全 文 ：中国农业科学 2007,40(9):1943-1951
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-07-17；接受日期：2007-01-08
基金项目：国家重点基础研究发展计划“973”资助项目（2002CB1114）
作者简介：韩丽娟（1963-），女，陕西宝鸡人，高级农艺师，研究方向为植物病理学。Tel：01064590707；E-mail：Lijuanbj@sina.com


侵染百合的李属坏死环斑病毒病（PNRSV）的研究
韩丽娟 1，刘文洪 2
（1北京出入境检验检疫局，北京 100025；2浙江中医学院，杭州 310053）

摘要：【目的】在分子水平上鉴定百合上发生的李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）
【方法】对待测百合种球随机抽样，在温室内种植并观察，长出叶片后，用 RNA Extraction Kit (Sangon, China)
从幼嫩的叶组织中提取核酸，将反转录出的cDNA用 PNRSV的特异性引物进行PCR扩增，电泳PCR产物得到了450bp
的目的片段。低熔点胶回收并克隆至 pGEM-T-easy 载体测序后进行序列比对分析。【结果】 从百合中所扩增的
450bpcDNA 的核苷酸序列与 27 个早期已报道的 PNRSV 分离物的 CP 基因的同源性为 84.5%～99.1%。【结论】百合
是 PNRSV 的一新寄主。
关键词：百合；李属坏死环斑病毒；RT-PCR；检测

Studies on Prunus Necrotic Ringspot Virus (PNRSV) Occurred on Lily
HAN Li-juan1, LIU Wen-hong2
（1Beijing Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100025; 2Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine ,
Hangzhou 310053）

Abstract: 【Objective】Molecular identification of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) occurred on lily was made.
【Method】Lily corms were randomly selected and grown in greenhouse. Total RNAs were extracted from young leaves with RNA
Extraction Kit (Sangon, China), and partial amplification of CP gene was performed by RT-PCR with primer pairs specific for
PNRSV. An expected cDNA fragment of about 450bp was harvested, cloned into pGEM-T-easy vector, sequenced and compared
with 27 PNRSV isolates reported previously.【Result】The 450 bp cDNAs amplified from lily in this study shared 84.5%-99.1%
homology with the 27 PNRSV isolates reported previously at the nucleotide level.【Conclusion】Lily is a new natural host of PNRSV.
Key words: Lily; Prunus necrotic ringspot virus; RT-PCR; Identification

