全 文 ：环 境 昆 虫 学 报 Journal of Environmental Entomology，July 2015，37 (4) :785 － 789 ISSN 1674-0858
doi:10. 3969 / j. issn. 1674 － 0858. 2015. 04. 13
鱼藤属植物内生真菌的分离及杀虫活性研究
孙 涛* ，孙之潭* ，胡美英，钟国华＊＊
(华南农业大学昆虫毒理研究室，广州 510642)
摘要:本文是以毛鱼藤、白花鱼藤、蜜花鱼藤 3 种鱼藤属植物为试验材料，分离筛选代谢物具有生物活性的内
生真菌菌株。通过组织分离法，从 3 种鱼藤属植物中分离得到 4 株代谢表现旺盛的内生真菌菌株。杀虫活性实
验表明:4 种内生真菌的代谢产物对松材线虫都具有一定的毒杀作用，其中青霉菌的代谢产物活性最高，48 h校
正死亡率达 90%以上。4 种内生真菌中，只有青霉菌的代谢产物对家蚕 4 龄幼虫具有触杀活性，1. 5 mg /头剂量
处理时，24 h校正死亡率即达到 100%。
关键词:鱼藤;内生真菌;代谢产物;家蚕;松材线虫
中图分类号:Q965. 9;S476. 12 文献标识码:A 文章编号:1674 － 0858 (2015)04 － 0785 － 05
基金项目:广东省自然科学基金 (05006634)
* 表示并列第一作者
作者简介:孙涛，男，1989 年生，河北沧州人，硕士研究生，主要从事农药毒理与应用研究，E － mail:nkxsuntao@ 163. com
＊＊通讯作者 Author for correspondence，E － mail:guohuazhong@ scau. edu. cn
收稿日期 Ｒeceived:2015 － 04 － 20;接受日期 Accepted:2015 － 05 － 25
Isolation and insecticidal activity of endophytic fungi in Derris
SUN Tao* ，SUN Zhi-Tan* ，HU Mei-Ying，ZHONG Guo-Hua＊＊ (Laboratory of Insect Toxicology，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)
Abstract:Derris elliptica Benth．，Derris albo － rubra Hemsl． and Derris thyrsiflora Benth． were taken as
experimental material to isolate endophytic fungi which had bioactive secondary metabolites. 4 strains of
metabolic vigorously endophytic fungi were obtained and their insecticidal activity were investigated. The
result indicated that the secondary metabolites of 4 strains of endophytic fungi in Derris had toxic effect on
Bursaphelenchus xylophilus N. The metabolites of Penicillium sp． showed the more significant activity
than others， the corrected mortality rate reaching over 90% within 48 hours. Moreover， only the
metabolites of Penicillium sp． showed larvicidal efficiency against 4th instar larvae of Bombyx mori L. the
corrected mortality rate reaching 100% at the dosage of 1. 5 mg / larva.
Key words:Derris;endophytic fungi;metabolites;Bombyx mori L. ;Bursaphelenchus xylophilus N．
鱼藤，别名毒鱼藤，篓藤。为蝶形花科
Papilionoideae鱼藤属 Derris 多年生木质藤本植物，
产于亚洲热带和亚热带地区。鱼藤属共有 70 多
种，我国有 20 多种，产于西南部经中部至东南部
(娄予强等，2010)。鱼藤属植物具有抗氧化、抗
癌、抗菌、降血糖、镇痛等功能，在医药领域发
挥着重要的作用 (杨巡纭等，2013)。鱼藤属植物
根部含有一种重要的活性成分———鱼藤酮类化合
物，其具有较广的杀虫谱，其毒性对农作物安全，
对哺乳动物低毒，是一种比较理想的植物源农药
(张庭英等，2005)。目前鱼藤酮主要从鱼藤的根
中提取，大量提取会造成鱼藤植被的破会，生态
环境的恶化，而人工种植周期长，占用大量土地，
组织培养的费用又较高，很难应用于农业生产实
际。因此寻找可替代鱼藤的新型生物资源具有极
其重要的意义。
植物内生真菌是指在其生活史一定阶段或全
部阶段生活在健康植物组织或器官内部，而被侵
环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 37 卷
染的宿主植物并不表现出明显病症的一类真菌
(Stone et al. ，2000)。内生真菌长期生活在植株体
内的特殊环境中并且与其协同进化，一方面植株
为其提供生长必需的能量和营养;另一方面内生
真菌又通过自身的代谢活动或者信号传导作用对
植物 体 产 生 影 响 (Zou et al. ，2000;石 瑛，
2010)。现代内共生理论认为，植物与内生真菌在
长期的协同进化过程中，生物化学途径的连续演
化会导致信息物质在内生真菌与宿主间的相互传
递 (邵爱娟等，2001)。大量研究表明植物内生真
菌的次生代谢产物极为丰富，具有多种生物活性，
如杀虫、抑菌、调节植物生长等，其中某些产物
与宿主的次级代谢产物相同或相似 (杨春平等，
2005)。内生菌的特殊生境决定了其次级代谢产物
的独特性。研究显示，51%的从植物内生真菌分
离的生物活性物质是以前没有发现的化合物
(Strobel，2003)。因此，利用植物内生真菌开发新
药源具有极大的可能性。本文是以毛鱼藤 Derris
elliptica Benth．、白 花 鱼 藤 Derris albo － rubra
Hemsl．、蜜花鱼藤 Derris thyrsiflora Benth． 3 种鱼
藤属植物的内生真菌为研究对象，从中分离筛选
代谢产物对昆虫具有生物活性的内生真菌。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株
本论文中的鱼藤内生青霉菌株 Penicillium sp.
