全 文 ：2006年 12月
2006, 28(4):381— 387
中国油料作物学报
Chinese journa l of oil crop sciences
萝卜芥蓝异源四倍体
与埃塞俄比亚芥属间杂交
陈洪高 , 吴江生* , 刘克德 , 程雨贵 , 刘　超
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,国家油菜改良武汉分中心 ,湖北武汉 430070)
摘要:萝卜芥蓝异源四倍体(Raphanobrassica , RRCC, 2n=36)与埃塞俄比亚芥(B rassica carinata, BBCC, 2n =
34)正反交 , 结果表明:萝卜芥蓝异源四倍体 ×埃塞俄比亚芥可交配率为 7. 3%,反交为 64. 6%。正反交 F1植株均
呈双亲中间形态 , 体细胞染色体数目为 35, 花粉母细胞减数分裂染色体主要配构型为 10Ⅱ +15Ⅰ 。 62个 F2植株
和 22个与埃塞俄比亚芥的回交植株的形态为中间类型 、偏萝卜芥蓝异源四倍体或偏萝卜。 AFLP检测到 F
2
和 BC
1
植株均含有大量双亲特异片段 ,聚类分析表明 , 这些植株独立于亲本种聚成一组。
关键词:萝卜芥蓝;埃塞俄比亚芥;属间杂交;形态学;细胞学;AFLP
中图分类号:Q949. 748. 3;S565. 403　文献标志码:A　 文章编号:1007— 9084(2006)04— 0381— 07
　　油菜的 3个异源四倍体种甘蓝型油菜 (Brassica
napus, AACC , 2n =38)、芥菜型油菜 (B rassica jun-
cea , AABB , 2n =36)和埃塞俄比亚芥 (简称埃芥 ,
B rassica carina ta , BBCC , 2n=34),是由 3个二倍体
种白菜型油菜(B rassica campestris, AA , 2n=20)、甘
蓝 (B rassica oleracea , CC , 2n=18)和黑芥 (Brassica
nigra , BB, 2n=16)[ 1]分别杂交形成的 ,而 3个二倍
体种可能起源于染色体数为 n =6的未知古基因组
物种[ 2] 。狭窄的遗传变异限制了油菜产量的进一
步提高 ,开拓新的育种材料对于油菜育种具有重要
意义[ 3] 。细胞学和分子生物学研究表明 ,萝卜 (Ra-
phanus sa tivus, RR, 2n=18)同芸薹属 3个二倍体种
起源于相同的古基因组物种 [ 4, 5] ,含有对油菜育种
有用的基因 。由萝卜与白菜[ 6] 、甘蓝[ 7]和甘蓝型油
菜 [ 8]杂交 ,人工合成的异源多倍体含萝卜染色体的
异附加系和异代换系 ,已经成为萝卜基因向油菜渗
入的重要桥梁[ 9, 10] ,其中典型的例子是将萝卜抗根
结线虫基因[ 10] 、细胞质雄性不育基因 [ 11]及其恢复
基因[ 12]转育到了甘蓝型油菜之中 。然而关于萝卜
与埃芥之间杂交的报道极少。本试验以萝卜芥蓝异
源四倍体 (简称萝卜芥蓝 , Raphanobrassica , RRCC ,
2n=36)为桥梁与埃芥杂交 ,探索实现萝卜的 R基
因组与埃芥的 BC基因组重组的途径。
1　材料与方法
1. 1　材料
萝卜芥蓝 、埃芥 、何庆萝卜 (R. sativus cv.