0 引言
【研究意义】李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic
ringspot virus，PNRSV），是影响核果类生产的最为
严重的一类病毒[1]。该病毒最初的报道是在李子和桃
上[2]，后来发现于甜樱桃和酸樱桃[3,4]，常引起果树的
碎叶病[5]，特别是对甜樱桃和（欧洲）酸樱桃危害尤
为严重[6,7]。国际贸易和交流的日趋扩大使该病在世界
范围内迅速传播和蔓延。目前，该病的发生已遍及欧
洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的 40多个国
家和地区。由于该病在中国仅限于个别发生，属于《中
华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》
中二类危险性有害生物，研究其寄主范围变化，可有
效地降低其传入的风险。【前人研究进展】国外对
PNRSV的研究报道较多，除早期的发生与诊断外，采
用分子生物学技术检测李属坏死环斑病毒并对病毒基
因组序列进行测定也已成形，RT-PCR 和 IC-RT-PCR
已应用于 PNRSV的检测[8~11]。中国学者近年来也开展
了对李属坏死环斑病毒的研究。周媛月等在对陕西西
安地区甜樱桃园的调查中，首次报道了李属坏死环斑
病毒在中国境内的发生情况[12]；山东、辽宁两省也相
继检测发现了 PNRSV[13]；李青[14]等利用 ELISA方法
对北京地区的桃和樱桃上携带 PNRSV 的情况进行了
检测；阮小风等[15]对陕西省甜樱桃、桃上的病毒病的
1944 中 国 农 业 科 学 40卷
发生情况进行了 ELISA检测，发现 PNRSV单独感染
和与其它病毒混合感染的总感染率为 45.5%；侯义龙
等[16]利用逆转录-聚合酶链式反应检测果树 RNA 病
毒；代艳红等[17]通过实验证实利用试管苗微茎尖培养
技术并不能有效脱除 PNRSV；李明福等[18]对北京怀
柔地区部分核果类果园进行疫情调查时，发现有李属
坏死环斑病毒感染的情况[18]，通过对病毒分离物外壳
蛋白基因片段的克窿和序列分析[19]，确定该分离物
属于 Hammond 所划分的引起温和症状的 groupⅡ
组[20]。【本研究切入点】李属坏死环斑病毒（PNRSV）
的主要寄主是欧洲大樱桃、酸樱桃（P. cerasus）、桃
（P. Persia）、苹果（Malus sylvestris）、杏（P.
Armeniaca）、和洋梨（P. Domistica）等李属和蔷薇
属[21]，此外还侵染烟草（Nicotianu tabacum）、西瓜
（Citrullus vulgaris）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、
豌豆（Pisum sativum）、草木樨（Meliotus suweolwna）、
莴苣（Lactuca sativa）、向日葵（Helianthus annus）
等草本寄主，也曾有悬钩子属植物（Rubus ellipticus）[22]
和秋海棠[23,24]上报道，但尚未有侵染百合的研究报道。
【拟解决的关键问题】本文通过采用 PNRSV 特异引
物从百合种球中扩增到 PNRSV 目的片段，首次在分
子水平上证实了 PNRSV 可通过百合种球带毒，并在
此基础上对来自荷兰的进口百合样品和来自中国的田
间百合样品进行了 RNA 点杂交检测，初步阐明了
PNRSV在百合上的发生和在中国的分布情况。本研究
结果为 PNRSV的进出口检疫、防止 PNRSV在国内扩
散提供了新的依据。
1 材料与方法
1.1 病毒材料的采集与保存
携带 PNRSV病毒的百合球茎 P-299和 P-503来自
北京 2002年 4月至 8月间从荷兰进口的百合，隔离保
存于温室。检测样品为北京 2002年 4月至 8月间从荷
兰进口的不同批次的百合球茎和 2002年 4月至 12月
间从浙江省丽水田间采集的百合样品，并在温室种植
保存。
1.2 方法
1.2.1 百合叶片总RNA的提取 采用RNA Extraction
Kit（Sangon，China）试剂盒并按其说明书操作。
1.2.2 引物的设计与合成 根据已报道的PNRSV的
CP 基因的核苷酸序列设计了引物 1（5′-AGGCGC
AAAAGTGTCGAAATCTAAA-3′）和引物 2（5′-TGGT
CCCACTCAGGGCTCAACAAAG- 3′）。引物由上海
生物工程公司合成。
1.2.3 RT-PCR（ reverse transcriptase–polymerase
chain reaction）扩增体系的建立 以百合总 RNA为模
板（约 100 ng），Buffer（1 x），引物 1（5′-AGGCGCAAA
AGTGTCGAAATCTAAA-3′）（1 µmol·L-1），M-MLV
逆转录酶（40 U），dNTP（0.25 mmol），RNasin（40
U）和MgCl2（1.5 mmol）组成 50 µl的 RT反应体系。
RT反应程序为 42℃ 1 h，95℃ 5 min 灭活逆转录酶，
4℃保存。PCR反应在 BIO-RAD icycler 热循环仪上进
行，反应体积为 20 µl，包括 RT产物 2 µl，引物 1和
引物 2（5′-TGGTCCCACTCAGGGCTCAACAAAG-3′）
各 1 µmol·L-1，dNTP（0.25 mmol），Ampli-Taq 2 U。
PCR循环程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 45 s，
72℃ 60 s共 35个循环；72℃ 7 min。PCR产物在 1.5%
琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含溴乙锭（0.5 µg·ml-1）。
1.2.4 RT-PCR产物克隆、鉴定和测序分析 将以上
RT-PCR产物经低融点胶回收纯化后，与购自 Promega
公司的 pGEM T-easy Vector 连接后化学转化自制的
E.coli TG1 感受态细胞，经质粒抽提和酶切鉴定，获
得重组阳性克隆并进行测序（上海生物工程公司）。
用DNAStar序列分析软件进行进化树和序列同源性分
析。
1.2.5 RNA斑点杂交 2002年 4～12月采自浙江省
田间的百合样品和从北京进口的荷兰百合球茎于温室
种植至 2003年 4月，分别提取各样品球茎的总 RNA，
取 3 µl抽提产物以 1﹕3（v/v）比例加入到点样液中，
68 ℃变性 5 min，冰浴 5 min，每处理点样约 6 µl变性
样品，65 ℃烘箱烘干，80 ℃焙烤 2 h。采用尼龙膜作
为点样载体，5′-α-32P标记 dCTP（放射性浓度 3.7×1011
Bq·L-1）购自北京亚辉医学生物工程公司。用插入了
PNRSV 分离物 P-299 部份 CP 基因互补序列的质粒
P-299B 作模板进行 PCR，回收 PCR 产物，制备 32P
标记探针，随机引物试剂盒购自 TaKaRa（大连）生
物有限公司。进行 RNA 斑点杂交检测，42℃预杂交
过夜，将 32P标记 DNA探针 10 µl加入预杂交液中，
42℃杂交 24 h，洗膜后，暗盒曝光 4 h，激光荧屏读取
图象。
2 结果与分析
2.1 PNRSV CP 基因的扩增
在样品 P-299和 P-503的中均出现了大小与预期
目的片段的大小相符的 450 bp左右特异扩增片段（图
1）。
9期 朝丽娟等：侵染百合的李属坏死环斑病毒病(PNRSV)的研究 1945


