全 文 ：第 38卷 第 8期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.38 No.8
2010年 8月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Aug.2010
1)黑龙江省自然科学基金项目(C2007-05)和黑龙江省普通高
校青年学术骨干支持项目(1153G046)资助。
第一作者简介:李艳萍 ,女 , 1973年 11月生 ,牡丹江师范学院生
命科学与技术学院 ,讲师。
通信作者:卓丽环 ,上海农林职业技术学院 ,教授。
收稿日期:2010年 2月 2日。
责任编辑:潘　华。
基于 nrDNAITS序列东北地区丁香属植物的
系统发育关系 1)
　　　　　　李艳萍　魏继承　　　 何　淼　　　　卓丽环
(牡丹江师范学院 ,牡丹江 , 157012)　　　　(东北林业大学)　　　　(上海农林职业技术学院)
　　摘　要　通过 nrDNAITS测序分析 , 对东北地区的丁香属内 11个种的系统发育关系进行了初步的研究。依
据 ITS序列中的信息位点 , 应用系统发育分析软件 MEGA2.1构建的分子系统树 ,在一定程度上支持了传统的依形
态特征进行的分类。但该系统树对于属下各分支间的关系作出了与传统的形态分类方法不同的推断:与在形态分
类中不同 , 短花冠亚属(Ligustrina)并未与其余种构成姐妹群关系 ,而是和巧玲花系(Pubescentes)关系最近 ,二者组
成的分支与欧丁香系(Vulgares)形成姐妹群关系;顶生花序系(Villosae)是系统树中的基部分支。
关键词　丁香属;nrDNAITS;系统发育
分类号　Q944.1
PhylogeneticRelationshipsoftheGenusSyringainNortheastChinaBasedonnrDNAITSSequence/LiYanping,WeiJicheng(MudanjiangTeachersColege, Mudanjiang157012, P.R.China);HeMiao(NortheastForestryUniversi-
ty);ZhuoLihuan(ShanghaiVocationalandTechnicalColegeofAgricultureandForestry)//JournalofNortheastForestry
University.-2010, 38(8).-45 ～ 47
Theinternaltranscribedspacer(ITS)regionsofnuclearribosomalDNAfrom11speciesofSyringainNortheastChinaweresequencedtoanalyzetheirphylogeneticrelationships.Thephylogenetictreewasreconstructedbymolecularevolution-
arygeneticsanalysissoftwareMEGA2.1 basedontheinformativesitesinITSsequences, andthetypologywascorrelated
withthetraditionalmorphologicalclassificationtosomeextent.However, therelationshipsbetweenthebranchesbeneath
thegenusofSyringainferredfromthephylogenetictreeweredifferentfromthosefromthemorphologicalmethod, namely,
subgenusLigustrinawasnotsistertotheremainingSyringaspecies, itwasasisterofSeriesPubescentesinstead, andthecladeincludingthesetwogroupswasasistertotheSeriesVulgares.SeriesVilosaeformedabasallineagewithinSyringa.
Keywords　Syringa;Internaltranscribedspacers(ITS);Phylogeny
　　丁香属(SyringaL.)是木犀科(Oleaceae)中一个重要属 ,
约 40种 ,主要分布于亚洲(中国 、朝鲜 、日本)和欧洲东南部。
我国是丁香的自然分布中心和栽培起源中心 , 产 30余种 [ 1] 。
崔洪霞等 [ 2]认为丁香属起源于中国西南 , 并以此为中心主要
沿中国西南—西北—华北—东北—朝鲜半岛—日本和中国西
南—中亚—欧洲的路径散布。在丁香属的系统学研究方面 ,
不同学者对于属内各类群间的分支关系问题存在着争议。
依据丁香属植物的形态特征 , Rehder在丁香属下划分了
2个亚属(Ligustrina和 Syringa)[ 3] 。 Ligustrina亚属内的种具