Heqing)、白花芥蓝 (B rassica alboglabra Bailey, CC ,
2n=18)和黑芥 。萝卜芥蓝是本实验室通过何庆萝
卜与白花芥蓝杂交 , F1植株经秋水仙碱加倍育成稳
定的异源四倍体 ,为白色花冠。埃芥在杂交前经过
连续自交纯化 ,为淡黄色花冠。试验材料由本研究
室提供。
1. 2　方法
1. 2. 1　杂交及可交配性调查　杂交于 2003年春季
在华中农业大学油菜试验田进行 。对萝卜芥蓝和埃
芥采用常规去雄进行正反交 ,授粉后套袋挂牌 ,成熟
时按母本单株分组合收获 ,分别考察收获的角果数
和种子数 ,计算可交配率 (=收获种子数 ÷授粉花
数 ×100%)。 F1种子直接播种田间 , F1植株自由授
粉或与双亲回交。 F2和 BC1分区隔离 ,自由授粉结
实 ,分单株考察角果数和种子数。
1. 2. 2　细胞学观察　从 F1单株采回幼小花蕾剥取
子房 ,用 2mmol /L 8 -羟基喹啉预处理 4h后 , 10mL
卡诺液 (乙醇 /冰醋酸 =3 /1 , v /v)固定 8 ～ 24h,转
入 70%乙醇 4℃保存 , 供染色体计数。观察减数分
收稿日期:2006— 01— 21
基金项目:湖北省 “十五 ”科技攻关重大项目(2004AA204A - 2)
作者简介:陈洪高(1973— ),男 ,苗族 ,华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室博士研究生 ,主要从事油菜种质资源创新研究。
E -mai l:honggao_ ch en@w ebm ai.l hzau. edu. cn。
*通讯作者:吴江生(1950— ),男 ,教授 ,博士生导师。
裂时直接固定花蕾 。制片前以 1mo l /LHC l于 60℃
处理子房 8m in(花药处理 2m in),卡宝品红压片观
察 。用 1%醋酸洋红染色花粉粒 ,在 20 ×显微镜下
观察可染花粉百分率 。
1. 2. 3　AFLP分析　从田间生长的 F2、BC1 、萝卜芥
蓝 、埃芥 、何庆萝卜 、白花芥蓝和黑芥的植株上取幼
嫩叶片 , CTAB 法 [ 13] 提取 DNA。 AFLP (amplified
fragment leng th po lymo rphism)分析程序参照 V os
等 [ 14]的方法进行 , 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,硝酸银
染色检测 。读取清晰的 AFLP带 ,有带记作 1,无带
记作 0,构成分子数据矩阵 ,利用 NTSYS - pc 2. 0生
成聚类图。
2　结果与分析
2. 1　可交配性 、形态特征和育性
2. 1. 1　萝卜芥蓝 ×埃芥 F1和 F2　以萝卜芥蓝为母
本同埃芥杂交 ,授粉 490朵花 ,获得 36粒种子 ,可交
配率为 7. 3%, 13. 9%的种子能够成苗 ,产生 5个植
株。 F1植株形态呈双亲中间类型 ,略偏萝卜芥蓝
(图 1C),叶面有蜡质 ,叶柄和中脉略呈紫色。分枝
似埃芥 ,茎秆略呈紫色 。花白色 ,有花粉 ,平均花粉
活力 9%(图 1E),最高 15%,单株结实 7 ～ 25粒 。
产生 38个 F2植株 ,绝大多数 F2植株形态偏萝
卜芥蓝 ,白花 ,植株高大 ,单株自由授粉结角 107 ～
182个(表 1),角果似萝卜芥蓝 ,分上下两节 ,均含
有种子 ,果面紫色 (图 1K - b),成熟后枝条不下垂
(萝卜芥蓝角果成熟后枝条变软 )。另外 1个 F2植
株 178 - 1出苗迟 ,植株细弱 ,叶似萝卜 (图 1I - c),
叶柄基部紫色 ,花浅紫色 ,高度不育 ,未收获到 F3种
子。
2. 1. 2　埃芥 ×萝卜芥蓝 F1和 F2　以埃芥为母本同
萝卜芥蓝杂交 ,授粉 565朵花 ,收获 362粒种子 ,可
交配率达到 64. 1%。但 F1成苗率较低 (2. 5%),只
形成了 9个杂种 ,植株形态为双亲中间类型 ,略偏埃
芥(图 1 B),叶较埃芥薄而光滑 ,花白色 ,花粉极少 ,
单株结实 4 ～ 17粒。
表 1　F2和 BC1植株的育性及 AFLP指纹特征
Tab le 1　　Fertility and AFLP fingerpr in ts of F2 and BC1 p lan ts
杂交组合
C omb inat ion
株号
Plant No.
