全 文 ：第 36 卷　第 5 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.5
2008 年 5 月 Journal of No rthwest A&F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) May 2008
气相色谱内标法测定两种黄芪属疯草中苦马豆素含量＊
崔忠华 ,赵兴华 ,李勤凡 ,王建华 ,耿果霞
(西北农林科技大学动物医学院 ,陕西 杨凌 712100)
[ 摘　要] 　【目的】建立一种苦马豆素(Sw ainsonine , SW)的微量定量检测方法。【方法】以甲基-α-D-吡喃甘露糖
苷(me-Gal ,纯度 99%)为内标 ,在柱温 200 ℃、进样口温度 300 ℃、氢火焰离子化检测器(F ID)温度 280 ℃、高纯氮气
载气压力 200 kPa 条件下 ,对苦马豆素进行气相色谱分析 ,以 SW进样质量浓度对 SW 和 me-Ga l峰面积的比值进行
回归分析 ,得回归方程 , 并进行单点校正因子测定和加样回收试验。【结果】单点校正因子为 1.067 8 , 在 0.047 ～ 6
mg/ mL SW 进样质量浓度对 SW 和 me-Gal峰面积比值的线性关系良好。加样平均回收率为 107.33%,变异黄芪地
上部分 SW含量为(39.2±0.16)mg/ kg , 茎直黄芪地上部分 SW 含量为(43.6±0.13)mg/ kg 。【结论】气相色谱内标
法准确 、重现性好 , 可作为苦马豆素的微量定量检测方法。
[ 关键词] 　黄芪属;疯草;苦马豆素;气相色谱;内标法
[ 中图分类号] 　O657.7+1 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2008)05-0017-05
Determination of Swainsonine in Astragalus locoweed by
internal standard gas chromatography
CUI Zhong-hua ,ZHAO Xing-hua , LI Qin-fan ,WANG Jian-hua ,GENG Guo-xia
(Col leg e o f An imal Veterinary Medicine , Northwest A &F Universi ty ,Y ang ling , Shaan xi 712100, China)
Abstract:【Objective】The study established a method fo r determination o f Sw ainsonine.【Method】
Sw ainsonine in Astragalus locoweed w as determinated by mainte rnal standa rd gas chromatog raphy w i th
me-Gal as internal standard under the oven temperature 200 ℃, injection tempe ra ture 300 ℃, detecto r
(FID)temperature 280 ℃and f low rate o f carrie r g as 200 kPa.【Resul t】The analy sis results of single-cali-
bration-ratio w as 1.067 8 and good linear relationship w as obtained in the range of 0.047 to 6 mg/mL.The
recovery pe rcentage w as 107.33%.The SW contents of A.variabi lis and A.strictus were (39.2±0.16)
mg/kg and(43.6±0.13)mg/kg respectively .【Conclusion】The internal standard method had high accura-
cy and good repertability and could be a de termination method of Sw ainsinine.
Key words:Astragalus;lo cow eed;Sw ainsonine;gas chromato graphy;internal standard method
　　疯草(Locoweed)是棘豆属(Qxy tropis.)和黄
芪属(Astragalus)有毒植物的总称。1979 年 , Co-
leg ate等[ 1] 首次从灰苦马豆中分离出吲哚兹定生物
碱———苦马豆素(Sw ainsonine , SW)。近年来国内
外研究发现 ,SW 除有毒性外 ,还具有很强的抗癌活
性[ 2-3] 和免疫增强功能[ 4-6] 。在苦马豆素(SW)中毒
机理及其应用研究中 ,均要对 SW 进行定量分析 ,因
此建立一种准确 、灵敏的 SW 测定方法具有重要意
义。目前 ,国内采用的 SW 定量分析方法主要有薄
层色谱扫描法[ 7] 、气相色谱法(GC)[ 8-10] 和高效液相
＊[收稿日期] 　2007-05-15
[基金项目] 　国家自然科学基金项目(30571315)
[作者简介] 　崔忠华(1980-),男 ,山西临汾人 ,在读硕士 ,主要从事动物中毒性疾病研究。
[通讯作者] 　李勤凡(1968-),男 ,甘肃张家川人 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要从事家畜中毒性疾病和营养代谢病研究。
E-mail:liqinfan@yah oo.com .cn
色谱法[ 11] 。薄层色谱扫描法检测受自制的硅胶板
厚度 、板面平整度和活化程度等因素的影响 。气相
