全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2006,14 (6): 926~930
*基金项目:北京市科委科技合同项目(No.954410900)资助。
作者简介:李柱刚(1972~),男,博士,研究员。
**通讯作者。Authorforcorrespondence.研究员,博士,主要研究方向:植物生物技术。E-mail:.
收稿日期:2005-07-29接受日期:2005-09-21
·研究论文·
芸薹属作物脂肪酸链延长酶基因(FAE1)拷贝数和序列变异分析 *
李柱刚 1,3,崔崇士 2,曹鸣庆 3,马荣才 3**
(1.黑龙江省农业科学院,哈尔滨150086;2.东北农业大学园艺学院,哈尔滨150030;
3.北京农业生物技术研究中心,北京100089)
摘要:利用拟南芥脂肪酸合成途径中的脂肪酸链延长酶 FAE1基因序列的保守性设计 PCR简并引物,对芸薹属(Brassica)
作物 3个基本种和 3个复合种进行了标记,并且对每个栽培种的 PCR产物进行克隆和测序,进而对所获得的 FAE1基因部分
序列(C-端编码区序列)进行了分析。结果表明,拟南芥(Arabidopsisthaliana)和芸薹属作物基因组中具有不同拷贝数(1~3)的
FAE1基因,所测定的部分基因序列相互之间具有很高的同源性,并与其它酶基因如 3-氧乙酰 -乙酰载体蛋白合成酶,超长链
脂肪酸合成酶和酮乙酰CoA合成酶基因具有共同的起源。
关键词:芸薹属;拟南芥;脂肪酸链延长酶基因(FAE1);扩增共有遗传标记(ACGM)
中图分类号:S188文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2006)06-926-05
SequenceandCopyNumberVariationofFatty-acidChain
Elongase1(FAE1)GeneinBrassicaSpecies
LIZhu-gang1,CUIChong-shi2, CAOM ng-qing3,MARong-cai3**
(1.BiotechnologyResearchcentreofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China;2.Collegeof
HorticulturalSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;3.BeijingAgro-biotechnologyResearchCenter,
Beijing100089,China)
Abstract: Degenerated PCR primers derived from the conservative nucleotide sequences of fatty-acid chain elongase 1 (FAE1) of Arabidopsis
thalianawereusedtoanalyzethecopynumbervariationofFAE1geneamongthesix Brassicaspecies,and theamplified FAE1 genefragmentswere
furthersequencedandanalyzed.TheresultsindicatedthatA.thalianaandBrassicasp.genomeshaddifferentcopynumbers (1~3)ofFAE1genesand
their partial sequences detected were highlyhomologous. The cloned DNA fragments encoding the C-terminus of FAE1 also showed high similarity
with other enzymes, such as 3-oxoacyl-acyl-carrier-protein synthase,very-long-chain fatty acid condensing enzyme CUT1,and 3-ke o cyl-CoA syn-
thase,suggestingthatFAE1genehadacomplexevolutionaryhistory.
Keywords:Brassica;Arabidopsisthaliana;fatty-acidchainelongase1(FAE1)gene;amplifiedconsensussequencegeneticmarker(ACGM)
芸薹属(Brassica)有37个种,包含许多重要的蔬
菜、油料和饲料作物(Patersonetal.,2001),具有重要的
应用和学术价值。芸薹属蔬菜作物共有3个基本种和
