全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 6期，第 1283-1288页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.6, 1283-1288
研究报告
Research Report
苹果属无融合生殖相关基因 SERK1遗传转化的研究
张丽杰 郭苏曼 董文轩 *
沈阳农业大学,辽宁, 110866
*通讯作者, wxdong63@126.com
摘 要 本研究以 pBI121为植物表达载体，在已构建的无融合生殖基因表达载体 pBI121-MhSERK1和
pBI121-MhdSERK1的基础上，利用根癌农杆菌介导法，将苹果属无融合生殖相关基因 SERK1转入受体植株
烟草中。研究结果表明：烟草叶片浸染后，经共培养和选择培养形成再生芽，分别获得 7株 pBI121-MhSERK1
和 6株 pBI121-MhdSERK1转烟草抗性植株，PCR检测证明已成功获得 MhSERK1和 MhdSERK1烟草转化
株系。本研究可为下一步无融合生殖相关基因功能验证研究奠定基础。
关键词 SERK1基因,无融合生殖相关基因,烟草,遗传转化
Study on Genetic Transformation of Apomixis Related Gene-SERK1 in
Malus
Zhang Lijie Guo Suman DongWenxuan *
Shenyang Agricultural University, Liaoning Province, Shenyang, 110866
* Corresponding author, wxdong63@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.001283
Abstract In this study, based on the constructed expression vectors of pBI121-MhSERK1 and pBI121-MhdSERK1,
we transferred an apomixis related-gene in Malus, SERK1, to tobacco plants with pBI121 as expression vectors by
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The results showed that the transgenic plants of 7
individuals with pBI121-MhSERK1 and 6 individuals with pBI121-MhdSERK1 were obtained after co-culture
and selective culture the tobacco leaves, and PCR detection demonstrated that MhSERK1 and MhdSERK1 were
transferred into tobacco successfully. The study lay a foundation of apomixis gene proving genes function.
Keywords SERK1 gene, Pingyi Tiancha and hybrids offsprings, Tobacco, Genetic transformation
收稿日期：2014-12-15 接受日期：2015-02-27 网络出版日期：2015-04-15
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2813
基金项目：本研究由国家自然科学基金(30971975)资助
植物转基因研究的方法有很多，但应用较为广
泛的就是根癌农杆菌介导的外源基因遗传转化技
术。目前已获得的 200多种转基因植物中大约 80%
以上是由农杆菌介导方法完成遗传转化的。农杆菌
介导法是植物遗传转化最有效的一种方法，其转化
方法简单，转化效率比较高，转化的外源 DNA的结
构也较为完整，整合后外源基因变异比较小，而且整
合位点也较为稳定，因此，在转基因研究中应用最
多。而在植物转基因研究过程中，由于烟草是一年生
草本经济作物，其生长速度快、生命周期短，对转化
条件要求不是十分苛刻，并且具有很强的愈伤组织
分化能力及再生能力，使烟草早已成为转基因研究
的模式植物。
平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)是苹果的优
良砧木之一，也是中国特有的植物资源，属湖北海棠
(Malus hupensis Rehd)的一个类型(束怀瑞等, 1999;李
光杰, 2009;史兴征, 2010)，是无融合生殖型矮化砧
木育种的重要母本材料，在生产上具有重要的应用
价值(张丽杰, 2013)。本课题组在前期研究中利用普
通的二倍体扎矮山定子与三倍体平邑甜茶杂交获得
了大量的四倍体皱叶矮生杂种后代，经鉴定，这些杂
种后代皱叶矮生株系无融合生殖能力显著下降。
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
为进一步探讨无融合生殖机理，本研究以苹果
属三倍体平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交获得的四
倍体杂种后代为试验材料，通过同源克隆法获得平
邑甜茶和杂种后代的无融合生殖相关 MhSERK1和
MhdSERK1基因的 cDNA全长，并构建了苹果属无
融合生殖基因 SERK1植物表达载体 pBI121-MhSE-
RK1和 pBI121-MhdSERK1，在此基础上研究以本生
烟草无菌组培苗叶片为试验材料进行转基因研究，
以期获得转基因烟草株系，为下一步无融合生殖相
关基因功能验证研究奠定基础。
1结果与分析
1.1转化受体烟草组培苗的获得
取适量本生烟草种子，先用蒸馏水冲洗，后用浓
度 70%的酒精消毒处理 30 s，再用 0.1%的 HgCI2灭菌
10 min，然后用无菌水冲洗 5~7次，置于无菌滤纸上
备用。将灭菌后的烟草种子接种在不添加任何植物激
素的 MS基本培养基上，放于培养室内培养，培养室
温度(23±2)℃，空气湿度 70%左右；大约 20 d本生烟