有近乔木习性(tree-likehabit), 花黄白色 , 花冠管短 , 雄蕊伸
出花冠管外;Syringa亚属内的种具有灌木习性(shrubbyhab-
it),花粉色 , 花冠管长 ,雄蕊包藏于花冠管内。 Rehder还依据
花序的着生方式 、叶的形状及叶上是否被毛将 Syringa亚属分
成 4个系:Pinnatifoliae系(羽叶丁香系),独具羽状复叶;Sy-
ringa系(真丁香系), 单叶 , 叶无毛 , 叶基平截或近心形;Pu-
bescentes系(巧玲花系), 叶明显具毛;Vilosae系(顶生花序
系),明显特点是花序自顶芽抽生 , 在其余 3个系中 , 花序均自
侧芽抽生。本文将应用 Rehder的分类命名方法 。
对于依据形态差异而进行的丁香属内各类群间的划分 ,
是否能够真正反映出不同类群间的系统演化关系的问题 , 国
外学者利用分子系统学方法进行研究的概况如下。
Kim和 Jansen等 [ 4]应用 cpDNARFLP(限制性酶切片段
长度多态性)对丁香属部分种进行了分析 , 在根据 cpDNA限
制位点差异绘成的聚类图中 , 丁香属植物共分成了 4组 , 除
Syringa系与 Pinnatifoliae系 2个类群外 , 均与传统的形态分
类划分表现出高度的一致。这一研究结果支持了将丁香属分
成 2个亚属的划分方法 , 但对传统形态分类中的 Series(系)
间划分没有提供较强的证据支持。
LiJ、AlexanderJH等 [ 5]通过测定 nrDNA的 ITS和 ETS
区的序列 , 对丁香属(Syringa)和女贞属(ligustrum)植物的系
统发育关系进行了分析 , 其中包括丁香属内的 12个种。其研
究结果支持了 Rehder对系的划分 , 4个系分别形成各自的一
个分支 , 但是 Villosae系仅有较低的自展支持率(<50%)。
LiJ、AlexanderJH等的研究与 Kim等依据 cpDNARFLP
得到的分支图不同 , ITS和 ETS分支图中 Syringa系是基部分
支 ,成为其余所有丁香属植物的姐妹群 ,但这种分支关系的自
展支持率仅有 53%。
由此可见 ,为确定丁香属内部的分支关系 ,需要引入更多
的数据进行综合分析。
核内核糖体 DNA(nrDNA)内转录间隔区(ITS)序列因其
具有长度保守 、变异位点丰富等特点 ,近年来已被广泛应用于
植物属间和种间的系统学研究 [ 6-7] 。本研究测定了东北地区
11种丁香属植物及外类群 Forsythiamandschurica的 nrDNA
ITS(含 5.8S编码区)序列 , 希望通过比较分析 ITS序列差异
和形态学特征 ,初步探讨东北地区丁香属植物的系统发育关
系 , 旨在为其分类学 、系统学 、资源保护和合理开发应用提供
一些分子依据。
1　材料与方法
1.1　ITS区全序列测定的材料
本研究共收集了分布于东北地区的 11种丁香属植物 , 并
选取连翘属的东北连翘作为外类群 [ 8] 。所用实验材料及来
源见表 1。
表 1　材料种名 、来源及 GenBank登录号
种　　名 来源 取样株数 GenBank接收号
红丁香(Syringavilosa) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022422
辽东丁香(S.wolfii) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022423
关东丁香(S.velutina) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022416
小叶丁香(S.microphyla) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022425
紫丁香(S.oblata) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022424
朝鲜丁香(S.dilatata) 东北林业大学 3 DQ022427
欧洲丁香(S.vulgaris) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022426
什锦丁香(S.chinensis) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022419
雾灵丁香(S.wulingensis) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022420
北京丁香(S.pekinensis) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022418
暴马丁香(S.reticulatavar.mandschurica)黑龙江省森林植物园 3 DQ022417
东北连翘(Forsythiamandschurica) 黑龙江省森林植物园 3 DQ022428
1.2　实验方法
