全 文 ：第34卷 第2期
2016年2月
河 南 科 学
HENAN SCIENCE
Vol.34 No.2
Feb. 2016
收稿日期：2015-11-20
基金项目：国家科技支撑计划专题（2013BAD01B06）；郑州市科技领军人才计划（10LRC177）
作者简介：侯 婷（1990-），女，硕士研究生，研究方向为林木遗传育种
通信作者：茹广欣（1963-），男，教授，博士，从事林木遗传育种研究 .
文章编号：1004-3918（2016）02-0208-06
泡桐属植物cpDNA分子发育PCR反应体系
快速建立及优化
侯 婷 1， 茹广欣 1， 李海英 1，2， 周霜晴 1， 刘小囡 1
（1.河南农业大学林学院，郑州 450002； 2.华北水利水电学院，郑州 450002）
摘 要：为了快速有效地确定泡桐属植物分子发育系统PCR反应体系，将影响PCR扩增体系的主要单因素因子
Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs替换成Taq PCR Master Mix；通过模板DNA，引物浓度和退火温度对体系进行优化，建
立最适合泡桐属植物叶绿体DNA的 PCR最适反应体系（25 μL）：5 μL模板DNA，1.0 μL引物，12.5 μL Taq PCR
Master Mix，5.5 μL ddH2O，反应体系具有较高的稳定性和重复性；筛选出了适合泡桐属植物分子系统发育学研究的
引物：trbV-ndhC，Agt1F-Agt1R，ITS4-ITS5 .
关键词：泡桐属植物；叶绿体DNA；Taq PCR Master Mix；体系优化；引物筛选
中图分类号：Q 943.2 文献标识码：A
Establishing and Optimization of Molecular Developing Biology PCR
Reaction System of the Genus Paulownia Plants
Hou Ting1， Ru Guangxin1， Li Haiying1，2， Zhou Shuangqing1， Liu Xiaonan1
（1. Forestry College of Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；
2. North China Institute of Water Conservancy，Zhengzhou 450002，China）
Abstract：In order to quickly and effectively identify the species of the genus paulownia molecular PCR reaction
system，Taq PCR Master Mix replaces Taq DNA polymerase，dNTPs and Mg2+ which effect the system of PCR
amplification to establish and optimization of the system through template DNA，primer concentrations and annealing
temperature to bulid the most suitable plants of the genus paulownia chloroplast DNA PCR optimal reaction system
of 25 μL，as follows：5 μL template DNA，1.0 μL primers，12.5 μL Taq PCR Master Mix，5.5 μL ddH2O，the reaction
system has high stability and repeatability，to select the primers which suitable the plants of the genus paulownia
molecular phylogenetic studies：trbV-ndhC，Agt1F-Agt1R，ITS4-ITS5.
Key words：Paulownia；cpDNA；Taq PCR Master Mix；system optimization；primers screening
泡桐是中国的特产树种，具有很强的速生性，是平原绿化、营建农田防护林、四旁植树和林粮间作的重
要树种 . 泡桐木材纹理通直、材质轻软、密度低、尺寸稳定、不翘不裂，是生产单板材如胶合板、拼板、集成材
等最优良的材料 . 泡桐材的木纤维含量高达50%以上，也是生产刨花板、纤维板和造纸的优良原料 .
泡桐属（拉丁文：Paulownia Sieb. et Zucc.）是双子叶植物纲菊亚纲唇形目泡桐科下的一个属 . 该属多为
落叶乔木，但在热带为常绿，主要用其木材 . 常见的有白花泡桐［P. fortunei（Seem.）Hemsl.］，毛泡桐［P.
Tomentosa（Thunb.）Steud.］，兰考泡桐（P. elongata S.Y.Hu），楸叶泡桐（P. catalpifolia Gong Tong），台湾泡桐（P.
kawakamii Ito），川泡桐（P. fargesii Franch.）和南方泡桐（P. australis Gong Tong），光泡桐［P. tomentosa var.
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tsinlingensis（Pai）Gong Tong］是毛泡桐的变种，均产中国，除东北北部、内蒙古、新疆北部、西藏等地区外全国
均有分布，栽培或野生，有些地区正在引种 .
泡桐属植物［1-5］的研究主要集中在生物学特性、生态学特性、化学成分、引种繁殖和遗传多样性等方面［1，6-11］.
莫文娟等［12］通过对泡桐属植物的 ISSR分析，通过聚类对泡桐属植物的亲缘关系进行鉴定 . 卢龙斗等［13］在
RAPD分析中对泡桐属的七种植物扩增的谱带对比，在系统演化上进行归纳 . 陈志远等［14］研究泡桐属植
物的起源、演化和地理分布对泡桐各种之间的关系从生态层面上进行分类 . 分子发育系统学是指通过对
生物大分子如蛋白质、核酸等物质的结构、功能等的进化进行研究，来阐明生物各类群间的生物类群的谱
系发生关系［15］. 由于生物大分子其本身就是遗传信息的载体，且其中含有庞大的信息量，趋同效应很弱，
因此相对于经典的形态系统分类研究，其结论更具有可比性和客观性 . 更为重要的是，在微生物和某些低
等动、植物中，这些缺乏形态性状的生物类群，它几乎成为探讨其系统演化关系的唯一手段，已引起国内外
学者的广泛重视［16］.