草种子萌发，获得烟草无菌苗。每 20 d继代 1次。
1.2农杆菌介导的烟草遗传转化
将烟草组培苗叶片剪成 0.5 cm大小的小块，接种
在预培养基上，暗培养 2 d后，将烟草叶片放入菌液浓
度 OD值为 0.5的农杆菌中进行浸染 8~10 min，经过
EHA105 (pBI121-MhSERK1 和 pBI121-MhdSERK1)
浸染后，将烟草叶片接种在共培养基上，暗培养 2 d
(图 1A)，然后用MS液体悬浮液清洗 2次转移至含
有抗生素的选择培养基上，置于暗培养 2周后，转入
光下培养 3~4周，在烟草叶片切口处有抗性愈伤组
织产生，愈伤组织呈淡绿色，抗性愈伤组织在选择培
养基能够正常生长，逐渐长大，1月左右在抗性愈伤
组织上可见绿色不定芽(图 1B)。将不定芽接种在含
有 50 mg/mL的卡纳霉素培养基上继续培养(图 1C;
图 1D)，抗性芽分化伸长(图 1E;图 1F)，非抗性芽逐
渐白化死亡。将抗性芽进行生根培养，直至生出 5条
以上长约 2~5 cm的根系(图 1G;图 1H)，然后进行炼
苗移栽。移栽前将转化苗取从培养瓶中取出用流水
洗净根部琼脂，然后用 0.2% CaCI2 浸泡根部约
10~15 min，移栽至盛有草炭土的营养钵中，浇透水，
覆盖塑料薄膜，放置大棚内，大约 1周后去掉塑料薄
膜，移栽苗可以正常生长(图 1I)。目前通过表达载体
pBI121-MhSERK1 和 pBI121-MhdSERK1 转化各获
得 7株和 6株转化烟草抗性植株。
1.3转基因烟草植株的抗性筛选和分子鉴定
分别选取 7株 MhSERK1和 6株 MhdSERK1的
转基因烟草抗性植株组培苗叶片提取 DNA，1.0%的
琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，提取的抗性植株叶
片 DNA较为完整(图 2)，可以用于后续的 PCR实验。
分别以 MhSERK1、MhdSERK1的烟草转基因抗性植
株的烟草叶片 DNA为模板，进行 PCR扩增，以清水
作阴性对照，未转化烟草株系 CK作为对照，质粒作
为阳性对照进行 PCR扩增；进行目的基因、NptII基
因检测。PCR检测结果表明，在所获得的 MhSERK1
和 MhdSERK1 转基因烟草抗性植株中可以扩增出
NptII基因片段，而清水阴性对照和未转化植株扩不
出该条带，阳性质粒可以正常扩出条带(图 3A;图 3B)；
分别以目的基因 MhSERK1 和 MhdSERK1 进行扩
增，同样选择清水作阴性对照，未转化株系 CK作为
对照，质粒作为阳性对照进行 PCR扩增；除清水阴性
对照、未转化植株没有扩增出目的条带外，其他转化
株系均扩增出目的条带(图 4A;图 4B)，证明已成功获
图 1 MhSERK1和 MhdSERK1转化烟草植株的获得
注: A:共培养; B:选择培养; C,D:分化培养; E,F:烟草抗性植
株的获得; G,H:烟草抗性植株生根培养; I:烟草抗性植株移栽
Figure 1 Acquisition of transformed tobacco plant carrying
MhSERK1 and MhdSERK1
Note: A: Co-culture; B: Selective culture; C,D: Differentiation
culture of resistant plant; E,F: Acquisition of tobacco resistant
plant; G,H: Rooting culture of tobacco resistant plant; I: Trans-
plantation of tobacco resistant plant carrying MhSERK1 and
MhdSERK1
1284
得MhSERK1和MhdSERK1基因烟草转化株系。
1.4转基因烟草植株的表型性状
将移栽的转基因烟草植株放到科研基地大棚内
进行培养，初期转基因植株生长正常(图 5A)，从表型
上看未见异常。随着培养时间的推移，在培养时间、
地点、温度、水分特征相同的条件下，转基因植株出
现明显的表型特征，转 MhdSERK1基因的烟草植株
表型上具有明显矮化特征，转 MhSERK1的烟草植株
表型特征上也明显低于对照烟草株系(图 5B)。在本
课题组前期研究过程中，采用三倍体具有高无融合
生殖能力的平邑甜茶作母本，以二倍体扎矮山定子
图 2烟草转化植株叶片总 DNA的提取
注: 1~7: MhSERK1转化烟草; 8~13: MhdSERK1转化烟草
Figure 2 Total DNA extraction of leaf from tobacco transformed
plant
Note: 1~7: MhSERK1 transformed tobacco; 8~13: MhdSERK1
transformed tobacco
图 3烟草抗性株系 NptII扩增
注: A: MhSERK1株系; B: MhdSERK1株系; M: 100 bp marker;
1:清水; 2:未转化植株; 3:质粒阳性对照; 4~10: MhSERK1转
化烟草抗性植株; 11~16: MhdSERK1转化烟草抗性植株
Figure 3 Amplification of the NptII fragment in resistant tobacco
Note: A: MhSERK1 line; B: MhdSERK1 line; M: 100 bp marker;
1: Fresh water; 2: Untransformed plant; 3: Plasmid positive con-
trol; 4~10: Transformed tobacco plants with MhSERK1; 11~16:
Transformed tobacco plants with MhdSERK1
图 4烟草抗性株系的 MhSERK1和 MhdSERK1片段扩增
注: A: MhSERK1片段; B: MhdSERK1片段; M: 100 bp marker;
1:清水; 2:未转化植株; 3:质粒阳性对照; 4~10: MhSERK1转
化烟草抗性植株; 11~16: MhdSERK1转化烟草抗性植株
Figure 4 Amplification of the MhSERK1 and MhdSERK1 frag-
ment in resistant tobacco plant.