取新鲜叶片采用 CTAB法提取总 DNA[ 9];依据 GenBank
数据库中已发表的丁香属植物 nrDNAITS序列设计如下引
物 [ 10]:P1:5 -TCGAAACCTGCAAAGCAG-3 和 P2:5 -
TAAACTCAGCGGGTAATC-3 ;PCR反应为 20μL体系 ,包含
2μL10 ×PCRbuffer, 2 μLdNTP(2.5 mmol/L), P1、P2(20
μmol/L)各 0.5μL, rTaq酶 1.5U, DNA模板 40 ～ 100ng。反
应程序为:94℃预变性 5min;94℃变性 30s, 60℃退火 30s,
72℃延伸 1min, 30次循环;72 ℃保温 15 min。 PCR产物经
0.8%琼脂糖凝胶电泳 ,用胶回收试剂盒进行纯化回收。回收
产物用 pGEM-T载体(Promage)连接 ,用 TOP10感受态细胞
进行常规热激转化。经蓝白斑筛选 、检测后 , DNA测序由上
海博亚生物技术公司完成。
1.3　分析方法
利用 BLASTN将实验中测得的 ITS序列与 NCBI数据库
中已发表的 ITS序列进行同源性比较 , 分别确定出 ITS1、 5.8S
及 ITS2序列区段。实验所测得的 ITS序列数据已被 GenBank
接收 , 种名及接收序号见表 1。运用 ClustalW程序对所测得
序列进行对位排列。将对位排列后的数据导入系统发育分析
软件 MEGA2.1对序列进行统计和分支分析。
2　结果与分析
2.1　ITS区序列长度和变异信息
在东北地区的丁香属植物中 , 整个 ITS序列长度变异范
围为 620 ～ 623bp(包括 5.8 SrDNA)。在 ITS1区 , 除 S.vul-
garis长度为 239bp外 ,其余均为 241bp。 5.8SnrDNA序列长
度均为 159bp。在 ITS2区 , 长度变异范围为 222 ～ 223bp。整
个 ITS区排序后的总长度为 623bp, 基中 ITS1、 5.8S和 ITS2
排序后的长度分别为 241、159和 189bp。将空位作缺失处理
时 , 整个 ITS区共有变异位点 79个 , 其中 ITS1、 5.8S和 ITS2
的变异位点分别为 36、9和 34个。 5.8 SrDNA变异较小 , 保
守位点占 94.3%, 只有 2个位点发生转换 , 没有颠换发生。
其中 ITS2区的信息位点所占比例略高于 ITS1, 而 ITS1区的
转换 /颠换值高于 ITS2区。由于 5.8SDNA序列过于保守 , 不
适于用作系统发育分析 , 因而在本研究中利用 ITS1和 ITS2
区序列进行系统发育分析。
2.2　系统发育分析
将对位排列后的序列导入 MEGA2.1,选择 Krima2-Par-
amenter核酸距离模式计算遗传距离 [ 10] 。
分别采用不设外类群的算术平均除权配对法(UPGMA)、
设外类群时的邻位相接法(NJ)和最大简约法(MP)进行聚类
分析。选择近缘属连翘属内的 Forsythiamandschurica作为外
类群 ,应用最大简约法(MP)进行聚类分析所得系统树(图
1)。系统树分支上数字为 Bootstrap重复抽样检验得出的分
支支持率。应用不同建树方法所得系统树的拓扑结构基本一
致 ,仅在各分支的支持率上存在差异。
图 1　MP系统树
在依据形态特征进行的丁香属内等级划分时 ,常划分为
亚属(国内有些研究中将此等级定为组)、系 、种 3级 , 即 Sub-
genusLigustrina和 SubgenusSyringa,其中 SubgenusSyringa内
包括:系 1.SeriesVilosae(顶生花序系)、系 2.SeriesPubes-
centes(巧玲花系)、系 3.SeriesVulgares(欧丁香系 , 或称为 Se-
riesSyringa(真丁香系))、系 4.SeriesPinnatifoliae(羽叶丁香
系)[ 11] 。从遗传距离矩阵和依据 3种方法分别构建的系统树
中可以看出 ,分别来自各个系内的种间遗传距离较小 ,基本处
于系统树上的同一分支上 , 这一结果说明 ITS序列能够部分
支持依形态性状进行的丁香属内等级划分。
3　讨论
3.1　短花冠亚属(Ligustrina)的系统位置
该亚属内各种的共同形态特征是花冠白色 、黄白色 ,花冠
管与花萼等长或略长 , 花丝伸出花冠管外 , Rehder认为该亚
属植物具有乔木习性(tree-habit)。本研究中选取的该亚属植
物 S.pekinensis和 S.reticulatavar.mandschurica,在不同的聚
类图中均形成一个单系类群 , 其中在 NJ树和 MP树中自展支
持率达到 95%。但是该类群并未与其余所有长花冠亚属类
群形成姐妹群关系 , 而是因其具有花序自侧芽抽生这一性状
特征而与短花冠亚属的 Sringa系和 Pubescentes系归于同一类
群。在 LiJ、AlexanderJH等的研究结果中 , Ligustrina亚属在
ITS和 ETS序列的严格一致树中 , 组成一个支持率很高的分
支 ,但这一分支并没有与其余所有丁香属植物形成姐妹群 , 而
