全 文 ：第 22卷　第 3期
2007 年 7 月
北　京　农　学　院　学　报
JO URNA L OF BEIJING UNIVERSITY OF AGRICULT URE
Vo l. 22 , No. 3
Jul. , 2007
　　收稿日期:2007-03-21
　　基金项目:948项目 (植物基因测序及功能改良技术引进);北京市属市管高校人才强教计划资助项目
　　作者简介:庄彩云 , 1982年出生 , 女 , 中国林业科学研究院在读硕士研究生 , 研究方向:植物细胞与基因工程;通讯作者:杨 凯 ,
1962年出生 , 男 , 副研究员 , 研究方向:植物细胞与基因工程
适用于 rDNA ITS分析的兰属菌根
真菌培养及 DNA提取方法
庄彩云1 , 李潞滨1 , 胡　陶1 , 唐　征2a , 刘振静1 , 杨　凯*2b , 3
(1. 中国林业科学研究院 林业研究所国家林业局林木培育实验室 , 北京 100091;
2. 北京农学院 a. 植物科学技术系;b. 生物技术系 , 北京 102206;3. 农业应用新技术北京市重点实验室 , 北京 102206)
摘　要:为探讨兰属植物与其共生真菌之间专一性关系 , 采用覆盖纤维素滤膜于 PDA 培养基的方法培养兰属菌
根真菌 , 提取其 DNA 后用于 rDNA ITS 分析。在培养过程中克服 PDA 液体培养及固体培养获得菌丝体少的缺
点 , 操作方便 , 获得大量菌丝体;采用改进的提取植物基因组 DNA 的 SDS 方法提取真菌的 DNA , 通过提高缓
冲液的 pH 值 、 增加 EDTA 的浓度以提高 DNA 的提取效果。结果表明 , 此培养方法及改进的 DNA 提取方法均
简便易行 , 提取的 DNA 产量高 、 质量较好;可满足菌根真菌 rDNA ITS 分析的要求。
关　键　词:兰属菌根真菌;醋酸纤维素滤膜;真菌 DNA
中图分类号:Q939. 11　　文献标识码:A 　　文章编号:1002-3186(2007)03-0004-03
A Rapid and Simple Method for Culturing of Cymbidiummycorrhizal Fungi
and Extracting of DNA from the Fungi for the Analysis of rDNA ITS
ZHUNAG Cai-yun1 ,LI Lu-bin1 , HU Tao1 , TANG Zheng 2a , LIU Zhen-jing1 ,YANG Kai*2b , 3
(1. Key Labo rato ry o f T r ee Breeding and Eultiva tion , State Forestr y Administration , Institute of Fore st ry ,
Chine se Academy o f Fo restry , Beijing 100091 , China;
2. a. Department of P lant Science and Technolog y;b. Depa rtment of Biological Technolo gy ,
Beijing Univer sity o f Ag riculture , Beijing 102206 , China;
3. New Techno lo gical Labo rato ry in Ag riculture Applica tion in Beijing , 102206 , China)
Abstract:In order to analyze the specifici ty rela tionship betw een the Cymbidium and the Cymbidium my-
corrhizal fungi , a rapid method fo r culturing the Cymbidium mycor rhizal fungi on PDA covered w ith cellu-
lose ace tate membrane w as repor ted in this paper. The ex t racted DNA of Cymbid ium mycorrhizal fungi
w as used for the rDN A ITS analy sis. The method obtained a g reat quantity hypho st roma. The improved
SDS method which used in plant g enomic DNA was applied in ex t raction of fungi DNA. The DNA was sat-
i sfied fo r the rDNA ITS analysis o f the Cymbidium mycorrhizal fung i.