及其他菌株均为作者从华南农业大学昆虫毒理研
究室杀虫植物标本园内的毛鱼藤、白花鱼藤和蜜
花鱼藤中分离得到。
1. 2 供试昆虫及饲养
家蚕 Bombyx mori L. :由华南农业大学蚕丝科
学系提供 3 龄家蚕幼虫，在实验室里 (温度 25℃
±1℃，相对湿度 70%) ，把家蚕放在托盘中以桑
叶饲养，待长到 4 龄供试。
松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus N. :供试
松材线虫分离于广东省东莞市樟木头镇病区松树。
在 25℃ ± 1℃ 培养箱中以玉米培养盘多毛孢
Pestalotia sp. 15 d 后，用改良贝曼漏斗法分离线
虫，通过 100 目筛后收集于 500 目筛，用无菌水冲
洗两次，配成约 10000 条 /mL线虫液备用。
1. 3 培养基
固体培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基
(PDA) ，马铃薯 200 g;葡萄糖 20 g;琼脂 20 g;
水 1000 mL;pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸
2 min，打浆 1 － 2 min，冲洗打浆机，再加葡萄糖
和琼脂，溶化后补足水至 1000 mL。
液体培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基
(PD)。
1. 4 内生真菌的分离、纯化和培养
采用内生真菌常用的分离方法:采集新鲜供
试植物的根和嫩枝，进行表面消毒。首先分别以
自来水和无菌水冲洗 3 － 4 次，然后用 75%酒精漂
洗 (5 － 15 min) ，用无菌水冲洗 3 － 4 次，再置于
次氯酸钠溶液 (有效氯体积分数为 10%)漂洗
1 min，最后用无菌水冲洗 4 次。在超净工作台上
将消毒过的植物组织切割成 0. 5 cm2 × 0. 5 cm2小
片，移入 PDA 平板上，于 25℃培养箱中恒温培
养。3 － 5 d 待植物样品边缘长出菌丝体后，根据
菌丝体的形态特点 (包括菌丝体的颜色、形状和
质地等) ，采用尖端菌丝体挑取法对不同菌株进行
分离纯化。采用组织印迹法检验植物组织的灭菌
效果:即将消毒而未切割的植物组织与固体平板
接触 3 － 5 min，培养 3 － 5 d，根据平板上菌落的有
无判定分离结果的有效性 (Sturz et al. ，1997)。
内生真菌的液体培养采用采用摇瓶发酵法。
将纯化菌株在无菌条件下接入装有 150 mL PD 培
养基的 500 mL三角瓶中，将其置于摇床中 (25℃
－28℃，ＲH = 75% － 85%，L∶ D = 12 ∶12)培养，
摇床转数 120 r /min，培养 7 － 9 d。
1. 5 内生真菌活性物质提取
用 100 目筛将菌丝体由发酵液滤出，置于
45℃烘箱中鼓风烘干，得干菌丝体。菌丝体中加
入 10 倍体积 (V /W)的甲醇冷浸提取，置于避光
暗处，冷浸每次持续 48 h 以上，浸提三次，提取
液合并，减压浓缩得粗提物。
1. 6 对家蚕的生物活性测定
采用点滴法:供试样品用丙酮稀释，用微量
点滴仪将稀释液点滴于家蚕试虫的前胸背板，对
照组点滴丙酮。4 龄试虫点滴 5 μL。处理后加入新
鲜的桑叶，分别于 24 h、48 h 检查试虫的生存和
死亡头数，按下列公式计算死亡率和校正死亡率。
计算公式如下:
死亡率 (%) = 死亡数
供试虫数
× 100
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4 期 孙 涛等:鱼藤属植物内生真菌的分离及杀虫活性研究
Abott公式:
校正死亡率(%)=处理组死亡率 －对照组死亡率100 －对照组死亡率
×100
1. 7 对松材线虫的生物活性测定
采用浸渍生测法:加 1. 5 mL 无菌水 (含 5%
丙酮 V /V)样品稀释液于直径为 3 cm 小培养皿
中，然后加入供试线虫 30 － 50 头，每处理设 3 个
重复，另设 5%丙酮溶液为对照。同一处理放入直
径为 9 cm的培养皿内，置于 25℃培养箱中。分别
于 24 h和 48 h用针刺法检查试虫的生存和死亡个
数，按 1. 6 的公式计算死亡率和校正死亡率。
2 结果与分析
2. 1 毛鱼藤等鱼藤属植物内生真菌的分离和初步