株型
Morphology
角果数
N o. of
s iliques
种子数
No. of
seeds
总带
Total
band s
检测到的亲本特异带
Paren ta l sp ecific bands detected
R aphanobrassica B. carina ta
F2(萝卜芥蓝×埃芥) 176 - 2 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 119 607 400 113 114
F2(Raphanobrassica 176 - 6 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 156 842 402 115 113
×B. carina ta) 177 - 5 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 160 928 396 113 112
177 - 8 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 131 720 408 117 114
178 - 1 偏萝卜 L ike Raphano 0 0 469 130 133
179 - 2 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 159 898 400 113 113
179 - 6 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 137 699 382 106 111
180 - 2 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 107 439 393 110 113
180 - 4 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 121 533 397 111 114
F2(埃芥×萝卜芥蓝) 184 - 4 中间类型 In term ed iate 38 106 418 112 125
F2(B. carina ta 184 - 6 中间类型 In term ed iate 62 115 408 116 119
×R aphanobrassica) 184 - 10 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 124 283 398 112 116
185 - 1 中间类型 In term ed iate 77 193 419 118 120
185 - 3 中间类型 In term ed iate 79 205 409 111 120
BC1(埃芥 ×萝卜芥蓝)×埃芥 171 - 1 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 146 303 399 110 119
BC1(B. carina ta 171 - 6 偏萝卜芥蓝 LikeR aphanobrassica 123 252 398 107 122
×R aphanobrassica) 173 - 1 中间类型 In term ed iate 50 101 407 106 121
×B. carina ta 173 - 2 中间类型 In term ed iate 73 164 439 117 125
175 - 1 中间类型 In term ed iate 35 74 437 119 120
　　产生的 24个 F2植株 ,绝大多数形态呈双亲中
间类型 ,白花 ,单株结角 18 ～ 124个 (表 1),角果形
状似萝卜芥蓝。
2. 1. 3　与埃芥回交后代　埃芥 ×萝卜芥蓝 F1植株
与埃芥回交 ,授粉 81朵花获得 31粒种子 ,形成 22
个 BC1植株 ,其中 13个植株形态略偏萝卜芥蓝 ,育
性恢复较好 ,单株结角 109 ～ 157个 ,其余 9个植株
呈萝卜芥蓝与埃芥中间形态 ,叶偏埃芥 ,植株较弱 ,
单株结角 32 ～ 75个(表 2),角果较短 ,喙部含 1 ～ 2
粒种子或不含种子 (图 1K - d)。
382 中国油料作物学报　2006, 28(4)
A.埃芥 , B.埃芥 ×萝卜芥蓝 F1杂种 , C.萝卜芥蓝 ×埃芥 F1 杂种 , D.萝卜芥蓝 , E. F1 花粉活力 , F.体细胞内的 35条染色体 , G.中期 Ⅰ PMC内的 10Ⅱ +15Ⅰ , H.中期Ⅰ 15个未配对染色体 , I～ K. F2及 BC1 与亲本的叶(I)、花序(J)及角果(K)比较:萝卜芥蓝 (a),偏罗卜芥蓝后代(b),
偏萝卜后代(c),中间类型后代(d),埃芥(e)
A. B. ca rina ta;B. B. carinata×Raphanobrassica F
1
hyb rid;C. R aphanobrassica×B. carina ta F
1
hybrid;D. Raphanobrassica;E. pollen viab ility of F
1
hyb rid;F. 2n=35 in F1 ovary cell;G. One metaphase -Ⅰ PMC w ith 10Ⅱ +15Ⅰ ;H. One metaphase -Ⅰ PMC w ith 15 unpaired ch romosom es;I～
K. Leaves(I), inf lorescence (J) and si liques (K) ofRaphanobrassica (a), B. carinata (e), Raphanobra ssica - like p lan t(b), R. sa tivu s- like p lan t
(c) and in term ediate p lan t(d)
图 1　形态学与细胞学特征
F ig. 1　　Morpholog ical and cytologica l character
2. 2　F1植株的细胞学分析
正反交 F1植株子房体细胞染色体数目均为 35
(图 1F),花粉母细胞减数分裂配对构型为 13 ～ 17
Ⅰ +8 ～ 10Ⅱ +2Ⅲ (表 2)。观察了 394个萝卜芥
蓝 ×埃芥 F1花粉母细胞 (PMC), 76. 6%细胞配对成
10Ⅱ +15Ⅰ (图 1G), 15%配对成 9Ⅱ +17Ⅰ , 4. 1%
配对成 8Ⅱ +2Ⅲ +13Ⅰ ,其他配对构型占 4. 3%。观
察了 520个埃芥 ×萝卜芥蓝 F1 PMC s, 71%配对成
10Ⅱ +15Ⅰ , 14. 6%配对成 9Ⅱ +17Ⅰ , 6. 9%配对
成 8Ⅱ +2Ⅲ +13Ⅰ ,其他配对构型占 7. 5%。未配对
染色体不能集中到赤道板上 (图 1H),后期 Ⅰ落后
于两极间 ,染色体桥和落后染色体普遍存在 。
2. 3　F2及 BC1植株的 AFLP分析
10对 AFLP引物组合在埃芥中扩增出 406条
带 ,萝卜芥蓝中扩增出 386条带 ,其中萝卜芥蓝特异
383陈洪高等:萝卜芥蓝异源四倍体与埃塞俄比亚芥属间杂交
表 2　F1植株减数分裂染色体配对模式
Tab le 2　　Chrom osome pa ir ing pa ttern s at d iak ine se /me taphase Ⅰ of F1 p lan ts
株号
Plan tNo.
