全 文 ：蚕　业　科　学　　　CANYE KEXUE 2008;34(2)　
收稿日期:2007-11-08
资助项目:国家科技基础条件平台工作子项目(编号 2005DKA21002-
09),博士后科学基金项目(编号 20060400926, 0602004C)。
作者简介:汪伟(1981-),女 ,山东 ,硕士研究生。
E-mail:weiwang2599@ 126.com
通讯作者:赵卫国 ,博士 ,副研究员 ,硕士生导师。
Tel:0511-85616570, E-mail:wgzsri@126.com
基于 trnL内含子序列的桑属植物分子系统学初探
汪　伟 1, 2　王兴科 1　朱昱苹 3　汪生鹏 1, 2　张　林 1, 2
潘一乐 1, 2　沈兴家 1, 2　杨永华 3　赵卫国 1, 2
(1江苏科技大学生物与环境工程学院 ,江苏镇江　212018;　2中国农业科学院蚕业研究所 ,
农业部家蚕生物技术重点开放实验室 ,江苏镇江　212018;　3南京大学生命科学学院 ,南京　210093)
摘　要　用 PCR产物直接测序法对 12份桑种质 、1份无花果和 1份构树的亮氨酸转运 RNA基因(trnL)内含子序
列进行了测定。 trnL序列长度变异范围为 534 ～ 561 bp, 平均核苷酸组成为 0.391 00(A)、 0.271 14(T)、
0.176 79(C)、0.160 86(G),平均 A+T含量为0.662 14, 说明该序列富含 A/T。利用 PHYLIP软件构建其最大简约
数(maximumlikelihood, DNAML)分子系统发育树 , 聚类结果表明桑属所有材料聚为一类 , 进一步证明桑属为单系 ,
为探明桑属植物的亲缘关系提供了新的分子生物学证据。
关键词　桑属植物;叶绿体 DNA;亮氨酸转运 RNA基因(trnL)内含子;系统学分析
中图分类号　S888.2　　　文献标识码　A　　　文章编号　0257-4799(2008)02-0298-04
PhylogeneticAnalysisofGenusMorus(Urticales:Moraceae)
UsingNucleotideSequencesFromthetrnLIntron
WANGWei1, 2　WANGXing-Ke1　ZHUYu-Ping3　WANGSheng-Peng1, 2　ZHANGLin1, 2
PANYi-Le1, 2　SHENXing-Jia1, 2　YANGYong-Hua3　ZHAOWei-Guo1, 2＊
(1SchoolofBiotechnologyandEnvironmentalEngineering, JiangsuUniversityofScienceandTechnology,
ZhenjiangJiangsu212018, China;2KeyLaboratoryofSilkwormBiotechnology, MinistryofAgriculture,
SericulturalResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, ZhenjiangJiangsu212018, China;
3SchoolofLifeSciences, NanjingUniversity, Nanjing210093, China)
Abstract　ThetrnLintronsequencesof12 genusMorus, 1 Broussonetiapapyriferaand1 Ficuscaricawere
amplifiedbyPCRmethod.Directsequencingresultsshowedthattheirlengthvariedfrom 534to561bp.The
averagenucleotidecompositionwas0.391 00(A), 0.271 14(T), 0.176 79(C), and0.160 86(G), andthe
meanA+Tcontentwas0.662 14, indicatingthatthereqionwascharacterizedasAT-richfragment.Molecular
phylogeneticanalysiswasdonebyMaximumLikelihoodmethodusingPHYLIPsoftware.Clusteringresults
showedthatalstrainsofgenusMorusgroupedtogether, indicatingthatthegenusMoruswasamonophyletic
andphylogeneticrelationshipamonggenusMoruswasfurtherdiscussed.
Keywords　GenusMorus;cpDNA;trnLintron;Phylogeneticanalysis
　　随着分子系统学的发展 , DNA序列分析在生 物的系统发育研究中被广泛应用 ,从 DNA核苷酸
水平研究生物的多样性与生物进化 ,比一些常规
的分类方法更直观 、准确 、可靠 ,因而已被广大分
类学者接受 。目前用于分子系统学研究的主要基
因种类有叶绿体基因组的核酮糖 -1 , 5-二磷酸羧化
酶大亚基 (ribulose-bisphosphatecarboxylaselarge
subunit, rbcL)、tRNA成熟酶编码基因(maturaseK,
　298　
DOI :10.13441/j.cnki.cykx.2008.02.023
matk)、脱氢酶编码基因 (dehydrogenase, ndh)、tR-
NA编码基因间隔区(trn)和核基因组的 18srRNA
以及内转录间隔区 (internaltranscribedspacer,
ITS)等 [ 1] 。赵卫国等 [ 2-4]对桑树 trnL-trnF基因间
隔区序列进行了测定 ,史全良等 [ 5] 、赵卫国等[ 4, 6]
对桑树的 ITS进行了测序 ,并探讨了桑属植物分子
亲缘关系。本研究通过测定桑树亮氨酸转运 RNA
基因(trnL)内含子序列 ,进一步确定了桑属植物的
系统发育及进化关系 ,可为桑树种质资源的保存
和利用提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料及主要试剂
　　供试材料采自中国农业科学院蚕业研究所国家
种质镇江桑树圃 (表 1)。 ExTaqDNA聚合酶为
TaKaRa公司产品 , PCR产物纯化试剂盒为上海赛百
盛基因技术有限公司产品 ,寡核苷酸引物合成 、测序
均委托上海生工生物技术服务有限公司完成 。
表 1　供试材料的来源
Table1　Plantmaterialsusedinthestudy
编号
No.
