全 文 ：Chinese Journal of Clinical Medicine, 2011.Vo l.18 , No.2　　　中国临床医学　2011 年 4 月　第 18 卷　第 2 期　
　·论著· 　
胡椒属药材核糖体 DNA的 ITS序列分析及其分子鉴定
蔡诚诚　杨志业　谢晖　潘胜利
(复旦大学药学院生药学教研室 ,上海　201203)
摘要　目的:研究核糖体 DNA(rDNA)的 ITS 序列在胡椒属大叶蒟及其近缘药用植物及药材鉴定中的适用性。方法:聚合酶
链反应(Polymerase Chain Reac tion , PCR)扩增 ITS 序列测序 , 用 DNA ssist v ersion 2.2 软件进行序列比对 , 并计算同源性。
结果:胡椒属药材 ITS 序列与外类群 ITS 序列比对同源性均小于 67.0%, 属内序列间两两比对同源性均大于 82.0%,同种植
物则大于 99.0%。结论:ITS 序列作为胡椒属药材鉴定依据具有一定的适用性和可靠性。
关键词　胡椒属;　ITS 序列鉴定
中图分类号　Q946　　文献标识码　A
Identification of Medicinal Plants from Piper L.Based on rDNA ITS Sequences　CA I Chengcheng 　Y ANG
Zhiye　X IE Hui 　P AN S heng li　Department o f Pharmacognosy , S chool of P harmacy , FudanUniver-
sity , Shanghai 201203 , China
Abstract　Objective:Study on the applicability o f rDNA ITS sequence in identification of medicinal plants from Piper L.and
its related species.Methods:The ITS regions o f these species w ere amplified by PCR and sequenced , and their sequence s we re
analyzed by DN Assist Ve rsion 2.2.Results:Homo logous alignment indica ted that the consanguinity of the ITS sequences be-
tw een Genus Piper and outg roups w as lower than 67.0%, and that within genus Pipe r wa s highe r than 82.0%.Fo r the same
species , the consanguinity w as higher than 99.0%.Conclusions:The ITS sequences may serve as reliable molecula r ma rke rs
for identifica tion of Genus Piper and its related species.
Key Words　Piper;　ITS sequences
基金项目:国家科技部重大专项“ 重大新药创制”(编号:
2009ZX09103-075);上海市科委中药现代化专项(编号:
08DZ1971203)
通讯作者　潘胜利 , E-mail:slpan@shmu.edu.cn
　　胡椒属(Pipe r L.)为胡椒科(Piperaceae)中最
大的一个属 ,具有重要的商业 、医学价值 。除中国
外 ,本属植物在拉丁美洲 、亚洲作为民间药物广为使
用[ 1] 。胡椒属植物多为灌木或藤本 ,全世界约有
2000种 ,主要分布在热带和亚热带地区。
目前 ,关于胡椒属的鉴定 ,主要基于雄蕊的数
目 、位置 ,心皮的数目 ,苞片的形态 、花序的位置和叶
脉形状等一些形态学特征[ 2-3] 。由于本属都是小型
花 ,且有雌雄同株或异株或杂性以及两性花的现象 ,
种间外形又极为相似 ,所以形态学鉴定难度较大 。
有学者对卡瓦胡椒及其近缘植物进行过 RAPID 和
SCA R分子标记等的研究[ 4] ,但是此种方法对 DNA
完整性要求较高 ,对于降解较严重的中药药材则不
能适用。
随着分子生物技术的迅速发展 ,DNA 分子标记
技术在中药鉴定方面的应用已取得了许多进展。近
年来 ,核糖体 DNA(rDNA)的 ITS(inte rnal t ran-
scribed spacer)区域被广泛用于植物属间与种间系
统关系与分类的研究[ 5] 。 ITS是 rDNA 上的内转录