Note: A:MhSERK1 fragment; B:MhdSERK1 fragment; M: 100 bp
marker; 1: Fresh water; 2: Untransformed plant; 3: Plasmid posi-
tive control; 4~10: Transformed tobacco plants with MhSERK1;
11~16: Transformed tobacco plants with MhdSERK1
图 5 SERK1基因转化烟草植株的表型变化
注: A:表型生长正常的转基因烟草抗性植株; B:从左到右分
别为杂种后代,平邑甜茶, CK
Figure 5 Phenotypic changes in SERK1 gene transformed tobac-
co plants
Note: A: Normal growth with phenotypes of resistant plants of
transgenic tobacco; B: Left to right are Hybrid offspring, Pingyi
Tiancha, CK, respectively
苹果属无融合生殖相关基因 SERK1遗传转化的研究
Study on Genetic Transformation of Apomixis Related Gene-SERK1 in Malus 1285
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 1烟草培养基配方
Table 1 Culture medium formula for tobacco culture
烟草
Tobacco
培养基配方
Medium components
MS+2%蔗糖+琼脂 6.5 g/L
MS+2% sucrose+Agar 6.5 g/L
MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L
MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L
MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+
Kan 20 mg/L+Cef 200 mg/L
用途
Use
初代培养
Primary culture
预培养
Pre-incubation
共培养
Co-incubation
选择培养
Selective culture
为父本进行杂交试验中，杂种后代大部分株系为矮
生的皱叶三倍体株系，因此从本研究分析，转入
MhdSERK1的抗性烟草植株也同样具有矮生特性，
说明我们已将无融合生殖的杂种后代 MhdSERK1基
因转入烟草植株中，并在烟草抗性植株中表达。
2讨论
在转基因研究中选择转化受体植物非常重要，
关系着能否成功转化获得转基因植株，并影响在分
子水平上进行基因功能的验证。烟草属于草本植物，
通过组织培养手段容易获得无菌苗，而且使用烟草
叶片进行遗传转化外植体，其转化效率也非常高，因
此被众多育种专家作为重要模式植物来使用(郑军荣
等, 2003;白凌等, 2007)。
关于烟草遗传转化方面的研究已有很多报道，
并已获得转基因烟草。在遗传转化试验中常用的农
杆菌种类很多，不同研究者使用不同；钟丹等(2013)
利用农杆菌介导法将 SsSPY 基因成功地转入了烟
草植株中，转化率达到 84%以上，并探讨了 SPY 基
因在植物花芽分化中的作用机制；Horseh 等(1985)
用烟草组培苗叶片进行遗传转化研究，首次成功地
获得了烟草转基因抗性植株；宋志红等(2004)在烟
草遗传转化实验中使用不同浓度和种类的农杆菌
A4、ATCC15834浸染烟草叶片，获得了转基因烟草植
株，而且其转化效率得到提高。陈观水等(2009)等使用
农杆菌 EHA105浸染烟草叶片并获得了转基因烟
草；王芳等(2011)利用农杆菌通过叶盘法转化烟草植
株，经过 PCR鉴定获得了含有 GhDHAR3转基因烟
草植株。本研究利用农杆菌 EHA105介导的叶盘法
转化本氏烟草，菌液浓度 OD 值为 0.3~0.5 时，通过
选取烟草组培苗幼嫩叶片，浸染 5~8 min经培养后，
获得了烟草转基因抗性植株；通过 PCR检测验证确
定已转化成功。该研究与苏上等(2010)等采用本生烟
草组培苗叶片进行遗传转化研究时的浸染浓度和时
间略有差异。
目前，在转基因研究过程中常见的鉴定转基因植
株的方法有很多，如 PCR法、多重 PCR法、实时荧光
定量 PCR法、Southem杂交法和 GUS基因瞬时检测
等方法(Srivastava and Ow, 2001; Bhat and Srinivasan,
2002; Morisset et al., 2008;王伟伟等, 2011)。最简单
最直接鉴定目的基因片段插入受体植物，获得抗性
植株的方法是 PCR方法，这种方法首先可以观察转
化植株的表型。另外，还可以采用荧光定量 PCR技
术以及 Southem杂交技术对转化株进行鉴定(Deep-
ak et al., 2007; Mafra et al., 2008)，这种鉴定方法可以
在弥补 PCR鉴定方法缺陷的基础上，进一步检测转
化株系，确定转入受体植株的目的基因在不同器官
及组织的表达情况，使鉴定结果更加准确。在本研究
中，对所获得的抗性植株都经过了 PCR鉴定，同时
为避免 PCR鉴定出现假阳性，分别选择目的基因和
抗性基因进行 PCR扩增，同时分别设阴性对照和质
粒阳性对照，最终成功验证了转基因植株。
3材料与方法
3.1试验材料
本研究试验材料选用烟草组培苗、大肠杆菌(E.