Key words:Cymbidium myco rrhizal fungi;cellulose ace tate membrane;fungi DNA extract ion
　　兰属(Cymbidium Sw. )菌根真菌是兰属植物
生长 、繁殖所必需的菌根内生真菌 ,兰属植物作为一
种广泛分布的植物资源 ,有着重要的观赏价值和经
济价值 ,菌根真菌对于自然状态下兰属植物完成正
常的生活史具有不可替代的作用 ,因此兰属植物菌
根一直是国内外众多学者的研究兴趣所在 。
　　真菌的分子生物学研究起步比其他生物要晚 ,目
前真菌的培养方法主要有 PDA 液体培养法 、固体培
养基培养法和玻璃纸培养法[ 1] ,笔者采用醋酸纤维素
滤膜的方法 ,以期获得较多的菌丝体 ,并能简化操作
2007 年第 3 期 庄彩云 等:适用于 rDNA ITS 分析的兰属菌根真菌培养及 DNA提取方法 5　
步骤。菌根真菌 DNA 的提取一般采用 SDS 、CTAB
提取法 、氯化苄提取法和液氮研磨饱和酚抽提法 ,这
是近年来植物病原真菌 DNA 提取主要采用的方
法[ 2 ～ 5] ,笔者采用目前广泛用于植物 DNA 提取的
SDS方法[ 6]并加以改进 ,以探求一种操作简单 、快速 ,
满足分子生物学要求的 DNA提取方法 ,为进一步开
展真菌的分子生物学研究奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　菌种 。用于 DNA 提取的兰属菌根真菌 ,由中
国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育
实验室分离提供 。
　　培养基。PDA 培养基成分:取去皮的马铃薯块
200 g ,切成小块 ,加水 1 L 煮沸 30 min ,滤去马铃薯
块 ,将滤液补足至 1 L ,加葡萄糖 20 g ,固体培养基
加琼脂 8 g ,溶化后分装 , 121 ℃湿热灭菌 15 min 。
1. 2　方　法
　　菌株的培养。培养基表面覆膜培养:试管斜面
活化后 ,接入 PDA固体培养基表面 , 30℃培养 2 ～ 3
d ,转接入 90 mm 覆盖有灭菌醋酸纤维素滤膜(孔径
0. 45 μm)的 PDA 平板上 ,每皿的中央接入5 mm 见
方的小菌块一块于滤膜的表面 。30℃培养 6 ～ 7 d
(视菌株的生长速率而定 ,以菌丝生长覆盖满醋酸纤
维素滤膜为标准)。小心取出接种的菌块 ,用灭菌的
牙签刮取滤膜表面菌落边缘的菌丝体收集于 1. 5
mL 的离心管中 4 ℃保存备用 。
　　振荡培养:试管斜面活化后 ,接种 PDA 液体培
养基 ,140 r /min 30℃培养 3 d ,离心收集菌丝体。
　　兰属菌根真菌 DNA 的提取。取出约 0. 1 g 菌
丝体 ,加入 1 mL 裂解缓冲液(Tris-HC l 100 mmol /
L(pH 9. 0);EDTA 100 mmol /L;NaCl 400 mmol /
L;2%SDS),加入少许石英砂 ,在研钵中将菌丝进行
充分研磨 。将菌体移入 1. 5 mL 的离心管中 ,于 65
℃水浴保温 30 min ,每 10 min取出充分混匀 1次 。
加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为 24∶
24∶1),轻轻混匀 5 min ,12 000 r /min离心 10 min 。
吸取上清液 ,加入等体积氯仿 ,轻摇 5 min , 12 000
r /min离心 10 min 。收集上清液 ,加入 0. 75倍体积
的异丙醇沉淀 DNA ,用 70%乙醇冲洗 2 ～ 3次后自
然风干 ,加入 500 μL 1×TE 缓冲液溶解 DNA 。加
入 2 μL RNase(10 mg /mL), 37 ℃水浴保温 30