叶绿体DNA（Chrloroplast DNA，cpDNA）于20世纪60年代初期至70年代中期其遗传系统及其非孟德尔
遗传规律已被揭示［17］. 其序列中具有较高的核苷酸置换率，可以揭示种间和种内的遗传变异，能提供对系统
发育研究的信息位点［18］.
通常做PCR试验需要进行 4因素 4水平正交试验，对单因素中引物，Mg2+浓度，dNTPs浓度，Taq DNA聚
合酶浓度进行测试，如今本实验采用上海生工生物公司的Taq PCR Master Mix（2×，red dye），本试剂盒中的
2×PCR Master Mix中包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂和一种红色示踪
染料 . PCR反应混合物的配制可在几分钟之内完成，只需加引物、模板DNA和适量的去离子水 . 通过混合
酶简化实验，节省工作量 . 本研究通过对影响泡桐属植物叶绿体DNA标记PCR反应体系中模板DNA和引
物进行优化，筛选出适宜的序列引物，为进一步开展泡桐属植物的分子系统学研究奠定基础 .
1 材料与方法
1.1 材料
白花泡桐、毛泡桐、川泡桐、台湾泡桐、南方泡桐、楸叶泡桐、鄂川泡桐、成都泡桐、兰考泡桐、山明泡桐、
宜昌泡桐、建始泡桐、白花兰考泡桐共13种供试材料，均采集于江西省共青城泡桐实验基地 . 采未发芽的长
势良好的枝条做好标记后带入实验室进行水培 .
1.2 主要试剂及仪器
用于 PCR反应的 Taq PCR Master Mix（2×，red dye），以及用于凝胶电泳染色的 6×Glycerol Gel Loading
Dye Ⅱ和DNA标记的DNA Marker D购自上海生工公司 . 叶绿体DNA序列标记通用引物序列［19-22］，由上海
生工生物工程股份有限公司合成 . 实验中所需要的仪器有Hema9600基因扩增仪，DYY-6C型电泳仪，
C71-JY04S-3C凝胶成像分析系统C71-JY04S-3C凝胶成像分析系统 . 本实验于河南农业大学林木遗传育
种实验室内完成 .
1.3 基因组DNA提取与检测
采取改良的CTAB法提取泡桐属植物的叶绿体DNA，采用1.3%的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，-20 ℃
保存提取的DNA样品 .
1.4 PCR扩增产物检测
泡桐属植物 cpDNA PCR扩增初始反应体系（25 μL）为：5 μL模板DNA，12.5 μL Tap PCR Master Mix，
1 μmol/L正反引物，5.5 μL ddH2O . PCR反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，62 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸，共38个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存［23-25］.
PCR扩增产物采用1.3%琼脂糖凝胶电泳检测 . 电泳缓冲液为1×TAE，电压70 V . 在君意电泳 JY04S-3C
型凝胶成像分析系统拍照记录 .
1.5 PCR反应体系优化与引物筛选
以Agt1正反为引物，以提取的台湾泡桐为模板DNA，进行6个浓度水平DNA模板用量实验，以确定最适
的DNA模板用量 . 对影响PCR反应扩增产物的特异性和产量的引物、退火温度进行梯度试验（表1）.
侯 婷，等：泡桐属植物cpDNA分子发育PCR反应体系快速建立及优化 -- 209
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表1 PCR反应体系优化的因素和水平
Tab.1 Factors and levers of PCR reaction system
序号
1
2
3
模板用量/μL
1
2
3
引物浓度/（μmol·L-1）
0.2
0.4
0.6
序号
4
5
6
模板用量/μL
4
5
6
引物浓度/（μmol·L-1）
0.8
1.0
1.2
利用优化的PCR反应体系对叶绿体DNA序列通过引物进行筛选 . 对筛选出的最适引物，以Tm值计算
理论退火温度，以理论值为中心，设置温度梯度为1 ℃的6个退火温度，最终确定最佳的引物退火温度 .
1.6 优化的反应体系及扩增程序的验证
通过体系优化选择最佳引物对泡桐属13种植物进行PCR扩增，对优化的PCR反应体系及反应参数的稳
定性进行测试 .
2 结果与分析
2.1 泡桐属植物叶片DNA的检测
泡桐属植物提取的基因组DNA，经过核酸蛋白质分析仪检测DNA的浓度与纯度，结果显示，提起的
DNA的OD260nm /OD280nm值在1.7~2.1之间，符合PCR扩增的要求 .
提取的DNA经质量分数为1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示 . 所提取的DNA有较清晰完整
的电泳条带，可用于PCR扩增 .