3个复合种,多年来对它们之间的遗传关系已经从细
胞学、遗传学和分子生物学等水平上进行了广泛的研
究(郭晶心和曹鸣庆,2001)。但是由于研究精度的限制,
一直没有能够充分认识这些基因组之间的关系。正确
理解芸薹属各个单染色体组种(monogenomic
species)之间的基因组关系不仅有助于解释芸薹属各
个种之间的进化,而且将促进和加快芸薹属种间的基
因转移。
模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)和芸薹属
同属于十字花科,它们之间亲缘关系较近。拟南芥和芸
薹属中编码基因的同源性高达80%以上,根据拟南芥
和芸薹属之间的DNA序列的高度保守性,可以相互
了解它们之间共有的遗传信息 (李柱刚等,2004)。
Bruneletal.(1999)提出了能相互探知拟南芥和芸薹属
之间共有遗传信息的ACGM(amplifiedconsensusse-
quencegeneticmarker)标记,即扩增共有遗传标记。
本实验根据拟南芥中控制脂肪酸代谢的关键酶
第6期 李柱刚等:芸薹属作物脂肪酸链延长酶基因(FAE1)拷贝数和序列变异分析
表1拟南芥和芸薹属植物材料
Table1ArabidopsisthalianaandBrassicaspecies
学名
Scientificnames
B.rapassp.pekinensis
B.rapassp.chinensis
B.rapassp.tapifera
B.nigra
B.oleracea
B.juncea
B.napus
B.carinata
Arabidopsisthaliana
种或品种名称
Species/cultivar
佳白二号大白菜ChinesecabbageJiabaiNo.2
矮脚黄白菜型油菜YubaicaipakchoiAijiaohuang
欧洲芜菁Turnip
尤嫩斯黑芥BlackmustardYoununsi
中甘十一甘蓝CabbageZhongganNo.11
抱子芥Brusselsmustard
甘蓝型油菜Oilseedrape
埃塞俄比亚芥Ethiopian-mustard
哥伦比亚生态型Commonmouse-earcressColumbiaecotype
编号
Code
JB
AW
WJ
HJ
ZG
BZ
GX
AJ
AR
基因型
Genotype
AA(2n=2x=20)
AA(2n=2x=20)
AA(2n=2x=20)
BB(2n=2x=16)
CC(2n=2x=18)
AABB(2n=4x=36)
AACC(2n=4x=38)
BBCC(2n=4x=34)
2n=10
基因FAE1序列,采用ACGM标记,依其外显子的保
守区设计简并引物,然后以Brassica基因组DNA为
模板扩增其同源基因片段,对 Brassica3个基本种
和3个复合种中控制脂肪酸代谢的FAE1基因进行
分子标记和序列变异分析。
1 材料和方法
1.1 实验材料
如表1所示。以拟南芥哥伦比亚生态型(Col)作
为对照,植物材料均种植于温室内。种子用纱布包
好,70%酒精漂洗30s,然后用无菌水冲洗2~3次,
再用2.5%次氯酸钠消毒7min,无菌水洗3次。将处
理后的种子接种到灭菌的MS培养基中培养,待长
到4~5片真叶时提取DNA。
1.2 植物DNA提取
采用CTAB方法(RogersandBendich,1994)。
1.3 FAE1基因片段的体外扩增和检测
1.3.1引物设计 根据拟南芥 FAE1外显子的保守
区,依其编码的氨基酸序列设计简并引物,利用
DNAStar(LASERGENESOFTWARE,DNASTAR
Inc.)软件辅助设计,引物由上海生工公司合成。引物
序列为:
5-TCGATGCAGTGYTSCCANGG-3;
5-CGGAGCTGACGACAARWCNTT-3。
简并引物字母代表碱基,N(AGCT)、S(GC)、Y
(CT)、R(AG)、W(AT)和 D(CT)。所扩增的 FAE1
片段对应于拟南芥脂肪酸链延长酶(FAE1)或者超
长链脂肪酸合成酶(CUT1)C-末端长度为183个氨
基酸残基的编码区。
1.3.2 PCR反 应 体 系 0.2mmol/LdNTP,1.5
mmol/LMgCl2,TaqDNA 聚 合 酶 1.5U,DNA
50~100ng,反应总体积为50μL。94℃下5min变性
后,循环条件为:94℃ 1min,52℃ 1min,72℃ 2
min,共35个循环。72℃延伸4~6min,4℃保存。
1.3.3 PCR产物凝胶电泳 PCR产物分别在 1%
琼脂糖凝胶和 5%非变性聚丙烯酰凝胶中电泳检
测。
1.3.4 第二轮 PCR扩增体系 在聚丙烯酰胺凝胶
电泳分析后,在紫外灯下用微量移液器吸头挑取目
的 DNA条带,将 DNA转移入装有 20μLH2O的
PCR反应管中,进行PCR重扩增。PCR反应体系