min。加入等体积苯酚∶氯仿(体积比为 1∶1),轻
摇5 min , 12 000 r /min 离心 10 min 。取上清液加入
等体积氯仿 ,轻摇5 min ,12 000 r /min离心10 min。
吸取上清液 ,用 2倍体积的无水乙醇沉淀 DNA , -
20℃短暂放置后 ,12 000 r /m in离心 。用 70%的乙
醇洗涤沉淀 DNA 2次 ,自然风干后溶于适量 0. 1×
TE缓冲液中 ,贮存于 - 20 ℃备用 。
　　DNA 的检测。DNA 样品在 0.8 %的琼脂糖凝
胶上进行电泳 ,加入3μL DNA样品以λDNA-HindIII
作为分子标记 ,100 V 电压下电泳 30 min ,溴化乙啶
染色 ,紫外灯下观察拍照。
　　菌株 rDNA ITS 区段的 PCR扩增及测序。兰
属菌根真菌 rDN A ITS 区段 PCR扩增引物:
　　P1(5′-TCC G TA GG T GAA CCT GCG G ),
P2(5′-TCC TCC GCT TA T TGA TA T GC)[ 7] 。
在 200μL 的 Ep管中依次加入:灭菌 dd H2O 16. 85
μL ,10×Ex Taq Buffer (含 Mg 2+) 2. 5 μL , dN TP
(2. 5 mmo l /L) 1. 5 μL , TaKaRa Ex T aq (2. 5 U /
μL)0. 15μL ,正向引物(20μmol /L)1. 5μL ,反向引
物(20μmol /L)1. 5 μL ,模板 DNA 2 μL 。
　　PCR反应循环参数为:预变性 96 ℃, 2 min;变
性 94 ℃,40 S;退火 60 ℃,40 S;延伸72 ℃, 45 S;进
行 35个反应循环;延伸 72℃, 5 min 。取 5 μL 的
PCR产物电泳检测。
　　PCR 产物经 PCR 产物试剂盒纯化后与
pMD18T-Vecto r(T aKaRa)载体连接 , 转化大肠杆
菌 DH-5α,选取阳性克隆由上海生工公司测序 。
2　结果与分析
2. 1　覆盖醋酸纤维素滤膜培养的菌丝体
　　在醋酸纤维素滤膜上培养的菌落灰白色或浅黄
白色(与培养基色泽和厚度有关),呈均匀圆周状向
外发散生长 , 6 ～ 7 d 长满 90 mm 平板;菌体表面质
感温润细腻 ,生长面有稀松或较丰富的白色气生菌
丝 ,一些菌株可形成间隔不等的同心菌落环纹;边缘
菌丝下沉于基内生长 ,有浸润感(图 1)。
图 1　兰属菌根真菌在PDA平板(覆醋酸纤维素滤膜)上的菌落
Fig.1　Colony characteristics of Cymbidiummycorrhizal fungi on
PDA(covered with celluloseacetate membrane)
6　 北　京　农　学　院　学　报 第 22卷
2. 2　培养方法对 DNA提取结果的影响
　　所提取的 DNA 电泳检测结果如图 2 , PDA液体 1
提取的DNA量较少 ,PDA液体2量虽多但有严重的降
解 ,蛋白含量也较多;醋酸纤维素滤膜的泳道在约 23
kb处均有一条明亮的DNA条带 ,DNA无降解。
图 2　兰属菌根真菌 DNA电泳结果
Fig. 2　The result of fungi DNA of Cymbidium
mycorrhizal fungi agarose electrophor-
esis by two culturing methods
2. 3　加大提取液 EDTA 浓度对 DNA提取的影响
　　在提取过程中 ,提取液需要在碱性条件下与多糖
上的羟基作用来进行破壁反应 ,因此将裂解缓冲液的
pH 值调整到 9.0 , 0. 1 g 菌丝体加入 1 mL 裂解
缓冲液研磨后其pH值下降0. 3 ～ 0. 4 ,这样可以