图1 DNA的质量检测
Fig.1 The quality text of DNA
2.2 PCR反应体系单因子实验
6个水平浓度的模板DNA扩增结果如图2所示 . 其中第3、4泳道最暗，其余泳道条带虽亮但可明显看出
1，2，6泳道的拖尾显现比第5泳道严重，可见其含有的杂质较多，质量不如第5泳道的质量好 . 由此表明，不
同浓度的DNA模板用量都可以扩增出产物，但随着DNA模板用量的增加，条带愈加明亮，当DNA模板用量
为5 μL时条带最亮，反而当模板用量大于5 μL时条带反而变暗 . 综上所述，泡桐属植物基因组DNA PCR扩
增体系的模板最适用量为5 μL .
图2 不同模板DNA用量的PCR电泳
Fig.2 Effects of different template DNA concentrations on PCR
-- 210
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引物浓度对 PCR扩增的影响如图 3所示 .
由图 3得到，不同的引物浓度对基因片段的扩
增具有选择性 . 当引物浓度大于或者小于1 μL
时，所表现出的PCR扩增的条带均较模糊，而当
且仅当引物浓度等于1 μL时，扩增出的PCR条
带则最清晰 .
以上海生工生物公司合成引物提供的理论
退火温度为中心值，设定合适的退火温度梯度
如表2所示 . 所得结果如图4所示 .
表2 退火温度梯度设计
Tab.2 The design of annealing temperature gradient
编号
温度/℃
1
47.0
2
48.3
3
49.9
4
51.5
5
53.7
6
55.8
7
57.9
8
60.1
9
62.4
10
64.2
11
66.0
12
67.1
图4 中心温度57 ℃
Fig.4 57 ℃ of the center temperature
从图4可知，在退火温度为57 ℃±10 ℃的范围内，随着温度的升高，条带愈来愈亮，但在到达一定的温度
值时条带消失 . 从第1泳道到第9泳道，均有较亮条带，其中：第2泳道亮度最弱，第1泳道，第3至第8泳道虽
条带较亮但拖尾严重，第10至第12泳道未有条带 . 从图中比较而言，第9泳道效果最好，条带最亮最清晰，
即退火温度为62 ℃左右 .
2.3 泡桐属植物叶绿体DNA的引物筛选
根据以上反应体系优化的试验结果，对文献中［26-28］的 rbcL-atpB，petL-psbE，trbV-ndhC，psbD-trnT，trnD-T
正反，Agt1F-Agt1R，G3PDHf-G3PDHr，ITS4-ITS5这8对引物进行筛选 . 最终筛选出3对引物单一、明亮、清
晰的PCR扩增产物（见表3）.
表3 筛选出的3对引物
Tab.3 Selected thress pairs of primers
引物
trbV-ndhC
Agt1F-Agt1R
ITS4-ITS5
序列（5′-3′）
trbV:GTCTACGGTTCGARTCCGTA
ndhC:TATTATTAGAAATGYCCARAAAATATCATATTC
Agt1F:GATTTCCGHATGGATGANTGGGG
Agt1R:CCAYTCCTCCTTCTGHGTGCAGTT
ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
退火温度/℃
58
62
56
目的片段长度范围/bp
1000~2000
750~1000
750~1000
图3 不同引物浓度的PCR电泳
Fig.3 The differnet concentrations of PCR primers electrophoresis
侯 婷，等：泡桐属植物cpDNA分子发育PCR反应体系快速建立及优化 -- 211
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从以上筛选出的3对引物，对泡桐属植物的13株个体进行PCR扩增，其凝胶电泳结果如图5所示 . 从图5
中可知，3对叶绿体DNA的引物序列均能扩增出明亮清晰的目的片段，表明所筛选出的PCR扩增体系能够适
用于泡桐属植物分子系统发育学的研究 .
M：DL2000 DNA MARKER
图5 各引物的PCR扩增产物电泳图
Fig.5 Electrophoretogram of the PCR products of each primer
3 结论
在以往的实验研究中，Taq酶，dNTPs、Mg2+、引物、模板DNA是影响PCR反应体系，确定并优化适合实验
材料的PCR反应体系的主要因素 . 选择5个影响因素，实验处理的数量多，工作量大，程序繁琐，2×Tap PCR
Mix中包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、PCR buffer、PCR反应缓冲液、增强剂和稳定剂等 . 本研究通过将
影响PCR扩增结果的影响因子Tap DNA聚合酶、Mg2+及 dNTPs浓度替换成作为一个整体的Taq PCR Master
Mix，综合评价其对PCR反应的影响，降低了实验难度，节约了试验时间，提高了工作效率，并且缩短了PCR
的操作过程，可以有效防止药品污染、酶活性降低等问题的发生，单从模板DNA，引物及退火温度入手建立
最适泡桐属植物PCR扩增反应体系 .
通过优化的PCR反应体系，筛选出适合泡桐属植物分子系统发育学研究的 trbV-ndhC，Agt1F-Agt1R，
ITS4-ITS5的3对引物 . 其中引物 trbV-ndhC扩增的目的片段长度为1000~2000 bp，Agt1F-Agt1R引物扩增的
目的片段长度为750~1000 bp，ITS4-ITS5引物扩增的目的片段长度为750~1000 bp .
本研究为后续产物的回收，测序及进一步开展泡桐属植物分子系统发育学研究构建发育树奠定了
基础 .
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（编辑 郑壮丽）
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