为:0.2mmol/LdNTP,1.5mmol/LMgCl2,TaqDNA
聚合酶 1.5U,DNA50~100ng,反应总体积为 50
μL。PCR循环条件为:94℃4min,循环中 94℃1
min,52℃45s,72℃1min,共30个循环。72℃延
伸4min,4℃保存。
1.4 FAE1基因片段的克隆
本实验用第二轮PCR产物直接与pUmT-Vec-
tor(上海生工公司)连接和克隆PCR产物。使用PCR
反应分析阳性克隆。
1.5 FAE1基因片段的测序
以阳性克隆质粒DNA为模板,在本实验室的
BECKMAN-COULTER公司CEQTM2000XL测序仪
上进行测序。
1.6 Southern杂交
使用荧光标记和检测试剂盒(Pharmacia-Amer-
sham,RPN3540,RPN3510,瑞典,),以拟南芥 FAE1
基因片段为探针进行Southern杂交和检测,实验步
骤按照Pharmacia-Amersham试剂盒的说明进行。
1.7 序列同源性比较和系统发育树的构建
将 测 定 的 DNA序 列 在 GenBank中 进 行
BLASTx搜索后,用ClustalW1.81进行核酸和氨基
酸序列比对。采用距离系数法中的邻接法(neigh-
bor-joiningmethod),用Mega2中的程序进行系统发
育树的构建 (Kumaretal.,2001;Thompsonetal.,
1994)。
2 结果和分析
927
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
2.1 FAE1位点的PCR扩增和凝胶电泳检测
9种植物(表1)FAE1基因片段PCR扩增结果
如图1所示。为了验证扩增结果,首先从拟南芥基因
组 DNA中扩增出 FAE1基因片段,并进行序列分
析,然后利用该片段进行Southern杂交检测。杂交
结果证实了PCR扩增的正确性。
在图1中,DNA杂交带有偏移现象,这是因为
聚丙烯酰胺凝胶比较脆弱,但是并不影响实验的结
果。探针为拟南芥FAE1基因片段,从图1可以看
出,黑芥(HJ)和甘蓝型油菜(GX)基因组中存在着
双拷贝 FAE1基因,抱子芥(BZ)基因组中可能有 3
个FAE1拷贝存在。
2.2 芸薹属作物FAE1基因部分DNA序列的同源
性比较分析
本 实 验 共 计 分 离 8个 FAE1基 因 片 段
(FAE1AW、FAE1JB、FAE1WJ、FAE1GX、FAEHJ、
FAE1ZG、FAE1AJ和FAE1BZ)。图2是芸薹属和拟
南芥中18个FAE1及其同源序列的比对结果。可看
出所克隆的芸薹属FAE1基因编码的氨基酸序列与
已发表的序列高度同源。
图1.拟南芥和芸薹属作物FAE1基因片段聚丙烯酰胺凝胶
电泳(A)和Southern杂交(B)分析
Fig.1.Non-denaturingPAGE(A)andSouthernbloting(B)
analysisofPCR-amplifiedFAE1genefragmentsfrom
ArabidopsisthalianaandthesixBrassicaspecies
M,molecularstandards(1kbDNAladder,GIBCO-BRL).SampleNo.is
thesameasTable1.
图2.芸薹属和拟南芥18个
FAE1基因同源序列编码的部
分氨基酸序列比较
Fig.2.Multiplealignmentof18
putativeaminoacidsequences
coded by FAE1 gene
homologous sequences from
BrassicaandArabidopsis
FAE1Bo,B.oleracea(GenBankAcc.No.Y14981);FAE1Br,B.rapa(GenBankAcc.
No.AF4904610);FAE1BrP,B.rapa (GenBankAcc.No.Y14975);CFAt,A.thaliana
(GenBankAcc.No.AC011915);FAE1AtP,A.thaliana(GenBankAcc.No.0533345);
CUTIAt,A.thaliana(GenBankAcc.No.AC025808);ACCBn,B.napus(GenBankAcc.
No.U50771)。 FAE1AW、FAE1JB、FAE1WJ、FAE1GX、FAE1HJ、FAE1ZG、FAE1AJ
andFAE1BZwereisolatedinthiswork.Theidenticalaminoacidsequenceswerein
black,andthesequencesdisplayingover60%homologywereingrey.Theconsensus
sequencewasindicatedatthebotomofthemultiplealignment.