coli)，工程菌为已构建好的重组质粒 EHA105菌株，
植物表达载体 pBI121等均由沈阳农业大学园艺学
院张志宏教授惠赠。植物激素为 6-BA、NAA；抗生素：
头孢霉素(Cef 100 mg/mL)、卡那霉素(Kan 50 mg/mL)、
利福平(Rif 100 mg/mL)。
3.2烟草遗传转化培养基配方
烟草遗传转化培养基配方参见表 1。
3.3菌液制备
分别将已活化好的工程菌 EHA105单菌落挑出
置于添加 50 mg/L Kan和 100 mg/L Rif的 YEP液体
培养基上，放于 28℃ 200 r/min恒温培养箱中振荡培
养 16~20 h，然后吸取 1 mL菌液于新的 50 mL YEP
液体培养基中，继续 200 r/min振荡培养 5~7 h，直至
OD600值达到 0.3~0.5，备用。
3.4烟草外植体的选取和侵染
取烟草组培苗幼嫩叶片，将幼嫩叶片剪成 0.5 cm×
0.5 cm 的小块，放入菌液中进行浸染实验，浸染
8~10 min后从菌液中挑出浸染的叶片，置于灭菌的
1286
滤纸上，将多余的菌液吸掉，然后置于共培养基中，
暗培养 2 d后再将外植体用MS重悬液清洗 1~2次，
置于选择培养基中进行暗培养 2周，放于光下培养，
直至长出抗性芽。
3.5抗性芽的筛选
将光照条件下培养的外植体转移至含有相同抗
生素的选择培养基上进行抗性芽筛选，待抗性芽发
育正常后将抗性芽切下，转移至含有相同抗生素浓
度的选择培养基上继续培养，15 d继代 1次，直至长
成再生苗后进行生根培养。
3.6转化苗的移栽
当转化苗根系达到 5条根以上时，在培养室内
炼苗 2~3 d，然后将转化苗放置常温环境中炼苗 2~3 d，
使其逐渐适应外界的环境条件。然后取出转化苗，
用流水冲洗转化苗根基部琼脂，将根系浸泡在
0.2% CaCI2营养液中 10~15 min，然后将转化株栽
植于盛有草炭土+蛭石+土壤的营养钵中，放入温室
进行培养。
3.7转化株的 DNA提取
取抗性植株烟草组培苗叶片，采用常规 CTAB
法提取叶片基因组 DAN。
3.8转化植株 PCR鉴定
为检测目的基因是否导入待检测试材基因组，
利用 pBI121-MhSERK1载体上都带有的 NptII基因
序列，利用 Primer Primer 5.0软件设计转化植株 PCR
鉴定引物(表 2)，引物序列由赛百盛生物公司合成。
PCR反应体积是 25 μL，反应程序为 95℃ 5 min，
94℃ 40 s；55℃ 40 s；72℃ 1 min，35 个循环；72℃
10 min；反应程序结束后，取 10 μL PCR产物进行琼
脂糖凝胶电泳鉴定 PCR结果。
作者贡献
张丽杰是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；郭苏曼参与实
验设计，试验结果分析；董文轩是项目的构思者及负
责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(30971975)资助。
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表 2转化植株 PCR鉴定引物
Table 2 Primers used in PCR detection for transformed plants
引物
Primer
KAN-UP
KAN-DP
序列(5-3)
Sequence (5-3)
GTTCTTTTTGTCAAGACCGACC
CAAGCTCTTCAGCAATATCACG
用途
Use
转基因植株
PCR鉴定
PCR detection
of transformed
plants
转基因植株
PCR鉴定
PCR detection
of transformed
plants
苹果属无融合生殖相关基因 SERK1遗传转化的研究
Study on Genetic Transformation of Apomixis Related Gene-SERK1 in Malus 1287
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