A：P-299球茎；B：P-503球茎；M：DNA marker
A: The corm from P-299; B: The corm from P-503; M: DNA marker

图 1 PNRSV 的部分 CP 基因的 RT-PCR 扩增
Fig. 1 Partial amplificationof PNRSV CP gene by RT-PCR
2.2 PNRSV 的 CP 基因的 cDNA 克隆的筛选
将以上 RT-PCR 产物克隆 pGEM T-easy Vector
后，通过蓝白反应 ，随机选取转化子的白色菌落，提
取质粒电泳后对候选的重组质粒进行酶切鉴定（图 2，
图 3）。
2.3 PNRSV CP 基因的核苷酸序列的同源性
含 P-299和 P-503的 CP基因的 cDNA测序后，
与 27个已报道 PNRSV 分离物（表 1）的 CP 基因序
列进行同源性比较。结果表明，P-299与 P-503 CP基
因序列同源性为 99.8%。P-299和 P-503 CP基因序列
与 27 个已报道的分离物 CP 基因序列的同源性为
84.5%～99.1%。据此可知扩增片段为 PNRSV，在分

表 1 29 个参与序列同源性分析的 PNRSV 分离物
Table 1 Twenty-nine PNRSV isolates used in homology analysis
编号
Number
分离物
Isolate
国家或地区
Country or region
作物
Crop
GenBank登录号
GenBank accession No.
登录作者
Author
1 P-299 中国 China 百合 Lily DQ992416 Han LJ
2 P-503 中国 China 百合 Lily DQ992417 Han LJ
3 1844 法国 France 樱桃 Prune AF465227 Candresse
4 6-CAV 意大利 Italy 桃树 Peach AF465214 Cardoni..
5 AlCha 以色列 Israel 杏树 Almond AF465219 Spiegel
6 Apr26 意大利 Italy 杏树 Apricot AF465217 Boscia
7 Apricot 未知 Unknown 杏树 Almond AF465231 Hammond
8 B24 法国 France 玫瑰 Rose AF465229 Candresse
9 B42 法国 France 玫瑰 Rose AF465230 Candresse
10 CH19 美国 USA 酸樱桃 Sour cherry AF465236 Crosslin
11 CH3 美国 USA 甜樱桃 Sweet cherry AF465235 Crosslin
12 CH89 意大利 Italy 甜樱桃 Sweet cherry AF465218 Boscia
13 Fh 德国 Germany 甜樱桃 Sweet cherry AF465224 Jelkmann
14 Hs 德国 Germany 酸樱桃 Sour cherry AF465223 Jelkmann
15 Ispave2 意大利 Italy 杏树 Apricot AF465225 Barba
16 Ispave3 意大利 Italy 杏树 Apricot AF465226 Barba
17 NH 美国 USA 蛇麻草 Hop AF465234 Crosslin
18 OM4 法国 France 玫瑰 Rose AF465220 Moury
19 P1257 法国 France 樱桃 Prune AF465228 Candresse
20 Pb 未知 Unknown Batsch NC_004364 Scott
21 Pa 阿根廷 Argentina 桃树 Peach AY007217 Helguera
22 PL11 意大利 Italy 樱桃 Prune AF465216 Boscia
23 PL41 意大利 Italy 樱桃 Prune AF465215 Boscia
24 Ps1 斯洛伐克 Slovakia 李子 Plum AY037788 Glasa
25 Ps2 斯洛伐克 Slovakia 李子 Plum AY037789 Glasa
26 PV-0499 德国 Germany 酸樱桃 Sour cherry AF465221 Winter
27 Rein 德国 Germany 酸樱桃 Sour cherry AF465222 Jelkmann
28 Pps1 荷兰 Holand 酸樱桃 Sour cherry AF465232 Malinowski
29 Pps2 荷兰 Holand 酸樱桃 Sour cherry AF465233 Malinowski
1946 中 国 农 业 科 学 40卷
A B C D E F G


