条
件诱导青枯菌进入不可培养状态, 将 CuSO4溶液
加入到灭菌后的 0.9% NaCl溶液中(Cu2+的终浓度
为 0.05 mmol/L), 使 Cu2+的终浓度为 0.05 mmol/L,
随后加入浓度为 107 CFU/mL新鲜青枯菌悬液(需
多次清洗彻底清除培养基, 再用无菌 0.9% NaCl
重悬), 混匀后分别在 0、10、20和 30 d进行下面
的检测:
(1) 细菌总数的测定 (AODC 法 ): 参考文
献 [14−15]进行, 将待测菌液 1 mL 用甲醛固定
1−2 min (终浓度为 2%), 再用吖啶橙染色 7 min
(终浓度为 0.01%), 过滤到 NucleporeTM黑色聚碳
酸酯滤膜上(孔径 0.2 μm, 直径 25 mm), 荧光显
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微镜观察计算菌液原始浓度(cells/mL)。
(2) 活细菌数的测定(MTT法): 参照文献[16]
进行。
(3) 可培养细菌数的测定(CFU): 选择 10−3、
10−4和 10−5三个稀释度, 每 10 d取各稀释度的菌
悬液 50 μL涂NA平板, 28 °C培养 2−3 d, 选择在
30−300 CFU 范围内稀释度平板计数菌落数, 根
据下列公式计算原始菌液的浓度:
细菌浓度(CFU/mL)=(平均菌落数 CFU×稀释
倍数)/0.05 mL。
确定 青枯菌进入 VBNC 状 态后 , 用
EMA-qPCR方法检测菌量, 对照组为同浓度的青
枯菌死菌和可培养的活菌。
1.2.4 DNA 模板制备: 参考 Wang 等[8]的报道,
将经过曝光处理的菌液经 8 000 r/min 离心
5 min, 弃尽上清, 菌体重悬在 0.5 mL 1.5%的氯
化钠溶液中 , 再将重悬液离心 (8 000 r/min,
5 min), 弃上清, 用 0.5 mL的Milli-Q水重悬。制
备TZ裂解液(2.0% Triton X-100, 2.5 g/L的叠氮化
钠, 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液, pH 8.0)[17−18]。在通
风橱中, 将 0.5 mL上述重悬菌液与等体积 TZ裂
解液混匀。混合液沸水浴 10 min, 使细菌细胞充
分裂解。冷却, 离心(10 000 r/min, 5 min), 取
200 µL 上清移入 2 mL DNA 纯化柱 (DNA
UNIQ-10 Column, 生工生物工程上海有限公司),
将 DNA进行纯化备用。
1.2.5 检测引物以及荧光定量 PCR 反应条件:
参考 Chen 等[19]的报道, 根据青枯菌 UDP-3-O-
acyl-GlcNAc deacetylase 基因设计特异引物 RSF
(5′-GTGCCTGCCTCCAAAACGACT-3′) 和 RSR
(5′-GACGCCACCCGCATCCCTC-3′), 引物由北
京六合华大基因科技股份有限公司合成。扩增目
的片段长度为 159 bp。PCR 扩增在 CFX96
Real-Time PCR System (Bio-Rad)进行 , SYBR
GreenⅠ荧光染料染色。反应采用 25 µL的反应体
系: 12.5 μL SYBR® Premix Ex Taq TMⅡmix (Ta-
KaRa), 0.75 μL引物对 RSF/RSR (10 µmol/L)以及
2 μL模板, 加Milli-Q水补足 25 μL。PCR反应程
序为: 95 °C 1 min; 95 °C 15 s, 63 °C 15 s, 72 °C
20 s, 共 40个循环。PCR扩增结束后立即进行熔
解曲线分析, 验证扩增的特异性。
1.2.6 不同温度短期处理活菌的 EMA-qPCR 检
测方法与平板计数法的比较: 取 0.5 mL 浓度为
2.0×107 CFU/mL 的新鲜培养的青枯菌活菌悬液,
8 000×g离心 5 min后, 将菌体重悬在 0.5 mL的
Milli-Q水中, 分别于−20 °C冷冻处理、4 °C冷藏
