全 文 ：农业生物技术学报 J ouma l of Agr i e u l tura i l Boe tehn ol og y2 0 00 , 8 (2 ): 16 1一 164
· 研究报告 ·
南瓜属三个种的亲缘关系与品种的分子鉴定研究*
李海真 ’ 许 勇 ’ 武峻新 ’ 王永健 ’ 郭 军 ’
( l 山西农科院蔬菜所 , 太原 03 00 3 1: 2 北京市农林科学院蔬菜中心 , 北京 1000 8 0 ;
寿森炎 ’
3 浙江大学园艺系 , 杭州 3 10 02 9 )
摘要 : 用随机扩增多态 D N A ( RA PD ) 技术 , 对南瓜属 ( C “ `曰心l’at ) 三个主要栽培种即美洲南瓜 (C 沐尹 ) L ) 、 中国南
瓜 ( C m o s c h a 臼 .D ) 和印度南瓜 (C m
~
D
.
) 的 23 个品种 (系 ) 及种间杂交后代进行亲缘关系与品种 (系 ) 的分子鉴
定研究。 从 2 00 个随机引物 ( 10 b)P 筛选出 17 个引物 , 对 23 个南瓜品种 (系 ) 的染色体组 D N A 进行 P C R 扩增 , 共产生 80
条扩增带 , 其中 ” 条在南瓜属 三个种间表现出差异 , 可作为遗传标记 ( RA P D 标记 ) 。 RA P D 技术对三个种墓因组 的分析结
果与传统分类学的结果完全相符 , 同时 R A PD 技术对南瓜属种内不同品种 (系 ) 问的亲缘关系的分析结果与其地域来源和形
态特性墓本符合 。 大部分南瓜品种 (系 ) 都有其特有的扩增带可与其它品种 (系 ) 区别开来 , 这种特异的条带可作为一个品
种的分子标记应用于 品种鉴定和分类 。
关键词 : 南瓜属 (〔公` 口动 iat ) ; 随机扩增多态 D N A ( R A P D ) ; 亲缘关系 ; 品种鉴定
S ut di e s o n G e n e t i e eR lat i
o n s h iP s a n d M
o l e e u la r Id e in i if c a t io n o f T hr e e M a in
C u lt i v at e d S P e e ie s in uC
e ur b1’ at
L 1 H a i z h e n
’
X u OY
n g
,
W
u Ju n x i n
,
Wa
n g oY
n
gj ian
,
G u o Ju n
,
s h o u S e n y a n
,
( 1 I
n s ti tu et o f Ve g e abt l
e , Sh an x i A e ad e m y o f A g ir e u ltu ar l S c ie n e e s
,
aT i y u an 030 03 1; 2 Ve g e t a b le R e s e ar e h C e n et r, B e ij in g A g r i c u l tu ar l
a n d of er s ytr A
e a d e m苏 B e ij in g 10 00 89 ; 3 H o rt i e n lt u r a l D e p art m e n七 Z hej ian g U n iv e r s i yt, H an g z h o u 3 10 02 9 )
A b s t r a e t wT
e n yt
一
th er e e u lti v ar s ofr m th er
e m a i n ly e u ltiv a t e d s ep
e i e s ( C P叼庆 , L . , C m os hC a at D . an d C m a 大刀刀 a D · ) i n
〔公` “ 币I’at w e re te s te d w it h RA P D (R an d o m am Pli if e d op ly m o rp h i e DN A ) u s i n g l 7 arb it r ary l o 一 m e r P r im e r s w h ie h w e re s e re e n e d ofr m
200 P r im e r s
.
T h e le v e l o f op ly m o rp h i sm w i th in e u l tiv ars w as
v e ry h ig h
.
A m o n g a ot at l o f 80 b an d s o b s e vr e d
,
77 (96 2 5 % ) b an d s
w e er po ly m o pr h i c in th e 23 c u l t iv ar s e x am i
n e d
.
T h e s e m ar k e sr w e er e n o u g h ot d is ti n g u is h e ac h o f th e s pe e ie s u se d
.
G e n e t i c d i sant
e e s
be wt e e n e ac h o f th e e u lt iv ar s w e er c a lc u l at e d for m
s i m P le m at e h in g e o e if e e n t s
.