A、C、E：质粒阴性对照；B、D：含有 P-299的 cDNA重组质粒； F、
G：含有 P-503的 cDNA重组质粒
A, C, E: Negative control (plasmid without cDNA inserts); B, D: Recombinant
plasmids containing a cDNA insert from P-299 CP gene; F, G: Recombinant
plasmids containing a cDNA insert from P-503 CP gene

图 2 重组质粒的 PCR 扩增
Fig. 2 Screnning of recombinant plasmids containing cDNA
inersts from CP gene

子水平上说明百合是 PNRSV的寄主之一。
对本研究分离的上述 2个 CP基因和 27个分离物
CP基因的核苷酸序列进行遗传进化分析（图 4），结
果表明，29个分离物在进化上可分为 4个类型。来自
百合 P-299和 P-503的 2个分离物与来自法国玫瑰上
的分离物 B24、B42和OM4亲缘关系较近，同属Ⅲ类型。

A：含有 P-299的 cDNA重组质粒；B：含有 P-503的 cDNA重组质粒；
M：DNA marker
A: Recombinant plasmids containing a cDNA insert from P-299 CP gene; B:
Recombinant plasmids containing a cDNA insert from P-503 CP gene; M:
DNA marker

图 3 重组质粒限制性酶切片段分析
Fig.3 Recombinant plasmid restriction enzyme analysis

2.4 PNRSV CP 基因氨基酸序列分析
氨基酸水平上的同源性分析结果表明（图 5），
P-299 的 CP基因与 27个分离物的 CP基因的同源性
相对较低，为 76%～87.3%；P-503 的 CP基因与 27个



图 4 核苷酸水平上的 29 个 PNRSV 分离物 CP 基因的遗传系统进化树状图
Fig. 4 Phylogenetic tree of CP genes of 29 PNRSV isolates at the nucleotide level
9期 朝丽娟等：侵染百合的李属坏死环斑病毒病(PNRSV)的研究 1947


图 5 29 个 PNRSV 分离物 CP 氨基酸序列遗传进化树状图
Fig .5 Phylogenetic tree of CP genes of 29 PNRSV isolates at the amino acid level

分离物的 CP 基因氨基酸序列有较高的同源性，为
87.3%～98%（表 2）。与核苷酸序列同源性结果相似，
29个PNRSV分离物也可分为4个类型。P-299和P-503
与其它的 27 个分离物的进化关系相对较远 归为Ⅳ
类，但是与来Ⅲ类中的法国玫瑰上的分离物 B24、B42
和 OM4 有较近的进化关系，结合核苷酸序列同源性
分析，PNRSV在进化中表现出一定的地域相关性与寄
主相关性。将上述两个分离物的 CP 基因序列登陆
GenBank，获得了登陆号。 P-299 的登陆号为
DQ992416；P-503的登陆号为 DQ992417。
2.5 PNRSV 杂交检测结果
RNA 斑点杂交结果如图 6 所示。28 个样品中，
有 8个样品检测到 PNRSV的侵染，侵染率达 28.6%。
其中浙江省的样品 24个，其中 5个杂交结果为阳性，
PNRSV侵染率为 20.8%；北京进口的样品 4个，其中
3个样品杂交结果为阳性，PNRSV侵染率为75.0%（表3）。



1～7，9～15，16～22，24～30：百合样品；8：阳性对照（PNRSV侵染的百合）；23：阴性对照（健康心叶烟）；Ⅰ，Ⅱ是两个重复
1-7, 9-15, 16-22, 24-30: Samples of lily; 8: Positive controls (lily infected with PNRSV); 23: Negative controls (N. glutinosa without viruses); Ⅰand Ⅱ show
repeats

图 6 百合样品 RNA 膜杂交示例
Fig. 6 Example of RNA dot hybridization from field lily plants
1948 中 国 农 业 科 学 40卷
9期 朝丽娟等：侵染百合的李属坏死环斑病毒病(PNRSV)的研究 1949
表 3 百合 RNA 斑点杂交检测结果
Table 3 Results of RNA dot hybridization from field lily plants
样品编号
Number
样品
Sample
样品来源
Source
杂交结果
Result
样品编号
Number
样品
Sample
样品来源
Source
杂交结果
Result
1