色谱法和高效液相色谱法虽能进行含量测定 ,但目
前主要采用外标法 ,重现性和精确性都较差 。内标
法是一种间接或相对的校准方法 ,在分析测定样品
中某组分含量时 ,加入一种内标物质以校准和消除因
操作条件波动而对分析结果产生的影响 ,从而提高分
析结果的准确度。本试验以甲基-α-D-吡喃甘露糖苷
(me-Gal)为内标物 ,对 SW 进行气相色谱分析 ,以期
建立一种准确 、灵敏的 SW测定方法 ,为进一步研究
动物疯草中毒和SW的药用价值奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　材料和试剂　苦马豆素标准品(SW ,西北农
林科技大学动物医学院生物毒素与分子毒理实验室
提供);甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(me-Gal ,SIGMA 公
司产品 ,纯度 99%);双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺
(BS TFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(硅烷化试剂 ,
美国 SUPELCO 公司产品);变异黄芪(2006-08采
于内蒙古自治区阿拉善左旗);茎直黄芪(2005-07采
于西藏郊区 ,西北农林科技大学动物医学院生物毒
素与分子毒理实验室赵宝玉副教授惠赠);正丁醇 、
甲醇 、吡啶均为分析纯。
1.1.2　主要仪器 　GC-14C 气相色谱仪(日本岛
津),威玛龙色谱数据工作站 , A T .SE-54 型毛细管
色谱柱(30 m ×0.25 mm)(中国科学院兰州化学物
理研究所色谱技术研究开发中心), 赛多利斯
BP211D型电子天平(德国)。
1.2　方　法
1.2.1　疯草样品的前处理(超声波协助提取法)　
准确称取疯草草粉(变异黄芪和茎直黄芪)各 20 g
于烧瓶中 ,加入 300 mL 蒸馏水 ,在超声清洗器中浸
渍 12 h后 ,用40 kHz超声波于 50 ℃处理1 h ,更换
溶媒并在相同条件下重复 1 次 ,共收集得 550 mL
水提液;然后加热浓缩至 100 mL ,1 500 r/min 离心
10 min ,除去固体杂质 ,加入适量氨水调 pH 至 8 ～
10 ,用 100 mL 正丁醇萃取此浓缩液 ,反复 5 次;接
着用 300 mL 0.2 mo l/L 稀硫酸溶液萃取;将最后酸
水溶液浓缩至 100 mL ,放在水浴锅上 95 ℃继续浓
缩成浸膏 。用 500μL 吡啶溶解并离心备用[ 12] 。
1.2.2　标准品溶液和内标溶液的制备　精密称取
SW标准品 4.8 mg 于 400 μL 吡啶中 ,摇匀 ,作为
SW标准品溶液 A 。精密称取 me-Gal 16 mg 于 8
mL 吡啶中 ,摇匀 ,作为内标溶液 A 。
1.2.3　色谱条件　AT .SE-54型毛细管色谱柱(30
m×0.25 mm),柱温 200 ℃,进样口温度 300 ℃,氢
火焰离子化检测器(FID)温度 280 ℃,分流比为
60∶1 ,载气为高纯氮气 ,载气压力为 200 kPa ,进样
量为 1 μL 。
1.3　内标物的分析
精密吸取 100 μL SW 标准品溶液 A 至 1 mL
离心管 ,加 20μL 内标溶液 A 、40 μL 吡啶和 40 μL
BSTFA+TMCS(99∶1)摇匀 ,静置 3 h 后进行气相
色谱分析。
1.4　SW进样质量浓度对 SW 和 me-Gal峰面积比
值的线性关系
精密吸取 200μL SW 标准品溶液 A至 1 mL离
心管中 ,再取 7支 1 mL 离心管分别加 100 μL 吡啶 ,
按倍比稀释的方法配制成 6 , 3 , 1.5 , 0.75 , 0.375 ,
0.188 ,0.094 ,0.047 mg/mL 8 个质量浓度梯度的溶
液。在每个离心管中加 20 μL 内标溶液 A 、40 μL吡
啶和 40 μL BSTFA+TMCS(99∶1)摇匀 ,静置3 h后
进行气相色谱分析。以 SW 进样质量浓度Y 对 SW
和 me-Gal峰面积比值 X 进行回归分析。
1.5　单点校正因子的测定
精密称取 2 mg me-Gal于 1 mL 吡啶中 ,摇匀 ,
作为内标溶液 B 。精密称取 SW 标准品 1.2 mg 于
200μL 吡啶中 ,摇匀 ,作为 SW标准品溶液 B。精密
量取 25μL SW标准品溶液 B和20 μL 内标溶液 B ,
再加 40μL 吡啶和 40μL BS TFA+TMCS(99∶1),
静置 3 h后进行气相色谱分析 ,取 1 μL 进样 ,连续
进样 6次 ,按 SW和 me-Gal峰面积比值的平均值计
算校正因子 。
1.6　加样回收试验
精密称取 SW 标准品 0.6 mg 至 1 mL 离心管 ,
加30μL SW 标准品溶液 B ,再加 20μL 内标溶液 B
和 40 μL BS TFA+TMCS(99∶1),最后加 910 μL
吡啶 ,摇匀 ,静置 3 h 后进行气相色谱分析 。
1.7　样品的测定
取上述制备的疯草样品溶液 200 μL ,分别加 20
μL 内标溶液 A ,再加 40 μL BS TFA +TMCS(99∶
1),静置 3 h后进行气相色谱分析 ,重复 3 次 ,以回
归方程 、校正因子计算疯草样品中 SW 含量 。
2　结果与分析
2.1　内标物分析结果
在 1.2.3色谱条件下分别进样测定 , me-Gal和
18 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
SW出峰时间相近又能完全分离 , SW 保留时间为
7.93 min ,内标物 me-Gal保留时间为 7.32 min(图 1 ,
图2和图 3),符合内标物的标准 ,满足定量分析要求。
图 1　SW气相色谱图