A d e n d r o g r am
s h o w i n g g e n e t ie er l at io n s h i PS be Wt e e n
t h e m w as e o n d u c et d b y an
u n w e ig h te d Pa i -r g r o u P m e th o d w ith ar i th m e t ie a l a v e agr
e s (U P GM A )
.
hT i
s e o n e lu s io n 15 e o m P le et ly e o n s i s et n t
w it h th e t r a d it io n a l e u l ti v ar e las s i if e at io n an d fu n d am
e n t a lly i d e n t ie a l w iht th e ir o ir g in s an d e h ar ac et r i s t ie s
.
M o st o f th e e u lt iv ar s h ad
t h e ir s pe e i if e ban d
s w h ie h w e er a v a i lab le ot i de n t i fy in g d ife er n t e u l tiv asr i
n the ge n u s uC
c u br i at
·
K e y w o r d s : uC
e u br I’at ; r an d o m am p li if e d 即 lym o 甲 h i e D N A ( R A p D ) : g e n e ti e er lat io n s h ip : id e n t iif c at io n o f e u l tiv ar s
美洲南瓜 (C P eP o L ) 、 中国南瓜 (C m os hc a at
.D )和印度南瓜 (C m
~
a .D )是南瓜属 (〔公` “劝了纽 )
3 个主要的栽培种 , 在世界各地广泛栽培 , 品种资
源也十分丰富 。 有关这 3 种的亲缘关系 已在形态学、
细胞遗传学与同工酶水平进行过分析 ’`刀 , 但是在分
子水平进行南瓜属的分类以及种内品种间的亲缘关
系的研究还未见报道 。 随机扩增多态 D N A (R A P D )
技术以其操作简单 、 成本低 , 且无需对物种进行任
何分子生物学研究的情况下对基因组的遗传差异进
行分析等优点 , 被广泛应用于多种蔬菜作物的亲缘
* 山西省青年科学基金资助项目
收稿日期: 19 9 9 · 1 1 一 1 1
关系研究 ’ 3月 ,。
本研究利用 RA P D 技术对南瓜属 3 个种的 23
份品种 (系 ) 及种间杂交后代进行遗传亲缘关系分
析 , 以期揭示不同种之间以及 同一种内不同品种之
间的亲缘关系 , 寻找 3 个种及其品种的 D N A 特征
谱带, 以便从分子水平出发进行南瓜品种的鉴定和
分类 。
1 材料与方法
1
.
1 试材 供试材料为南瓜属 3 个种的 23 个品种
(系 ) 及种间杂交后代 (见表 l ) , 其中地方品种和
农家品种中的突变材料以及从国外引进的品种 , 均
为山西农科院蔬菜所多代自交纯化的稳定的自交系 。
农 业 生 物 技 术 学 报 20 0()
用 2 0 株幼苗的混和嫩叶 .0 5 9 提取 D N A 。
表 l 供试南瓜属 ( uC e “ br iat ) 品种 (系 )
aT b l e 1 C u lt iv ar s i n 〔 b c切心i勿 u s e d in ht e e x ep ir m e n t s
编号
N O
品种名称
C U! t iv a r
类型与特征
E c o yt ep nA d C h
a
acr et
r
来源
Or ig i
n
2
3
4
5
6
7
8
9
l 0
l l
l 2
l 3
l 4
l 5
l 6
l 7
l 8
l 9
2 0
2 l
2 2
2 3
52 A
一
6
一
9 美洲南瓜 , 裸仁 山西省临德县地方品种中发现
52 A
一
6
一
7 美洲南瓜 , 有皮 山西省临德县地方品种中发现
早青一代 (F : ) 美洲南瓜 山西农科院蔬菜所选育
阿太一代 ( F ) 美洲南瓜 山西农科院蔬菜所选育
阿尔及利亚西葫芦 美洲南瓜 , 花叶 阿尔及利亚
太原大黑皮 美洲南瓜 , 黑皮 山西太原
l
一
1 印度南瓜 日本
4
一
6 中国南瓜 日本
川 4 6 1一 1 1x 4 · 6 ( F , ) 山西农科院蔬菜所
爱比绿 印度南瓜 日本
次绿南瓜 印度南瓜 日本
黑皮甘栗 印度南瓜 , 黑皮 日本
芳香青皮栗 印度南瓜 日本
内蒙南瓜 印度南瓜 内蒙古
矮生南瓜 10 号 中国南瓜 山西农家品种中发现
5 16 18 ( 14
x
I S )
x
l 4
,
B C
, 山西农科院蔬菜所
矮 8 中国南瓜 山西农家品种中发现
太谷南瓜 中国南瓜 山西太谷
17 18 18 ( 1 7
x
l s )
x
l s
,
B C
. 山西农科院蔬菜所
17 10 10 ( 17
x
l o )
x
lo
,
B C
; 山西农科院蔬菜所
大粒裸仁南瓜 中国南瓜 , 粒大 , 裸仁 山西农科院冼菜所
15 2 12 1 ( I s
x
Z I )
x
Z I
,
B C
Z 山西农科院蔬菜所
卡宝南瓜 中国南瓜 美国
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 D N A 的提取方法 参照许勇等 7`J 快速提取
D N A 的方法 , 最后将 D N A 浓度稀释为 25 n创林L 的
工作液。
1
.