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是与 Vilosae系和 Pubescentes系位于同一分支内 , Ligustrina亚
属和 Pubescentes系只有较弱的姐妹群关系 , 自展支持率小于
50%。这种分支关系需要更多的数据来进一步验证 , Ligustri-
na亚属是否为丁香属内的基部分支 , 还是起源于 Syringa亚
属内部 , Syringa亚属是否为一个并系类群 , 需要进一步加以
研究。在这一类群中 , Ligustrina亚属与 Pubescentes系的亲缘
关系最近 ,这 2个分支形成姐妹群关系的自展支持率最高达
到 67%, 能否确认这 2个类群为丁香属内最近缘姐妹群 , 需
要扩大研究类群后 , 才能做出更进一步推断。
3.2　顶生花序系 Villosae的系统位置
在依据形态进行的分类中 , Vilosae系因其具有花冠管远
比花萼长 、花药包藏于花冠管内等特征而归于 Syringa(长花
冠亚属),该系类群独具由顶芽抽生的花序 , 这一性状特征明
显区分于该亚属中的其它类群。在不同的聚类图中 , 具有顶
生花序的 S.villosa和 S.wolfii均形成一个单系类群 ,这说明
共同具有顶生花序这一特征的同源性极高。该类群与其余所
有类群形成了一个姐妹群的关系 , 这种分支结构在 NJ树和
MP树中均得到了较高的自展支持率(bootstrap)。这与依据
形态划分的顶生花序系隶属于长花冠亚属的分类标准不
一致。
3.3　系统发育树中的基部分支问题
在根据本实验测得数据及 GenBank中已发表的 ITS序列
数据构成的组合数据集构建的 NJ系统树中(NJ系统树图
略),来自于东北地区的 S.vilosa和 S.wolfi首先从基部分
出 , 成为系统树的基部分支 ,与其余所有丁香属植物构成姐妹
群关系。这表明分布于东北地区的 S.vilosa和 S.wolfi与该
系的其余种有着较大的遗传差异 , 这种差异也体现在东北地
区的 S.villosa和 S.wolfi与 GenBank中相同种的不同个体间。
在去除这 2条序列后重新构建的系统发育树中 , 依然是来自
Vilosae系的种位于分支的基部 ,这种拓扑结构的自展支持率
始终在 50%以上。从对组合数据集的分析可以看出 , Villosae
系很可能是系统树中的基部分支。由此可推断 ,顶生花序系
可能是丁香属植物演化过程中最早分化出的类群 , 但该分支
关系没有得到很高的支持率。在 NJ系统树中 , ITS序列没有
支持 Vilosae系内所有种成为一个明显的单系类群(但从完
全由遗传距离确定的 UPGMA无根树中 , 所有 SeriesVillosae
内的种处于同一个大的分支上 , UPMGA树略)。
在 Kim和 Jansen在根据 cpDNA限制位点差异将丁香属
植物分成的 4组中 , 分支Ⅰ包括 Ligustrina(短花冠亚属), 是
基部分支 , 与其它所有具有短花冠的类群构成姐妹群关系
(即 Ligustrina亚属为属内的基部分支);分支Ⅱ由 Syringa系
和 Pinnatifoliae系共同组成 ,这 2个类群间具有较高的遗传一
致度;分支Ⅲ包括了来自 SeriesPubescentes中的种;分支Ⅳ来
自 Vilosae系 ,这一分支内的种间 cpDNA片段差异很小。组
Ⅱ与由组Ⅲ和组Ⅳ共同组成的分支构成姐妹群的关系 , 4个
分支的关系为(Ⅰ (Ⅱ(Ⅲ , Ⅳ)))。
在 LiJianhua等的研究中 , Syringa系为系统树的基部分
支;在KiJoongKim等 [ 4]的研究中 , Ligustrina亚属为系统树的
基部分支。本实验得出的结论与上述研究均不相同。由此可
见 ,为明确丁香属的基部分支问题 ,需要增加该属的其它基因
序列进行综合分析 , 并对 Villosae系的系统位置的做出可信度
更高的推断。
3.4　ITS序列资料在丁香属系统学研究中的价值
近年来 ,植物系统学家认识到 nrDNAITS序列的优点 , 并
将其广泛的应用于植物分子系统学研究中 , 取得了可喜的成
绩。因为不同类群的起源时间及进化速率不同 , 其 ITS序列
所含有的信息量是不一样的 , 因而在不同的植物类群和不同
的分类阶元上 , ITS序列的价值是有差异的。在本研究中 , 在
实验测得东北地区丁香属内 ITS区(ITS1+ITS2)区内信息位
点达到 6.3%,相对来讲类群间碱基变异量较小 ,但在本研究
的后续进展中 , 在对包括 GenBank中所有发表了 ITS区序列
的丁香属植物进行分析时 , 数据集的信息位点达到 11.5%。
由此可见 , 在整个丁香属内 , ITS区序列信息位点比较丰富。
从分支分析的结果来看 , 其各类群的划分与形态划分具有较
高的一致性 , 说明 ITS区在丁香属植物的系统发育研究中可
以提供较强的证据 , 从而对属内各分支间的演化关系作出进
一步的推断。
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