处理和 24 °C处理 24、48和 72 h后, 取菌液, 避
光添加 EMA, 使 EMA 终浓度为 2.0 mg/L, 按
1.2.2 (1)做 EMA静置渗透、激活处理, 提取 DNA,
进行 qPCR扩增, 按 1.2.3(2)进行MTT法检测, 取
同样处理的两管菌液涂布 NA 平板, 28 °C 培养
2−3 d计算菌落数。
1.2.7 EMA-qPCR 检测方法的假阳性验证: 按
1.2.1制备浓度为 107、106、105和 104 CFU/mL的
灭活青枯菌死细胞菌悬液, 比较EMA-qPCR方法
和平板计数法对灭活死细胞的检测差别, 用以检
验 EMA-qPCR方法检测的假阳性几率。
1.2.8 数据分析: 应用 SPSS 17.0 统计软件对实
验数据进行 t检验, P<0.05表示具有显著性差异。
一元线性回归方程用Microsoft Excel 2007制作。
2 结果与分析
2.1 抑制纯培养死细胞DNA扩增的最适EMA
浓度
对 3种不同浓度死菌细胞的实时荧光 PCR检
测结果显示, 添加 EMA 的实验组 Ct值与活细
胞对照组相比均有显著增加(P<0.05)。当死菌浓
度≤107 CFU/mL 和 EMA 浓度为 1.5 mg/L 时,
死细胞 DNA的扩增即可完全被抑制。但当菌浓
度为 108 CFU/mL 时 , 即使 EMA 浓度高达
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10 mg/L 时, 也不能完全抑制死细胞 DNA 的扩
增(图 1A)。
低浓度的 EMA 对所测 3 种浓度的活细胞靶
基因扩增没有显著的抑制作用(P>0.05)。但高浓度
EMA 对活细胞的 PCR 扩增显示出一定抑制作用,
当活菌浓度≤107 CFU/mL和EMA浓度≥40 mg/L
时, 对活细胞的靶基因扩增有显著的抑制作用
(P<0.05, 图1B)。即影响活细胞DNA扩增的EMA
浓度(40 mg/L)远远大于抑制死细胞 DNA扩增的
最小 EMA浓度(1.5 mg/L), 采用 30 mg/L以下浓
度 EMA 都对活细胞扩增无影响。综合考虑成本
等因素, 选择 EMA浓度为 2.0 mg/L为区分低于
107 CFU/mL纯培养菌死活细胞的最佳浓度。
2.2 死、活细胞混合体系中 EMA-qPCR对活
细胞的选择性扩增
当固定数量的死细胞(5.0×106 CFU)与不同数
量的活细胞混合后, 添加 EMA, 使 EMA 终浓度
为 2.0 mg/L。死细胞 DNA的扩增完全被抑制, 随
着活菌CFU数的减少, 其Ct值呈现上升趋势, 检测
下限能达到 5.0×100 (Ct为 35.31)个活细胞(图 2A)。
在反应体系中活细胞数为 5.0×100−5.0×104 CFU
的范围内, qPCR 的 Ct值与反应体系中活菌 CFU
数目的对数值有良好的线性关系, 相关系数为
R2=0.992 5 (图 2B)。因此在此范围内可以通过 Ct
值对 qPCR体系中活菌数目进行定量。
2.3 处于 VBNC状态的青枯菌的 EMA-qPCR
方法检测
在0.9% NaCl和Cu2+的终浓度为0.05 mmol/L
诱导培养 20 d, 按常规方法进行涂板培养无菌落
长出, 平板计数为 0, 表明青枯病菌进入了不可
培养状态(图 3); 对该菌DNA进行 EMA-qPCR结
果显示, 扩增的 Ct值在添加和不添加 EMA 组中
无显著变化(P>0.05), 表明青枯菌进入活的不可
培养状态, 即 VBNC 状态, 而灭活死菌在添加
EMA 后 , 没有扩增 (图 4)。上述结果表明 ,
EMA-qPCR 能作为检测处于 VBNC 状态的青枯
病菌的有效手段, 可避免使用平板计数法检测出
现的假阴性结果。
图 1 青枯病菌 EMA-qPCR检测体系中 EMA用量的优化
Fig. 1 Optimization of the EMA concentration in EMA-qPCR
注: A: 抑制死细胞 DNA扩增的 EMA浓度优化; B: EMA浓度对活细胞 DNA扩增的影响. Control: 不添加 EMA; *: 与对照组
相比有显著性差异.