鉴定结果
对毛鱼藤、白花鱼藤、蜜花鱼藤等鱼藤属植
物根和茎的内生真菌进行了分离，根据其菌落形
态和孢子、分生孢子梗着生状态等，对所分离纯
化的部分内生真菌进行了初步鉴定，初步鉴定结
果见表 1。由于部分内生真菌在 PDA 培养基上不
能诱导产孢，难以用经典形态学的方法进行菌种
鉴定，因此未能全部列出。
表 1 鱼藤属植物内生真菌初步鉴定结果
Table 1 Preliminary identification results of endophytic fungi isolated from the Derris
供试植物 Tested plants 分离部位 Separated position 内生真菌种类 Species of endophytic fungi
毛鱼藤 Derris elliptica Benth．
根和茎
Ｒoot and stem
炭 疽 菌 Colletotrichum、青 霉 Penicillium、镰 刀 菌
Fusarium 、木霉 Doryalis、曲霉 Aspergillus、拟茎点霉
Phomopsis 、脉孢霉 Neuropara、黄曲霉 Aspergillus flavus
白 花 鱼 藤 Derris albo － rubra
Hemsl．
根和茎
Ｒoot and stem
镰刀菌 Fusarium、拟青霉 Paecilomyces Bainier
蜜花鱼藤 Derris thyrsiflora Benth．
根和茎
Ｒoot and stem
青霉 Penicillium、镰刀菌 Fusarium 、曲霉 Aspergillus、
黄曲霉 Aspergillus flavus
2. 2 内生青霉等真菌甲醇提取物对松材线虫的生
物活性
采用浸渍生测法，对鱼藤内生青霉和另外3 株
代谢表现旺盛的炭疽属、拟茎点霉属和黄曲霉属
内生真菌的菌丝体甲醇提取物进行了生物活性测
定，结果见表 2。从表中可以看出，4 种内生真菌
中以青霉菌的代谢产物对松材线虫的毒杀效果最
强，处理 24 h 和 48 h 后的校正死亡率分别为
85. 60%和 93. 24%，与其他内生真菌代谢产物的
生物活性差异显著。
表 2 4 种内生真菌代谢产物对松材线虫的毒力
Table 2 Toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against Bursaphelenchus xylophilus N.
处理
Treat
24 h (X ± SE) 48 h (X ± SE)
死亡率 (%)
Mortality rate
校正死亡率 (%)
Corrected mortality rate
死亡率 (%)
Mortality rate
校正死亡率 (%)
Corrected mortality rate
青霉菌 Penicillium 86. 68 ± 3. 73 85. 60 ± 4. 03 a 93. 98 ± 7. 40 93. 24 ± 8. 31 a
炭疽菌 Colletotrichum 41. 18 ± 2. 55 36. 44 ± 2. 76 b 45. 95 ± 7. 86 39. 33 ± 8. 82 b
拟茎点菌 Phomopsis 14. 06 ± 0. 87 7. 13 ± 0. 94 c 16. 99 ± 1. 85 6. 81 ± 2. 08 c
黄曲霉菌 Aspergillus flavus 10. 42 ± 1. 62 3. 20 ± 1. 75 c 13. 30 ± 2. 96 2. 67 ± 3. 32 c
对 照 CK 6. 18 ± 0. 38 7. 55 ± 1. 23
注:4 种提取物的浓度均为 2. 50 mg /mL，以上结果为 3 次重复平均值 ±标准误，同列数据后标不同小写字母者表示在 5%
水平差异显著。Note:The concentration of four kinds of extract is 2. 5 mg /mL. The data in the table are mean ± SE. Data in the
same column with different small letter in the same column are significantly different at P ＜ 0. 05.