间隔区 ,位于 18S 和 26S rDNA 基因之间 ,被 5.8S
基因分为两段 ,即 ITS1 和 I TS2 ,总长度为 600 ～
700bp ,其中 ,5.8S rDNA 的长度非常保守 ,一般为
163bp或 164bp , ITS1和 I TS2的长度也比较保守 ,
但核苷酸序列变化较大 ,可以提供丰富的系统学信
息 。ITS1和 I TS2作为非编码区 ,受外界环境因素
的影响较小 ,进化速度较快 ,核苷酸序列变化较大 ,
且其变异以相互独立的点突变为主 ,是 rDNA 中的
中度保守区 ,因此可为植物属以下水平的研究提供
较丰富的变异位点和信息位点的系统学信息。
本文选取了 13种胡椒属药材 ,进行 ITS 序列分
析 ,探讨其在胡椒属药材鉴定中的可行性与适用性。
1　资料与方法
1.1　材料　收集胡椒属植物和药材标本 13种 23
份。药材年份跨度为 2003年—2009年 ,包括 2003年
5份 ,2004年 1份 , 2005年 11份 , 2006年 6份 , 2009
年 5份 。标本名称 、采集时间 、采集地点及 ITS 序列
号见表 1。所有标本均经复旦大学药学院潘胜利教
授鉴定 。其中 ,毛蒟的序列从 Genbank中得到。
1.2　方法 　
1.2.1　基因组 DNA 的提取 采用基因组 DNA 小
量试剂盒(A xyPrep)提取植物基因组 DNA 。 1%琼
脂糖电泳检测。紫外分光光度法检测 DNA 浓度和
纯度。 -20 ℃冰箱保存 ,备用 。
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　中国临床医学　2011 年 4 月　第 18 卷　第 2 期　　Chinese Journal of Clinical Medicine , 2011.Vol.18 , No.2
表 1　研究材料的采集时间及地点
名称 学名 采集时间 采集地点 序列编号 序列号
大叶蒟 Piper laet ispicum 2003年 9月 海南省五指山 DYJ EF450259
大叶蒟 Piper laet ispicum 2005年 12月 海南兴隆热带植物园 HJ13 EF450261
大叶蒟 Piper laet ispicum 2005年 12月 海南省五指山 HJ14 EF450262
大叶蒟 Piper laet ispicum 2005年 12月 海南兴隆城乡湾水库 HJ17 EF450263
山蒟 Piper hancei 2009年 10月 广东从化 SL1 HQ260457
复毛胡椒 Piper bonii 2005年 12月 海南五指山 FM HQ260452
光轴苎叶蒟 Piper boehm eriaefolium var.t onkinense 2005年 12月 海南五指山 GZ HQ260454
蒌叶 Piper bet le 2005年 12月 广州市清平中药材市场 HJ6 EF450279
蒌叶 Piper bet le 2005年 12月 广东省肇庆鼎湖山自然保护区 HJ9 EF450280
假蒟 Piper sarmen tosum 2009年 10月 广东药学院植物园 GD HQ260453
假蒟 Piper sarmen tosum 2005年 12月 华南植物园 HJ1 EF450285
假蒟 Piper sarmen tosum 2003年 9月 海南省五指山 J J EF450286
华南胡椒 Piper au st rosinense 2006年 5月 广东肇庆 D1 EF450273
华南胡椒 Piper au st rosinense 2005年 12月 海南省万宁市 HJ8 EF450277
华南胡椒 Piper au st rosinense 2005年 12月 海南省五指山 HJ16 EF450278
海南蒟 Piper hainanense 2003年 9月 海南省五指山 H EF450281
海南蒟 Piper hainanense 2005年 12月 海南省万宁市 HJ10 EF450282
胡椒 Piper nigrum 2005年 12月 海南省万宁市 HJ12 EF450283
胡椒 Piper nigrum 2003年 9月 海南省五指山 YN EF450284
荜菝 Piper longum 2003年 9月 海南省万宁市 BB EF450288
海风藤 Piper kad sura 2004年 10月 福建 HF1 EF450290
毛蒟 Piper hongkongense - - VG105 DQ868722
草胡椒 Peperomia pel lucid 2006年 5月 广东省肇庆鼎湖山自然保护区 D9 EF450291