花粉母细胞数
No. of PMC s
配对构型 Ch romosom e pairing pattern s
9Ⅱ +17Ⅰ 10Ⅱ +15Ⅰ 8Ⅱ +2Ⅲ +13Ⅰ O thers
萝卜芥蓝 ×埃芥 Raphanobra ssica×B. ca rinata
RB1 67 12 42 7 6
RB2 85 19 55 6 5
RB3 105 19 84 1 1
RB4 84 3 77 0 4
RB5 53 6 44 2 1
Total 394 59 302 16 17
Percen t /% 15. 0 76. 6 4. 1 4. 3
埃芥 ×萝卜芥蓝 B. ca rinata×R aphanobrassica
BR1 89 8 74 5 2
BR2 27 9 15 1 2
BR3 93 14 71 4 4
BR4 63 12 40 6 5
BR5 79 7 59 5 8
BR6 61 8 42 7 4
BR7 41 5 29 2 5
BR8 32 4 22 3 3
BR9 35 9 17 3 6
Total 520 76 369 36 39
Percen t /% 14. 6 71. 0 6. 9 7. 5
RR -何庆萝卜 , CC -白花芥兰 , BB -黑芥 , RRCC -萝卜芥蓝 , BBCC -埃芥
RR -R. sa tivus cv H eq ing, CC -B. a lbog labra Bailey, BB -B. n igra, RRCC -R aphanobrassica, BBCC -B. carina ta
图 2　引物 E -ACT M/ -CTC扩增出的 AFLP带型
F ig. 2　　AFLP pa tterns amplified by pr im er comb ination E -ACT M/ -CTC
带 165条 ,埃芥特异带 160条 。同样的引物在 F2及
BC1单株中扩增出 382 ～ 469条带 ,所有单株均检测
到数目不等的亲本特异带 (表 1),证实它们含有双
亲的遗传物质。在 178 - 1中扩增出的总带和亲本
特异带都较其他 F2或 BC1植株多(图 2),表明具有
较高的亲本基因组杂合性。含埃芥胞质的 F2 及
BC1所扩增出的埃芥亲本特异带略多于含萝卜胞质
的 F2植株 ,但是它们的萝卜芥蓝特异带数量没有明
384 中国油料作物学报　2006, 28(4)
显差异 。
2. 4　聚类分析
10对引物在所有参试材料中共扩增出 619条
带 ,全部用于聚类分析 。参试材料在相似系数 0. 63
处聚为 6组 , F2和 BC1独立于亲本及 3个二倍体种
聚为一组 ,并在相似系数 0. 906处再聚成 4个亚组:
来自于萝卜芥蓝 ×埃芥组合的 F2植株 178 - 1明显
不同于其他植株 ,单独聚为 1个亚组;埃芥 ×萝卜芥
蓝的 F2植株聚为 1个亚组;萝卜芥蓝 ×埃芥的 F2
植株与 BC1偏萝卜芥蓝植株聚成 1个亚组;BC1其
余植株聚为 1个亚组 (图 3)。以上结果表明 , F2和
BC1群体具有丰富的遗传多样性 ,由于没有出现与
双亲或与 3个二倍体种 (何庆萝卜 、白花芥蓝和黑
芥)聚为一组的杂种植株 ,进一步表明这些 F2 和
BC1植株还具有高度基因组杂合性 ,是进一步进行
渗入育种的良好材料。
图 3　根据 AFLP数据计算的 Jacca rds相似系数生成的 F
2
、BC
1
、亲本及 3个二倍体种的聚类图
F ig. 3　　Dendrogram of genet ic re lation sh ips of F s and BC1 p lan ts and the ir or iginal paren ts as w ell as
3 d ip loid species based on AFLP data using Jaccards coeffic ient of sim ilar ity( spec ie codes as F ig. 2)
3　讨论
桥梁杂交法可以使不能直接杂交的两个种的基
因组最终组合到一起 ,被广泛应用于存在着严重不
可交配性的属间或种间基因交流。为了将萝卜的细
胞质雄性不育基因或抗根结线虫基因转移到油菜 ,
先合成萝卜与甘蓝之间的异源四倍体 (RRCC , 2n=
36)或萝卜与白菜之间的异源四倍体 (RRAA , 2n=
38),以它们为桥梁与甘蓝型油菜杂交 ,成功地将目
标基因渗入到油菜之中 [ 15, 16] 。为了实现萝卜与埃
芥之间的基因组重组 ,本课题组早期进行了大量的
杂交实验 ,正反交累计授粉 6 887朵花 ,均没有获得
杂种。以萝卜芥蓝异源四倍体为桥梁亲本同埃芥杂
交 ,正反交每授粉 100朵花能获得 1 ～ 2个杂种 ,明
显较萝卜与埃芥杂交的可交配性高。通过自由授粉
或与埃芥回交 ,能够获得 F2及 BC1植株 ,而且部分
植株育性恢复较好 , AFLP检测到这些植株保留着
双亲的大量遗传物质 ,为进一步的研究利用提供了
材料 。萝卜芥蓝与埃芥杂交仍然存在着一些亲和性