保证样品在提取缓冲液中的 pH 值在 8. 5 左右 ,利
于其破壁释放 DNA ;同时将 EDTA 的浓度增大到
100 mmol /L 以上(一般为 50 mmo l /L), 可有效抑
制真菌细胞释放出 DNA 酶 ,防止 DNA 降解 ,从而
提高提取效率 。
图 3　菌株的 rDNA ITS区段 PCR产物电泳结果
Fig. 3　 Electrophoresis result of strains’ rDNA
ITS section PCR production
2. 4　真菌 rDNA ITS区段 PCR扩增及测序结果
　　用引物 ITS-P1和 I TS-P2 扩增兰属植物菌根
真菌菌株的 rDN A ITS 区段 ,获得 PCR产物约 630
bp(图 3)。PCR产物克隆测序所得兰属菌根真菌菌
株的 rDNA ITS序列在 GenBank 中进行同源比对 ,
发现分离菌株为胶膜菌属(Tulasnella sp. )(在
GenBank中的登录号为 EF127682), 序列如图 4。
从 PCR检测结果及测序后比对的结果来看 ,此方法
提取的 DNA 质量较高 ,适用于真菌的 ITS 分析及
其后续研究。
图 4　兰属菌根真菌 rDNA ITS区段
Fig. 4　ITS regin of the rDNA of Cymbidum mycorrhizal f ungi
3　讨　论
　　兰属菌根真菌 DNA 提取的质量主要由获得的
菌体量和破壁两个因素决定 , 本试验曾采用 PDA
液体培育后离心获得菌体和平板表面覆盖醋酸纤维
素滤膜培育获得菌体两种方法 ,多数兰属菌根真菌
在液体培养条件下生长状况较差 ,获得的菌体量少 ,
且获得的菌体由于水分含量和培养基成分含量高 ,
在 DNA 提取过程中容易稀释 DNA 提取缓冲液 ,引
入培养基成分 ,严重影响后续 DNA 提取 ,减少了
DNA 的量 ,而且降解严重。培养基表面培育的兰属
菌根真菌虽然生长状况良好 ,但由于绝大多数菌丝
为基内菌丝 ,从培养基表面直接获取气生菌丝时 ,易
(下转第 31页)
2007 年第 3 期 张志刚 等:川芎嗪和小檗碱对猪卵母细胞体外成熟效果的影响 31　
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(上接第 6页)
将固体培养基混入 。而本试验采用在 PDA 培养基
表面覆盖灭菌醋酸纤维素滤膜的方法 ,不仅获取菌
丝体时便于操作 ,且保证菌丝体的数量和纯度 , 90
mm 直径的醋酸纤维素滤膜上可获得 0. 6 ～ 0. 7 g
鲜重的菌丝体 ,菌体量大 ,足以用于 DNA 的提取及
后续试验 。
　　真菌细胞壁的破壁一直是真菌研究中的一个难
以解决的问题 ,一般采用溶菌酶和研磨破壁两种方
法 ,溶菌酶破壁的方法很难控制各样品间破壁程度
的一致性;采用研磨破壁的方法可通过研磨时间控
制样品间的破壁程度从而达到基本一致 ,同时降低
试验费用 。研磨破壁法中国多采用氯化苄提取法 ,
此法具有简便易行的优点 ,但存在提取 DNA 质量
不够稳定 ,对分散性不好的材料提取效果不好等不
足[ 1] 。本试验中对 SDS方法加以改进 ,由于提取液
需要在碱性条件下与多糖上的羟基作用来进行破壁
反应 ,将裂解缓冲液的 pH 值调整到 9. 0(一般为
8. 5),菌丝体研磨后其 pH 值下降 0. 3 ～ 0. 4 , 这样
可以保证样品在提取缓冲液中的 pH 值在 8. 5 左
右 ,利于其破壁释放 DNA ;EDTA的浓度增大可有
效抑制真菌细胞释放出 DNA 酶 ,防止 DNA 降解 ,
从而优化试验步骤 ,提取的 DNA 质量较高 ,可用于
真菌的 rDNA ITS 分析 ,适合开展后续的分子生物
学研究。
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