1.2.2　ITS 序列扩增　I TS 序列采用 I TS5 、ITS4
双引物进行扩增 ,引物序列分别为:ITS5:5 -GGA
AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3 , ITS4:5 -
TCC TCC GCT TAT TCA TAT GC-3 [ 6] 。引物由上
海英骏生物技术有限公司提供。反应体系 50 μL ,包
括:模板 DNA 40 ng ,10×PCR 反应缓冲液 5.0 μL ,
dN TP(各 2.5 mmol ·L-1)2 μL , 引物(10 μmol ·
L-1)各 2μL , Taq酶 0.4μL (5 U ·μL-1),加灭菌双
蒸水(Mil lipore)至 50 μL。PCR扩增条件为:94 ℃
预变性 5 min ,然后进入如下循环:94 ℃变 30 s ,
48 ℃退火 45 s ,72 ℃延伸 45 s , 29个循环 ,72 ℃延
伸 5 min。扩增产物经 A xyPrep DN A 凝胶回收试
剂盒对目标条带进行纯化 ,使用 1.1%琼脂糖凝胶
电泳 。
1.2.3　单克隆挑选与测序 胶回收纯化后的 ITS 序
列直接测序 ,部分结果有双峰出现 。此结果可能与
多拷贝在进化过程中尚未形成完全一致的序列有
关。因此 ,将割胶回收产物连接入 pMD18-T 载体 ,
转化大肠杆菌感受态细胞 。每个样品随机挑选 3 ～
6个阳性克隆 。测序引物为 T 载体通用引物 ,样品
送至上海美吉生物医药科技有限公司测序 ,测序仪
器为 ABI 3730 XL 自动测序仪。
1.2.4　序列分析 每个样本获得的序列使用Clustal
X Version 1.8进行对比 ,选择 1条严格一致序列作
为该样本的代表序列 ,并将所得到序列用 Clustal X
进行同源性对齐。将序列鉴定结果与形态鉴定结果
核对 ,确认后在 GenBank 登记注册 ,序列号如表 1
所示。用DNA ssist v ersion 2.2软件对得到的序列
进行两两比较 ,并计算其同源性 。
2　结　　果
2.1　DNA得率　紫外分光光度法检测 ,药材 DNA
得率为 3.2×10-4 ～ 1.28×10-3 。OD260/ 280值为1.734
～ 2.258。
2.2　两两比对分析 　I TS 序列比对结果见表 2。
胡椒属植物 ITS 序列与外类群 ITS 序列(来源于胡
椒科草胡椒属草胡椒 Peperomia pellucida)比对同
源性均小于 67.00%,属内序列间两两比对同源性
均大于 82.00%。
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Chinese Journal of Clinical Medicine, 2011.Vo l.18 , No.2　　　中国临床医学　2011 年 4 月　第 18 卷　第 2 期　
表 2　ITS序列比对结果
DYJ HJ13 HJ14 HJ17 SL1 FM VG105 GZ HJ6 HJ9 GD HJ1 JJ D1 HJ8 HJ16 H HJ10 HJ12 YN BB HF1 D9
DYJ
HJ13 99.26
HJ14 99.26 100.00
HJ17 99.26 100.00100.00
SL1 89.97 89.23 89.23 89.23
FM 89.25 88.51 88.51 88.51 96.47
VG105 91.08 90.36 90.36 90.36 90.41 89.25
GZ 91.23 90.65 90.65 90.65 89.97 88.95 97.47
HJ6 93.34 92.89 92.89 92.89 90.56 91.02 91.72 91.27
HJ9 93.79 93.05 93.05 93.05 90.41 90.87 91.86 91.42 99.85
GD 87.74 87.01 87.01 87.01 86.86 86.13 89.93 90.36 87.88 88.03
HJ1 87.59 86.86 86.86 86.86 86.72 85.99 89.78 90.22 87.73 87.88 99.85
JJ 87.57 86.84 86.84 86.84 86.84 86.11 89.91 90.35 87.87 88.01 99.42 99.27
D1 94.06 93.32 93.32 93.32 89.53 89.10 91.68 91.53 94.08 94.23 87.74 87.59 87.57