928
第6期 李柱刚等:芸薹属作物脂肪酸链延长酶基因(FAE1)拷贝数和序列变异分析
表2芸薹属和拟南芥18个FAE1基因同源序列编码的氨基酸序列相似性矩阵
Table2Homologymatrixofpartialaminoacidsequencesof18FAE1genefromBrassicaandotherplants
FAE1
Bo2
100
FAE1
Br3
97.5
100
FAE1
WJ
95.4
94.2
100
FAE1
Br1
98.7
97.5
95.4
100
FAE1
AW
99.1
96.3
93.2
93.9
100
FAE1J
B
96.9
95.7
94.2
95.1
97.7
100
FAE1
GX
95.5
94.2
94.6
95.5
97.7
96.7
100
FAE1
HJ
95.5
94.2
94.6
96.0
97.7
96.1
98.3
100
FAE1Z
G
94.2
92.9
94.6
94.3
96.9
94.5
95.0
94.4
100
AC-
CBn
95.7
94.5
94.2
94.0
93.9
94.7
93.3
93.9
93.9
100
FAE1
Bj2
82.7
81.6
82.5
81.3
82.6
81.4
79.4
80.0
79.0
83.5
100
FAE-
ABj1
82.7
81.6
82.5
80.8
83.3
83.0
81.1
81.7
79.6
84.0
98.4
100
FAE1
At1
88.3
87.7
88.3
85.2
90.2
88.3
86.7
86.1
85.1
87.2
89.9
91.5
100
FAE1
AJ
78.3
77.8
77.3
76.8
73.3
79.1
77.1
76.5
77.8
80.2
70.1
70.6
74.3
100
FAE1
BZ
78.9
77.6
77.5
75.4
79.7
78.4
78.4
77.8
79.5
77.8
69.5
70.7
77.8
68.7
100
CFAt
66.0
65.0
62.9
60.7
67.4
63.0
61.6
62.1
60.7
63.6
58.7
59.8
64.1
52.5
59.8
100
FAEAt
P
62.1
61.7
60.8
59.1
63.4
61.0
60.3
60.9
58.9
59.9
55.1
56.7
61.5
49.5
58.4
70.3
100
CUTI-
At1
74.5
74.1
73.2
71.8
76.3
72.7
70.9
72.1
70.6
73.3
68.4
69.0
74.9
62.4
69.9
77.7
68.4
100
各个 FAE1氨基酸片段的系统进化树如图 3
所示。可以看出芸薹属的抱子芥中的FAE1单独聚
为一类,其它FAE1与拟南芥的FAE1被聚在一起,
而且有很高的支持率。说明FAE1序列在进化过程
中是较为保守的,它们的分化出现在拟南芥和芸薹
属作物的分化以前。在这一系统发育树上,拟南芥
中 的 3个 FAE1同 源 序 列 (CFAt、CUTIAt和
FAE1AtP)与其它FAE1序列分离开。由于本实验中
所扩增的脂肪酸合成基因片段的编码区较小,不能
代表完整的基因,所以上述各个序列之间的进化关
系并不能完全反映完整FAE1序列之间的关系。
3 讨论
通过对亲缘关系密切的植物重要代谢途径基
因进行比较分析和功能基因标记,能够探讨近源物
种之间的亲缘关系及分子进化情况。本研究在国
内首次采用ACGM方法对芸薹属作物脂肪酸链延
长酶基因进行了分子标记,而且在国际上首次对白
菜3个品种中的FAE1基因进行标记,并且获得了
部分核苷酸序列。
FAE1基因在芸薹属中存在着从单拷贝到3个
拷贝的分布。本实验在开始时使用 0.8%琼脂糖凝
图3.芸薹属和拟南芥部分FAE1氨基酸序列系统发育树
Fig.3.Phylogenetictreeoftheputativeaminoacidsequences
of18FAE1genehomologoussequencesofBrassicaand
Arabidopsis.
在分析中使用Bootstrap法对进化树进行评估,各个分支处的数字表
示该分支的Bootstrap支持率。 各个序列的名称见图2中的说明。
Bootstrappingmethodwasusedtoestimatethereliabilityof
tree.Thenumbersoneachcladeindicatedthebootstrapvalues.
ThesequencenamesseeFig.2.