.2 2 D N A 扩增反应体系 总反应体系为 25 林L,
包括 2 . 5林L p C R缓冲液 (rT i s一 H C I ( PH S . o ) 10 m m o l /
L
,
K C I 5 0 m m o l几 , M g C 12 2 . 0 m m o l几 ) , 4 种核普
酸各为 1 0 0 m m o比 , 1 5 n g 引物 , SO n g 模板 D N A ,
1
.
0 单位的 aT q D N A 聚合酶 , P C R 仪为美国 P E 公
司生产的 P E一 4 8 0 扩增仪 , 引物与 dN T P 购 自上海生
工公司 , aT q D N A 聚合酶购 自北京泰克金公司 。 P C R
反应程序为: 94 ℃ 预变性 3 m in , 94 ℃变性 30 5,
3 7℃复性 3 0 5 , 7 2 ℃延伸 2 m i n , 循环 3 5 周 : 最后
7 2℃延伸 7 m i n 。
1
.
.2 3 电泳检测与数据分析 反应产物在含 .0 5 林留
m L E B 的 1 . 5 %琼脂糖凝胶中电泳分离, 紫外灯下
观察结果并照相 。 以入D N A汪无O RI + H i’n d m 为 “相对
分子质量” 标记 。 RA PD 条带的有无计为 甲 和
“ 一 。 材料间的遗传相似度 ( s i m p l e m at c h i n g 。 o e仁
if ic en )t 用 s s m 表示 , 采用 U GP M A 法进行聚类分
析 。 其中 s m = a/ a + b , a 为两个品种均为 甲 或均
为 “ 一 ” 的条带总数 ; b 为两个品种分为 甲 和
“ 一 ” 的条带总数。
2 不同引物的扩增结果
2
.
1 不同引物的扩增结果 R A PD 技术的主要缺点
是稳定与重复性差 , 为克服这一缺点 , 本实验首先
保证整个实验过程中 PC R 反应体系的一致性 , 并使
用高质量 几口D N A 聚合酶 , 同时筛选重复性好的扩
增引物 。 实验筛选 2 0 0 个 O ep or n 公 司的随机引物 ,
最终获得 17 个引物在南瓜属 3 个种的基因组 D N A
上可扩增出有差异条带 , 且条带清晰 , 稳定 , 可重
复性强 。 17 个引物在 2 3 份南瓜品种上共获得 80 条
扩增带 , 其中 7 条表现多态性 , 占总数的% .2 5 % 。
其中 3 条为全部检测品种所共有 ( O PA 2I 0/ 20 o bP 、
o以 12 0 / l 卯 0 b p 、 o 队 16 2/ 0 2 7 b p ) , 在一定程度上
表现出各品种间的同源性 。 每种引物获得的扩增带
数从 3 条 ( o PA 12 o , O PA o l , O p B o s , O CP o l , o 咫 10 )
到 7 条不等 (O RA J3 , O PD 10 ) , 平均为 4 . 7 条。 扩增
片段的大小以 50 b p 到 2 0 2 7 b p 不等 。
表 2 实验所用的引物及其序列
aT b le Z T h e P r im e r s u se d in am Pli if
e at io n an d ht e i r se q u e n e e s
引物号 序列 5 , , 3’ 引物号
P r im e r N o
O PC 14
O PD 10
O队2H
O PA H 19
O】叭】4
O PA】6
序列 5’ 闷 3’ , 引物号 序列 5 ’ 一 3 ,
P n m e r N O
0 1熟入0 1
O P B 0 5
O P ( 0 1
O P ( 0 7
0 1
〕
C 0 9
O P〔 : 10
S e q u e n e e s
, ` 3 ,
C A G G C C C T T C
T G C G C C C T f C
1丁 C G A G C C A G
G T C C C G A C G A
C T C A C C G T C C
TG T C T G G G T G
S eq
u e n e e 5