HJ8 94.06 93.32 93.32 93.32 89.53 89.10 91.68 91.53 94.08 94.23 87.73 87.59 87.57 99.85
HJ16 93.91 93.18 93.18 93.18 89.38 88.95 91.52 91.38 93.93 94.08 87.59 87.45 87.43 99.85 99.70
H 91.12 90.38 90.38 90.38 92.92 91.90 91.72 91.12 90.98 91.12 87.88 87.74 87.72 90.98 90.98 90.83
HJ10 91.26 90.52 90.52 90.52 93.07 92.05 91.85 91.26 91.12 91.27 88.03 87.88 87.87 91.11 91.11 90.96 99.85
HJ12 94.06 93.47 93.47 93.47 90.12 89.10 91.06 90.79 93.49 93.64 87.44 87.30 87.28 93.76 93.76 93.60 90.53 90.67
YN 93.91 93.32 93.32 93.32 89.97 88.95 90.91 90.64 93.34 93.49 87.30 87.15 87.13 93.61 93.61 93.45 90.38 90.52 99.85
BB 83.97 83.54 83.54 83.54 83.54 82.42 87.62 87.48 84.67 84.81 88.89 88.75 88.89 85.09 85.09 84.95 84.81 84.95 83.97 83.83
HF1 91.30 90.29 90.29 90.29 97.65 96.91 90.59 90.44 92.06 91.91 87.45 87.30 87.43 90.88 90.88 90.74 92.65 92.79 90.44 90.29 83.54
D9 64.93 64.69 64.69 64.69 65.49 64.51 65.87 64.78 65.68 65.83 63.94 63.80 63.89 65.53 65.53 65.63 66.12 66.22 65.42 65.22 63.71 65.44
3　讨　　论
3.1　基因组 DNA 的提取　由于药材样本年代跨度
较大 ,所以 DNA得率存在一定的差异 ,年代较久的药
材DNA得率较低 。用 OD260/280值衡量 DNA纯度 , <
1.8 ,表示所提取 DNA 中蛋白质含量较高;>2.0 ,表
示RNA 含量较高。OD260/280值较高 ,主要原因是药材
时间较久 ,双链 DNA 降解为单链。故提取时要注意
以下问题:①提取的过程中要注意植物组织的用量 ,
避免组织用量过大 、杂质过多 ,超过制备柱的负荷导
致无法被吸附的杂质(蛋白 、多糖等)随洗脱进入
DNA溶液 ,为后续工作带来麻烦;②叶部位的 DNA
含量较高 ,但降解较根茎部位严重;根茎部位中 ,韧皮
部的杂质较木质部多。所以 ,对于近两年内搜集到的
植物样本 ,可提取其叶的 DNA;对于年代较久的标
本 ,可提取其木质部的 DNA 。
3.2　两两比对结果适用性　本研究中获得的同种
植物来源的药材 ,包括大叶蒟样品(DYJ 、HJ13 、
HJ14 、HJ17), 蒌叶样品(HJ6 、HJ9), 假蒟样品
(GD 、HJ1 、JJ),华南胡椒(D1 、HJ8 、HJ16),海南蒟
(H 、HJ10)和胡椒(HJ12 、YN), 种内同源性均 >
99.00%,因此 ,可将序列同源性大于 99.00%作为
鉴定指标 。
值得注意的是 ,海风藤(HF1)与山蒟(SL1)两两之
间的同源性为 97.65%,差异较小。从形态学上看 ,两
者均属于胡椒属离苞组 ,且均为单性花 ,雌雄异株 ,区
别在于山蒟总花梗与叶柄等长或略长 ,海风藤总花梗
略短于叶柄;从化学成分上看 ,海风藤与山蒟中海风藤
酮 ,细叶青蒌藤酰胺等的含量均比较高。两者差异较
小 ,与两两比对数据结果一致。毛蒟(VG105)与光轴苎
叶蒟(GZ)两两之间的同源性为 97.47 ,差异较小。从形
态学上看 ,两者亦均属于胡椒属离苞组 ,花单性 ,雌雄
异株 ,聚集成与叶对生的穗状花序 ,主要区别在于光轴
苎叶蒟花序轴无毛 ,而毛蒟花序轴被疏柔毛。
综上 , I TS序列在胡椒属药材鉴定中具有一定
的适用性和可靠性;同源比对相似性大于 82.0%可
认定为同属植物 ,大于 99.0%可作为种认定的指
标;但要对所有胡椒属药材准确鉴定 ,仍需与其他性
状相结合 ,进行相关深入的研究 。
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