Fig.1　Determina tion of SW by gas chroma to g rapy
图 2　me-Gal气相色谱图
F ig.2　Determination of me-Gal by gas chromatog rapy
图 3　SW+me-Gal气相色谱图
Fig.3　Determination of SW and me-Gal by gas chromatograpy
2.2　SW进样质量浓度对 SW 和 me-Gal峰面积比
值的线性关系
以 SW进样质量浓度 Y 对 SW 和 me-Gal峰面
积比值(表 1)X 进行回归分析 ,得回归方程:Y =
0.198 3X -0.069 5 , r=0.999 4 ,表明 SW 进样质
量浓度(0.047 ～ 6 mg/mL)对SW 和 me-Gal峰面积
比值线性关系良好 ,结合信噪比 S/N =3这一原则
可以推断 ,该方法的检出限为 0.01 mg/L。
表 1　不同质量浓度 SW 气相色谱分析测定结果
Table 1　Results of standa rd curv e o f SW
SW质量浓度/
(mg·mL -1)
Concen tration of SW
SW 峰面积
Peak area of SW
me-Gal峰面积
Peak area of me-Gal
SW 和 me-Gal峰面积比
Rat io of SW peak area
to me-Gal
SW和 me-Gal平均峰面积比
Ratio of SW average peak
area to me-Gal
6
804 143 26 922 29.869
1 044 247 35 084 29.764
869 003 27 855 31.197
30.277
3
514 320 32 172 15.986
509 189 32 778 15.534
398 446 23 570 16.904
16.142
1.5
288 493 38 996 7.398
211 755 26 614 7.956
280 236 37 478 7.477
7.611
0.75
111 820 24 490 4.565
148 518 34 353 4.323
134 673 29 959 4.495
4.461
0.375
59 820 23 901 2.503
74 209 30 398 2.441
87 859 36 906 2.381
2.442
0.188
40 305 32 307 1.248
41 270 33 959 1.215
38 847 31 801 1.221
1.228
0.094
14 014 23 073 0.607
19 524 31 701 0.616
20 141 32 801 0.614
0.612
0.047
7 498 22 893 0.328
8 568 27 663 0.310
9 702 26 922 0.295
0.311
19第 5 期 崔忠华等:气相色谱内标法测定两种黄芪属疯草中苦马豆素含量
2.3　单点校正因子的测定结果
按 SW进样质量浓度和 me-Gal峰面积比值的
平均值计算校正因子 ,校正因子为 1.067 8 , RSD=
1.26%(n=6)。
2.4　加样回收试验结果
以回归方程 、单点校正因子计算样品中 SW 含
量为 0.837 2 mg ,理论值为 0.78 mg ,平均回收率
为 107.33%,RSD =1.008%(n=5)。
2.5　变异黄芪和茎直黄芪中 SW 含量测定结果
以回归方程 、单点校正因子计算样品中的 SW
含量。色谱图见图 4 、图 5 ,气相色谱测定结果见表
2。变异黄芪(内蒙古阿拉善左旗)地上部分 SW 含
量(39.2±0.16)mg/kg ,茎直黄芪(西藏郊区)地上
部分 SW 含量(43.6±0.13)mg/kg 。
图 4　变异黄芪样品色谱分析结果
Fig.4　Determination of A.variabilis by ga s chromatog rapy
图 5　茎直黄芪样品色谱分析结果
Fig.5　Determina tion of A.strictus by gas chroma to g rapy
表 2　变异黄芪和茎直黄芪中 SW气相色谱分析的测定结果
Table 2　Results of A.variabilis and A.strictus o f SW
样品
S am ple
SW 峰面积
Peak area of SW
me-Gal峰面积
Peak area of me-Gal
SW 和 me-Gal峰面积比
Rat io of SW peak area
to me-Gal
SW和 me-Gal平均峰面积比
Ratio of SW average
peak area to me-Gal
变异黄芪
A.var iabi ll s
201 572 55 027 3.663
189 436 49 876 3.798
201 689 57 704 3.495
3.652
茎直黄芪
A.st rictus
225 418 59 351 3.798
212 523 53 917 3.941
199 767 49 297 4.052
3.930
3　结论与讨论
本试验采用超声波协助提取法处理样品 ,不通
过柱层析 ,简化了操作步骤 ,减少了 SW 在分离提取
过程中的损失。采用气相色谱外标法测定 SW 含
量 ,重现性和精确性都较差。本试验建立的气相色
谱内标法检测 SW 含量 ,可校准和消除进样量不同
引起的误差 ,因为该法是用待测组分 SW 和内标物
me-Gal峰面积的相对值进行计算 ,所以对进样量的
准确性要求较低 。本试验结果表明 ,气相色谱内标
法准确 、重现性好 ,可作为苦马豆素的微量定量检测
方法 。但在 SW 家畜中毒机理和药用价值的研究
中 ,要更进一步降低最低检测限 ,尚需深入研究。
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