工 、 3 ,
T G C G T G C T I, G
C G T C I人 C A C C
C A C T T C C G C T
C G C A G T I
,
C T C
C l诵J C C T G C C
T G C C G C A C I
, 】,
P r lm C r N o
O P A 12 0
O PA J Z
O PA J 3
O PA J4
O PA」8
S e q u e n e e s
’ 动 3 ,
C C T G T TC C C T
T C G C A C A G T〔:
A G C A C C T C G T
G A A T G C G A C C
G T G C TC C C T C
.2 2 扩增产物的特异性 在不同引物的扩增产物中,
仅个别种或品种在某一片段长度处有条带出现 , 这
种其它种或品种所不具备的特异条带可作为该种或
品种的特殊标记 。 本实验结果表明 (见图 1) : 南瓜

农 业 生 物 技 术 学 报 2 00 0年
(矮 8 ) 与 18 (太谷南瓜 ) 亲缘关系较近 , 19 ( 1 7 18 18 )
是 17 (矮 8) 与 18 (太谷南瓜 ) 的回交第一 代 ( 18
为回交亲本 ) , 因此这 3 个品种表现出较近 的亲缘关
系 , 上述实验 结果与传统回交育种的结果是一致的 。
23 (卡宝南瓜 ) 是美国引进的中国南瓜类型 , 其与
1 7
、
15
、
1 9
、
2 一、 2 2 有较远的亲缘关系 , 叶片特征
是表面没有白色斑点 , 而大多数来源于中国农家品
种的中国南瓜类型均在叶面上有白色斑点 。 8 (4 一6)
在聚类图上与同类品种间亲缘关系较远 , 其来源于
日本 , 且特别早熟 , 形态特征和其它中国农家品种
类型也有较大差异 , 可见分子水平的分类结果再一
次支持了形态和地域上的分类 。
在类群 1 中 , 包括 7 、 10一 14 等 6 个印度南瓜
品 种和 9 、 16 、 20 等 3 个印度南瓜类型与中国南瓜
类型的回交后代 , 可视为印度南瓜类群 。 在这一 类
群 中 , 10 (爱比绿 ) 、 11 (次绿南瓜 ) 、 12 (黑皮甘栗 ) 、
13 (芳香青皮栗) 有较近 的亲缘关系 , 这 4 个品种
均是从 日本引进的印度南瓜类型 , 14 (内蒙南瓜 )
也为印度南瓜类型 , 是内蒙古的地方品种 , 从聚类
图上可看出 , 它与上述 4 个品种有较远的亲缘关系 ,
从而在分子水平上说明了不同地域来源的品种间存
在亲缘关系远近的差异 。 16 ( 5 16 18 ) 为 14 (内蒙
南瓜 ) 与 15 (矮 10 ) 的第 3 代回交后代 ( 14 为回
交亲本 ) , 2 0 ( 一7 10 10 ) 为 1 7 (矮 8 ) 与 10 (爱比
绿 ) 的第四代回交后代 ( 10 为回交亲本 ) , 这 2 个
品种由于多代回交的作用 , 使它们具有较多的回交
亲本即印度南瓜类型特点 , 因此被聚集在此类群 中。
9 为 7 ( 】一 1 , 印度南瓜 ) 与 8 ( 4一 6 , 中国南瓜 ) 的
杂交一 代 , 由聚类分析可知 , 它与其母本 7 ( l 一 1 ,
印度南瓜 ) 的亲缘关系较近 , 因此聚在该类群中。
3 讨论
从本实验 的结果来看 , 可将南瓜属 的 23 个品种
分为 3 个类群 , 即传统分类的 3 个种 , 这 3 个种之
间的亲缘关系为 : 美洲南瓜与中国南瓜亲缘关系最
近 , 印度南瓜与中国南瓜次之 , 而美洲南瓜与印度
南瓜较远 。 这与前人在形态学与细胞遗传学上 的研
究结果是一致的 2` , 。 漆小泉 l月 等曾对南瓜属 3 个种
进行过氧化物酶和醋酶同工酶分析 , 也同样得到了
3 个种的亲缘关系远近 的结果 , 但种内品种间的遗
传关系的差异未被 鉴定出来 。 本实验采用 R A P D 技
术不仅准确地分析了南瓜属 3 个种间的亲缘关系 ,
而且也对种内不 同品种 (系 ) 间的遗传关系进行 了
较为详细的分析 , 其分析结果与其地域来源和品种
形态特性基本符合 , 其中某些特征条带可以作为品