从表2可以看出,十字花科植物的FAE1氨基
酸序列具有很高的保守性,相似性程度为 68.7%
~99.1%。在这些植物中还存在一些FAE1基因的同
源序列,它们与FAE1之间的相似性最低从52.5%
~77.7%。
/%
929
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
胶电泳分离各个芸薹属物种的 FAE1PCR产物,结
果表明在拟南芥和芸薹属植物中所有 PCR产物都
是大小一致的单一产物(图略)。但是在5%非变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳中,芸薹属植物却具有大小不
同的FAE1基因,这与两种凝胶的分辨率有关。
本实验所克隆的芸薹属FAE1基因片段编码的
氨基酸序列具有很高的保守性。抱子芥是我国芥菜
的一个变种,我国是芥菜的起源中心或者次生起源
中心(刘佩瑛,1996),因此它的 FAE1基因序列可能
与其它芸薹属植物的FAE1基因有较多的差异。所
克隆的FAE1基因片段还与其它基因序列之间有很
高的相似性,如图2和图3中的 ACCBn、CUT1等
基因,它们分别编码甘蓝型油菜的3-氧乙酰-乙酰
载 体 蛋 白 合 成 酶(3-oxoacyl-acyl-carier-protein
synthase) 和 拟 南 芥 的 极 长 链 脂 肪 酸 缩 合 酶
(very-long-chain fatyacid condensing enzyme
CUT1)。另外,这一FAE1基因片段也与KCS基因
(编码酮乙酰CoA合成酶,3-ketoacyl-CoAsynthase)
高度同源 (Hayashietal.,1999;Milaretal.,1999;
Toddetal.,1999)。实际上,本实验所克隆的FAE1基
因片段只编码FAE1的C-末端,因此,FAE1基因具
有复杂的进化机制,同时也说明了脂肪酸合成酶类
在结构和功能上的保守性。
本实验所克隆的 PCR产物只是 FAE1基因片
段,为了正确认识芸薹属作物之间FAE1基因的系
统发育关系,有必要分离各个全长基因,包括内含子
序列。利用拟南芥中的已知序列扩增共有基因,仍将
是芸薹属植物的有效标记方法。这种标记与基因功
能相联系,对于认识芸薹属植物的表型变异的分子
基础具有重要意义。
参 考 文 献
BrunelD,FrogerNandPeletierG.Developmentofamplified
consensusgeneticmarker(ACGM)inBrassicanapusfrom
Arabidopsisthalianasequencesofknownbiologicalfunction
(J).Genome,1999,42:387~402
GuoJX(郭晶心)andCaoMQ(曹鸣庆).Progressofmolecular
markerresearchonthetaxonomy,originandevolutionof
Brassica(J).BiotechnologyInformation(生物技术通报),
2001,1:26~30(inChinese)
HayashiH,DeBelisL,CiurliA,KondoM,HayashiM and
NishimuraM.Anovelacyl-CoAoxidasethatcanoxidize
shortchainacyl-coainplantperoxisomes(J).TheJournalof
BiologicalChemistry,1999,274:12715~12721
KumarSK,TamuraIBandJakobsenMN.MEGA2:Molecular
EvolutionaryGeneticsAnalysisSoftware (M),ArizonaState
University,Tempe,Arizona,USA,2001.
LiuPY (刘佩瑛).ChineseMustard (M).Beijing:China
AgriculturePress,1996.(inChinese)
LiZG(李柱刚),MaRC(马荣才),CaoMQ(曹鸣庆)andCuiC
S (崔崇士).Sequenceandcopynumbervariationofoleate
desaturasegene(FAD2)inBrassicaspecies(J).Journalof
AgriculturalBiotechnology(农业生物技术学报),2004,12
(5):515~520(inChinesewithEnglishabstract)
MilarAA,ClemensS,ZachgoS,GiblinEM,TaylorDCand
KunstL.CUT1,anArabidopsisgenerequiredforcuticular
wax biosynthesis and polen fertility, encodes a
very-long-chainfatyacidcondensingenzymy (J).ThePlant
Cel,1999,11:825~838
PatersonAH,LanT,AmasinoR,OsbornTCandQuirosC.
Brassicagenomics:Acomplementto,andearlybeneficiaryof
theArabidopsissequence (J).GenomeBiology,2001,2:
1011.1~4
RogersSRandBendichAJ.ExtractionoftotalcelularDNA
fromplants,algaeandfungi(J).PlantMolecularBiology
Manual,1994,1~8
ThompsonJD,HigginsD G,GibsonTJ.CLUSTALW:
improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequence
alignmentthroughsequenceweighting,position-specificgap
penaltiesandweightmatrixchoice (J).NucleicAcids
Research,1994,22:4673~4680
ToddJ,Post-BeitenmilerDandJaworskiJG.KCS1encodesa
fatyacidelongase3-ketoacyl-CoAsynthaseafectingwax
biosynthesisinArabidopsisthaliana (J).ThePlantJournal,
1999,17:119~130
930