Note: A: Optimization of the minimum amount of EMA to inhibit amplication of DNA from dead R. solanacearum cells as reflected
by Ct values in qPCR; B: Influence of EMA on DNA amplification from viable R. solanacearum cells. Control: PCR amplified with-
out EMA; *: The difference was significant (P<0.05) compared with the controls.
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图 2 死、活细胞混合体系的 EMA-qPCR扩增
Fig. 2 The amplication of mixed bacteria by EMA-qPCR
注: A: 在添加 EMA和不添加 EMA条件下, 定量 PCR反应体系中不同的菌量与扩增Ct值的关系; B: 在添加 EMA条件下, 扩
增Ct值与定量 PCR反应体系中活细胞 CFU对数值的线性关系, 混合 PCR扩增体系中死菌数目固定为 5.0×106 CFU, 活细胞数分
别为 5.0×100、2.5× 101、5.0×101、2.5×102、5.0×102、2.5×103、5.0×103、2.5×104和 5.0×104 CFU.
Note: A: Relationship between the Ct values from EMA-qPCR and the varying number of genomic targets per PCR; B: A standard
curve relating the Ct values from the EMA-qPCR to the log number of genomic targets per PCR. The number of dead cells in the
mixture was kept constant at 5.0×106 CFU. Point 1−9: 5.0×100, 2.5×101, 5.0×101, 2.5×102, 5.0×102, 2.5×103, 5.0×103, 2.5×104, and
5.0×104 viable CFU/qPCR, respectively.
图 3 青枯菌进入 VBNC状态的检测
Fig. 3 Detection of R. solanacearum transforming into a VBNC state by three different methods
注: A: 青枯菌 AODC法荧光检测; B: 用平板计数法、AODC法、MTT法检测.
Note: A: Detection of R. solanacearum by AODC methods; B: Entry of R. solanacearum into the VBNC state in liquid microcosms,
as determined by AODC, MTT and plate counting methods.
2.4 不同温度短期处理后青枯菌的存活情况
的 EMA-qPCR检测
在实际样品检测中, 可能会出现待检样品短
期积压情况, 需要进行暂时保存。那么, 样品的
保存温度对最终检测结果有没有影响? 因此, 我
们设计了 24°C、4°C、−20°C 3 个温度梯度保存
72 h后, 以EMA-qPCR检测样品青枯菌存活情况
并与平板培养计数法和 MTT 法进行比较。结果
显示, 当浓度为 1.0×107 CFU/mL活菌经过−20 °C
冷冻处理 72 h后, EMA-qPCR的检测结果显示活
菌为 3.3×105 CFU, 平板计数法结果显示活菌数
为 3.8×103 CFU, 两种方法得到的结果有显著差
异(P<0.05), 而MTT法得到的检测结果与平板计
数法无显著差异(P>0.05, 图 5A), 表明极端的低
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温处理青枯菌会出现部分死亡。24 °C处理和 4 °C
处理 72 h后, 3种检测方法的活菌检测结果均无
显著差异(P>0.05, 图 5B、C), 与 0 h的对照组相
比活菌数均无显著变化(P>0.05), 初步表明待检
测样品可在此条件下短期保存。
2.5 EMA-qPCR检测方法的假阳性验证
为了验证 EMA-qPCR 方法对灭活的青枯菌
的检测是否会出现假阳性结果, 设计了平板培养
计数法, EMA-qPCR方法和常规 qPCR方法对灭
活的青枯菌死细胞进行了检测。结果显示, 在所
设置的 4 组灭活死细胞浓度中, 除了常规 qPCR
方法检测到青枯菌的存在以外, EMA-qPCR方法
和平板培养计数法的检测结果均为阴性(表 1),
图 4 3种不同状态的青枯菌的EMA-qPCR检测结果
Fig. 4 The result of detecting R. solanacearum by
EMA-qPCR
Note: The Ct values derived from DNA extracted from cells
without EMA treatment were set as control.