种转育过程中的血缘控制来加以利用 , 这表明 R A P D
技术与同工酶电泳技术相比更能反映品种间的遗传
差异与亲缘关系 。 在本实验的结果也发现一些突变
体材料如: 裸仁与矮生 , 与原始品种的亲缘关系较
近 , 尚未发现较多的特异条带。 传统的遗传分析认
为裸仁与矮生均由单基因控制 `咧 , 综合分析可以初
步认为这些突变体只是可能在原品种类型的基 因组
上发生了点突变。 进一步加大引物筛选 , 并采用多
态性更为`丰富的分子标记技术 , 将有可能获得与突
变体性状连锁的遗传标记 , 这也是本实验室正在进
行的一项研究工作 。 本实验结果将为南瓜杂交育种
过程的血缘遗传控制与亲本选配以及研究其物种起
源和演化 , 提供技术与理论基础 。
参 考 文 献
1漆小泉 , 东惠茹 , 胡是林 , 等. 南瓜属三个种过氧化物酶和
醋酶同工酶分析 . 园艺学报 , 1 989 , 16 (4 ) : 2 9 9一 304
2 中国农业科学院蔬菜研究所 . 中国蔬菜栽培学. 农业出版社 ,
19 8 7 : 5 6 7一 5 7 1
3 漆小泉 , 朱德蔚 , 等 . 大白菜和紫菜墓自交染色体组 D N A
的 PA PD 分析 . 园艺学报 , 19 9 5 , 22 ( 3 ) : 256一 262
4 K le in
·
l an k h o r s t RM
,
v e rm
u n t A
. 认七i d e R , e t a l . l s o lat io n
o f m o le e u la r m a rk e r s fo r to m a t o ( L
.
cs
u j己 n t u m ) u s in g r a n d o m
am Pl iif
e d po ly m o rp h ie D N A (RA PD )
.
T h e o r A a P PI eG
n e t
,
19 9 1
,
8 3 : 8 3
一 10 8
5 J a i
n A
,
B n a t ia s
.
B a n g a 5 5
, e t a l
.
P o t e n t ia l u s e o f
r a n d o m a m
P liif e d Po ly m o rp h ie DN A (R A P D ) te e hn iq u e to s t u dy t h e
g e n e tic d iv e r s i ty in I n d ia n m u s ta r d (B 厂呈 ss cal
`
ju
n c e a ) a
n
d i t s
re la t io n
s h iP t o h e t r e o s i s
.
T h e o r A P PI G e n e t
,
19 94
,
88 : 116一 12 2
6 T h o rm an C E
.
F e r re ir a M E
.
C am agr
o L E A
.
e t a l
,
C o m Pair s o n
o f R F L P a n d R A P D m a r k e r s to e s t im at in g g e n e t ie er ]a t io n s h iP s
w it h i n a n d am
o n g C ru e ife r o u s s Pe e i e s
.
T h e o r A PPI g e n e t
,
199 4
,
8 8 : 97 3
一
98 0
7 许勇 , 欧阳新星 , 张海英 , 等 . 西瓜黄瓜快速简单 R A P D
技术的研究 . 见 : 侯喜林 , 常有宏 主编 . 园艺学进展 ( n ) .
南京 : 东南大学出版社 , 1 998 : 45 7一 462
8 周祥麟 . 裸仁南瓜的育成及其遗传性研究 . 园艺学报 , 198 7,
1 4 (2 )
: 115一 1 18
9周祥麟 , 李海真 . 中国南瓜无蔓性状的遗传性及其生产利用
的研究 . 山西农业科学 , 19 9 1 , ( l ) : l一6