障碍 ,如以埃芥作母本时虽然杂种容易获得 ,但杂种
成苗率不高 ,以萝卜芥蓝作母本时的杂种成苗率较
高 ,但较难获得杂交种子。导致这些现象的原因有
待进一步研究 。
Harberd的研究表明 ,埃芥 ×萝卜 F1(RBC , 2n
=26)减数分裂可以形成 2Ⅱ +22Ⅰ至 9Ⅱ +8Ⅰ , R
与 BC基因组之间具有很高的同源性 [ 17] 。本实验
中埃芥与萝卜芥蓝杂交的 F1植株具有预期的染色
体数目(CCBR, 2n=35),花粉母细胞减数分裂过程
中染色体主要配对构型为 10Ⅱ +15Ⅰ ,而不是预期
的 9Ⅱ +17Ⅰ ,其中 C基因组的 18条染色体可形成
385陈洪高等:萝卜芥蓝异源四倍体与埃塞俄比亚芥属间杂交
9个二价体 ,推测 R(或 B)基因组内部或 R与 B基
因组之间可能有 1对染色体高度同源 ,并能够稳定
配对。同时还观察到三价体和其他多价体存在 ,这
些多价体有可能也是部分同源配对的产物 ,它们的
存在是遗传物质渗入的基础。
F2和 BC1群体形态分离出偏萝卜芥蓝 、偏萝卜
和双亲中间形态 3种类型 ,不同类型之间育性差别
较大:偏萝卜芥蓝植株育性恢复较好 ,中间形态植株
次之 ,偏萝卜植株高度不育 。 AFLP带型分析表明 ,
不同类型的植株之间只有少量带型的差异 。聚类分
析发现 , 3种类型都没有出现与萝卜芥蓝或萝卜聚
到一组的植株 ,表明形态类似于萝卜芥蓝或萝卜的
植株 ,其遗传组成实际上同萝卜芥蓝或萝卜明显不
同 。李再云 [ 18 ]等在甘蓝型油菜与诸葛菜 (Orycho-
phragmus violaceus L. , OO , 2n=24)属间杂交后代中
观察到形态类似于白菜型油菜的植株 (2n=31),通
过基因组原位杂交检测到多达 6对诸葛菜染色体 。
因此 ,杂种后代表型的显著分离可能是少数染色体
或基因的差异所导致 。对这些材料的进一步研究将
有助于阐明杂种后代育性恢复的机理 。
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Intergener ic hybr id ization between amphidip loid Raphanobrassica and Brassica carinata
CHEN Hong -Gao, WU Jiang - Sheng, LIU Ke -De, CHENG Yu -Gui, LIU Chao
(NationalKey Laboratory ofCrop Genetic Improvement, Sub -Cen ter ofNa tional Rapeseed Improvement,
Huazhong Agricu ltureUniversity, Wuhan 430070, China)
Abstract:Reciprocal crosses w ere made be tw een artificia lly synthesized amphidip lo id Raphanobrassica
(RRCC , 2n=36) andB. carinata. C ro ssability percentage of Brassica carinata ×Raphanobrassica was 64. 1%
but on ly 7. 3% fo r the reciprocal cro ss. A ll F1 p lants w eremorpho logica lly intermediate to their paren ts and had 2n
=35 as expected. The chromosomesma in ly paired as 10Ⅱ +15Ⅰ in po llenmo ther ce lls. Among 62 F2 plants and
22 BC1 plan ts a fte r backcro ssing to B. carina ta , some w ere inte rmedia te to the o rig inal parents, o thers w ere more
likeRaphanobrassica. The paren tal genome spec ific AFLP bands w e re de tec ted in all F2 and BC1 plants studied.
C luster ana ly sis suggested that the se F2 and BC1 plan tsw e re separated from their parental g roup, and had a sim ilar
gene tic background.
Key words:Raphanobrassica;Brassica carinata;Intergeneric hyb rid;Morpho logy;Cyto logy;AFLP
387陈洪高等:萝卜芥蓝异源四倍体与埃塞俄比亚芥属间杂交