新中心 1
New center 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

16

莎林娜 1
Selina 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

2

新中心 2
New center 2
浙江丽水
Zejiang lishui
+

17

莎林娜 2
Selina 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

3

新中心 3
New center 3
浙江丽水
Zejiang lishui
-

18

莎林娜 3
Selina 3
浙江丽水
Zejiang lishui
+

4

菊黄色 1
Yellow 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

19

莎林娜 4
Selina 4
浙江丽水
Zejiang lishui
-

5

菊黄色 2
Yellow 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

20

莎林娜 5
Selina 5
浙江丽水
Zejiang lishui
-

6

北京 1
Beijing 1
荷兰进口
From Holland
-

21

299-2

荷兰进口
From Holland
+

7

北京 2
Beijing 2
荷兰进口
From Holland
+

22

503-2

荷兰进口
From Holland
+

8

阳性对照（PNRSV）
PNRVS positive
实验室保存毒原
Lab resverved
+

23

阴性对照（健康心叶烟）
Negative control healthy tobacco
实验室保存
Lab reserved
-

9

荷兰 1
Holand 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

24

日本-1
Japan 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

10

荷兰 2
Holand 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

25

日本-2
Japan 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

11

哥伦比亚 1
Colombia 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

26

日本-3
Japan 3
浙江丽水
Zejiang lishui
+

12

哥伦比亚 2
Colombia 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

27

日本-5
Japan 5
浙江丽水
Zejiang lishui
-

13

西伯利亚 1
Siberia 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

28

铁亚杂交
Tieya hybridized
浙江丽水
Zejiang lishui
+

14

西伯利亚 2
Siberia 2
浙江丽水
Zejiang lishui
-

29

铁炮杂交
Tiebao hybridized
浙江丽水
Zejiang lishui
-

15

样品 1
Sample 1
浙江丽水
Zejiang lishui
-

30

甜密
Sweet
浙江丽水
Zejiang lishui
+


3 讨论
本研究通过分子鉴定从国外进口的百合中首次发
现了 PNRSV。无论在核苷酸还是氨基酸水平上，29
个 PNRSV 分离物在进化上可分为 4 个类型。来自本
研究的百合的 2个分离物 P-299、P-503与来自法国玫
瑰上的分离物 B24、B42、OM4有较近的进化关系，
同属第Ⅲ类型。在第Ⅲ类型中，各分离物表现出一定
的地域与寄主相关性。这可能是 PNRSV 长期在长期
进化中对地域与寄主适应性变异的结果。核苷酸水平
和氨基酸水平的分析结果也表明来自百合上的
PNRSV 有较近进化关系。这可能是侵染百合的
PNRSV来源于同一祖先。北京进口样品中 PNRSV检
出率达 75.0%；在中国浙江丽水栽培的品中 PNRSV
检出率 20.8%，说明在该地区部分百合品种已成为
PNRSV的携带者。检出率的极大差异至少说明不同百
合品种间可能对 PNRSV 有着明显的抗性差异。由此
也可以推测，如不采取有效的检疫和防范措施，随着
1950 中 国 农 业 科 学 40卷
百合新品种的不断引进以及国内百合栽培面积的持续
扩大，PNRSV在中国的百合中分传播及大面积发生的
机率将会越来越大；特别值得注意的是，如果中国百
合上的 PNRSV 得不到及时和有效的控制，该病极有
可能进一步转主扩散到李属等其它经济作物上。
4 结论
本研究用分子生物学的方法首次鉴定了 PNRSV
对百合的侵染，证明了百合是 PNRSV的一个新寄主，
同时，也可能是普遍发生的自然寄主。有关 PNRSV
对百合的自然侵染情况一直未见报道，究其原因可能
是 PNRSV 在感病组织中的病毒含量低且不稳定，侵
染百合时未能引起细胞的明显变化，在细胞内不形成
特殊的内含体，难以用寄主反应、ELISA和电镜技术
等传统的方法进行检测；同时，PNRSV侵染百合常表
现为隐症，也可能是长期以来人们忽视了它在百合上
存在、发生和危害的原因之一。
需要指出的是，对于侵染百合的 PNRSV 株系与
侵染李属和蔷薇属的 PNRSV 株系间的关系，尚需进
一步的深入研究，如全基因组测序分析、寄主接种试
验、浸染循环和流行规律等。

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（责任编辑 王红艳）