图 5 EMA-qPCR方法、平板计数法与MTT法检测经不同温度处理的活菌
Fig. 5 Use of EMA-qPCR method to detect R. solanacearum compared with the method of plate counting and MTT
注: A: −20 °C处理 24、48和 72 h; B: 24 °C处理 24、48和 72 h; C: 4 °C处理 24、48和 72 h.
Note: A: R. solanacearum suspension (1.0×107 CFU/mL) in sterile water at −20 °C for 24, 48, and 72 h; B: R. solanacearum suspen-
sion (1.0×107 CFU/mL) in sterile water at 24 °C for 24, 48, and 72 h; C: R. solanacearum suspension (1.0×107 CFU/mL) in sterile
water at 4 °C for 24, 48, and 72 h.
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表 1 平板培养计数法、常规 qPCR法、EMA-qPCR测定灭活青枯菌数的比较
Table 1 Comparison of bacterial counts determined by qPCR, EMA-qPCR and plate counting methods
检测值 Detect values 青枯菌细胞数
Ralstonia solanacearum
counts (CFU)
EMA-qPCR方法
average Ct value±STDEV a
qPCR
average Ct value ± STDEV a
平板培养计数
Plate counting (CFU)
107 NA 23.08±0.1305 0
106 NA 25.96±0.2899 0
105 NA 28.02±0.1085 0
104 NA 30.78±0.2458 0
Note: STDEVa: Standard deviation.
这表明在对青枯菌死细胞的检测中, 常规 qPCR
方法不能区分死活菌, 死菌 DNA 也可做为模板
被扩增, 而本研究所建立的EMA-qPCR仅以活菌
为检测靶标, 对死菌不会扩增, 未出现假阳性检
测结果, 平板计数方法进一步验证了 EMA-qPCR
的可靠性。
3 讨论
EMA 能进入细胞壁(膜)损坏的死细胞内, 同
细胞 DNA结合而阻止 DNA的扩增, 而活细胞完
整的壁(膜)结构可以阻止EMA的进入, 从而实现
了 EMA 作用的选择性[8−9], 将 EMA 作用的选择
性与实时荧光定量 PCR技术相结合, 能使活菌基
因组 DNA为检测靶标得到扩增, 从而能准确、快
速地实现样品中死活菌的区分。目前该方法已经
广泛地用于国内外临床医学和食源致病微生物
的检测中[8,10−11,13], 但对农业植物病原菌的检测
国内外仅有 3篇文献报道[20−22]。
本研究结果显示, 当 EMA 的作用终浓度达
到 1.5 mg/L 时 , EMA-qPCR 方法能完全抑制
107 CFU/mL浓度的青枯菌死菌的扩增; 在死、活
菌混合体系中, EMA-qPCR对活菌的检测下限能
够达到 5.0×100 个菌/反应, 且当反应体系中活菌
数在 5.0×100−5×104 CFU范围内时, 扩增 Ct值与
活菌数为线性相关。因此可以利用所建立的标准
曲线对混合体系中的活菌进行快速定量检测。
VBNC 状态是细菌的一种特殊存活机制, 是
一种对不良环境的适应性反应。处于 VBNC状态
的细菌在常规培养条件下表现为不可培养, 因此
在常规的平板计数方法中不能被检出。目前用于
VBNC 细菌的检测技术主要有光学方法[主要有
活菌直接计数法(DVC)、呼吸检测法、死/活细菌
检测试剂盒]、免疫学法、分子生物学法等, 其中
分子生物学检测成为一种趋势, mRNA 体外扩增