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环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology 37 卷
2. 3 内生青霉等真菌甲醇提取物对家蚕的生物
活性
采用点法，对内生青霉等 4 种真菌菌丝体甲
醇提取物对家蚕 4 龄幼虫的触杀活性进行测定，
结果见表 2，以 1. 50 mg /头的剂量点滴处理家蚕
4 龄幼虫时，青霉菌代谢产物对家蚕 4 龄幼虫的触
杀活性最高，24 h 的校正死亡率达到 100%;
0. 50 mg /头的剂量对家蚕 4 龄幼虫 48 h 和 72 h 的
校正死亡率分别为 50%和 95. 8%。而另外 3 种真
菌代谢产物对家蚕 4 龄幼虫无触杀活性。
表 3 4 种内生真菌代谢产物对家蚕 4 龄幼虫的触杀毒力
Table 3 Contact toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against 4th instar larvae of
the silkworm Bombyx mori L.
处 理
Treat
剂量 (mg /头)
Dosage
校正死亡率 (%)Corrected mortality rate
24 h 48 h 72 h
青霉菌
Penicillium
1. 50
0. 50
100
16. 7
100
50
100
95. 8
炭疽菌
Colletotrichum
1. 50 0 0 0
拟茎点菌
Phomopsis
1. 50 0 0 0
黄曲霉菌
Aspergillus flavus
1. 50 0 0 0
3 结论与讨论
目前对植物病虫害的防治多采用农药来进行
化学防治。但农药的不合理使用也带来了一些弊
病，如对害虫天敌的毒害，对环境的污染以及导
致有害物产生抗药性等。因此迫切需要开发对人
畜毒副作用小，对环境友好且药效持久的农药。
据文献报道，一些植物内生真菌为寻找可替代，
毒副作用小，安全有效的绿色农药提供了可能
(Benhamou and Nicole，1999)。目前，植物内生真
菌本身及其次生代谢产物在农业方面应用的研究
已经去取的较大的进展，一些非常有价值的新菌
株和新化合物陆续被发现 (江爱兵等，2010)。兰
琪等 (2004)从苦皮藤植株中分离得到一株具有
杀虫活性的内生真菌，其菌丝体的丙酮粗提物对
3 龄粘虫有毒杀作用，在 500 μg /mL 浓度处理下，
24 h后的死亡率为 85. 3%。Strobel 等 (2004)从
植物 Bontia daphnoides 中分离得到内生真菌
Nodulisporium sp. ，该菌会产生一种吲哚二萜类化
合物 Nodulisporic acids，实验证明该物质具有杀灭
大苍蝇幼虫的活性。
根据某些药用植物的内生真菌能产生与宿主
相同或相似的活性物质的现象，推测杀虫植物内
生真菌可能产生与宿主相同或相似的杀虫活性物
质。有研究发现苦楝的某些内生真菌可以产生楝
科植物的活性物质———苦楝素 (王琪等，2007) ，
喜树的内生真菌可以产生喜树碱及其衍生物 (潘
学武等，2010;曹晋静和康冀川，2014)。本研究
便是以传统杀虫植物毛鱼藤、白花鱼藤和蜜花鱼
藤 3 种鱼藤属植物的内生真菌为研究对象，以家
蚕和松材线虫为试虫，测定鱼藤属植物的内生真
菌代谢产物的生物活性。4 种内生真菌的的代谢产
物对松材线虫都具有一定的毒杀活性，其中青霉
菌的代谢产物活性最高，48 h 校正死亡率达 90%
以上。4 种内生真菌中，只有青霉菌的代谢产物对
家蚕 4 龄幼虫具有触杀活性，1. 5 mg /头剂量处理
时，24 h校正死亡率即达到 100%。本文只对内生
真菌的甲醇初提物进行了生物活性研究，其次生
代谢产物的种类以及结构还待进一步鉴定。
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