法(RT-qPCR)是目前区分死活细胞的常用分子检
测方法, 但有一定的局限性[10]。本研究中所建立
的 EMA-qPCR 方法能够有效区分青枯菌的死细
胞和 VBNC 状态的方法, 并且方法简单可靠, 可
以用于实际应用。
实际检测中, 待检样品可能会出现积压情况,
需要短期保存。我们初步研究了在不同温度下短
期保存后菌体细胞死活状态的变化, 结果显示,
菌体在 4 °C和 24 °C保存 72 h, EMA-qPCR与平
板计数法结果一致, 活体数与对照组无显著差
异, 但是 EMA-qPCR 检测方法与平板计数法相
比, 只需在几小时就可以完成, 大大缩短了检测
时间。而在−20 °C 保存 72 h 后, 检测结果显示
EMA-qPCR比平板计数法检出的活菌数要高。根
据 Van等[5]报道, 青枯菌在无菌水中 4 °C冷藏 3
个月菌体会进入 VBNC状态。本研究中−20 °C保
存 72 h后, MTT法检测显示菌体出现了部分死亡
(图 5A)。结合 Kell等[23]和 Novak等[24]的报道, 极
熊书等: 基于 EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立 1731
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端低温处理后的菌体可能会因酶的活性被破坏
而死亡 , 而细胞壁(膜)仍能保持部分完整 , 使
EMA染料无法渗透进入, 从而出现了 EMA-qPCR
法比平板计数法检出的活菌数要高。由此充分表
明, 待检样品能在 4 °C和 24 °C条件下做短期保
存而对检测结果无影响, 不能够在−20 °C低温条
件做短期保存。
综上所述, 本研究建立的 EMA-qPCR检测方
法能从混合状态下的纯培养菌中特异性检测出
青枯菌活菌 , 并能够有效区分死细胞和处于
VBNC 状态的细胞, 提供了更为准确、科学的检
测方法, 具有一定的应用前景。
参 考 文 献
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科技信息摘录
科学家在 DNA折纸单分子反应中发现“穿越”
中国科学院上海应用物理研究所胡钧课题组与上海交通大学生物医学工程院合作, 在DNA折纸单分子反
应的研究中发现了“分子穿越”现象。相关成果日前在线发表于《美国化学会志》。
DNA 折纸技术结合了生物 DNA 分子本身严格的互补配对原则和计算机编程技术, 成为制造人为可控纳米
结构的有效途径。目前, 基于 DNA折纸技术研究单分子反应和进行相关生物检测, 已成为学术界关注的前沿领
域。然而, DNA折纸在界面上的吸附取向原因不明、无法控制, 因此当功能化修饰的一面朝向吸附界面时, 其功
能性分子朝向吸附的界面表面, 修饰面难以顺利完成既定功能, 这将限制 DNA纳米机器和器件的实际应用。
在研究员胡钧的指导下, 博士生吴娜等在研究DNA折纸上生物素与亲和素的单分子识别反应动力学过程
时发现, 单链 DNA 分子可以“穿越”DNA 折纸, 与折纸另一端的分子发生反应。研究人员猜测: 两维 DNA 折
纸呈现纳米网格结构, 网格的孔洞呈现规则而有序的排列。分子模拟与原子力显微镜检测结果显示, 这些“纳
米孔”的孔径约在 1−3 nm间, 尺度合适的单链 DNA分子可穿过“纳米孔”。通过巧妙的图案化设计和单分子识
别反应的实时原位检测, 研究人员发现一定长度的单链 DNA 的确可通过“纳米孔”穿梭到折纸的另外一面, 且
在一定范围内, 其长度对分子识别反应具有显著的调控作用, 长度越长反应越快。
专家认为, “分子穿越”现象的发现具有重要意义, 如果功能性分子能够通过此“纳米孔”, 从折纸的一面穿
梭到另外一面, 就可改善由于 DNA折纸吸附取向所造成的问题。这将为 DNA折纸纳米结构构建提供新视角,
并为有关实验现象提供新的诠释依据。
——摘自《科学网》2013/8/27
http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2013/8/281722.shtm