桑种及外源属名称
Species
品系名称
Strains
来源
Origin
1
广东桑
M.atropurpureaRoxb.
伦教 40号
Lunjiao40
广东省顺德
Shundecity, Guangdongprovince, China
2
华 桑
M.cathayanaHemsl.
保靖 5号
Baojing5
湖南省保靖
Baojingcity, Hunanprovince, China
3
白脉桑
M.albavar.venoseDelile.
纹契桑
Wenqisang
陕西省周至
Zhouzhicity, Shaanxiprovince, China
4
瑞穗桑
M.mizuhoHotta.
火桑
Huosang
浙江省余杭
Yuhangcity, Zhejiangprovince, China
5
白桑
M.albaLinn.
牛耳桑
Niuersang
山西省阳城县
Yangchengcity, Shanxiprovince, China
6
广东桑
M.atropurpureaRoxb.
钦二
Qiner
广东省钦州
Qinzhoucity, Guangdongprovince, China
7
长穗桑
M.witiorumHand-Mazz.
黔鄂桑 1号
QianesangNo.1
贵州省德江
Dejiangcity, Guizhouprovince, China
8
蒙桑
M.mongolicaSchneid.
吉蒙桑
Jimengsang
吉林省
Jilinprovince, China
9
暹逻桑
M.rotundilobaKoidz. T12
泰　国
Thailand
10
鬼　桑
M.mongolicavar.diabolicaKoidz.
有毛岩桑
Youmaoyansang
贵州省
Guizhouprovince, China
11
鸡桑
M.australisPoir.
插桑
Chasang
四川省
Sichuanprovince, China
12
鲁桑
M.multicaulisPerr.
湖桑 32号
Husang32
江苏省无锡
Wuxicity, Jiangsuprovince, China
13
构属
BrousonetiapapyriferaLHér.
构树
Goushu
江苏省镇江
Zhenjiangcity, Jiangsuprovince, China
14
无花果属
FicuscaricaLinn.
无花果
Wuhuaguo
江苏省无锡
Wuxicity, Jiangsuprovince, China
1.2　供试材料基因组 DNA的抽提
　　参照文献 [ 7]的方法提取供试材料的基因
组 DNA。
1.3　PCR引物设计及 trnL序列的扩增
　　参照文献 [ 8]的方法 ,设计 1对 trnL内含子引
物:正向引物为 5′-CGAAATCGGTAGACGCATCG-3′;
反向引物为 5′-GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3′。
　　分别以各供试材料基因组 DNA为模板 ,用上述
引物 、ExTaqDNA聚合酶进行 PCR扩增 ,反应体系
(25 μL):20 ng模板 DNA, 20 ng/μL引物 1.5 μL;
1.5 UTaq聚合酶;10倍反应缓冲液 2.5μL, 200
μmoL/LdNTP0.5 μL,用纯水补充至 25 μL。反应
　299　　第 2期 汪伟等:基于 trnL内含子序列的桑属植物分子系统学初探
程序:94℃预变性 5 min;94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72
℃ 1 min,循环 25次;72 ℃延伸 7min。
1.4　PCR产物的纯化 、测序
　　PCR产物进行凝胶电泳 ,切下目的条带 ,用
PCR产物纯化试剂盒进行回收 。将纯化的 PCR产
物直接送上海生工生物技术服务有限公司测序 。
1.5　序列分析
　　测序结果在 NCBI上进行 Blast比对 。用 Clone
Manager软件进行对测序结果进行序列剪接 。并用
clustalx和 PHYLIP(版本 3.573c)软件对序列进行
比对和进化分析。
2　结果与分析
2.1　桑属植物 trnL内含子序列的扩增 、纯化与测序
　　PCR产物的凝胶电泳结果显示 ,引物扩增获得
1个特异性片段 ,大小约为 550 bp(图 1)。与 NCBI
报道的其它物种的序列大小一致。将目的条带切
下 ,用 PCR产物纯化试剂盒进行回收 。
M为 DL2 000marker,其余各泳道编号对应的桑树品种和外源属与表 1一致。
MisDL2 000marker, andthenumberscorrespondtothoselistedinTable1.
图 1　桑属植物 trnL序列 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig.1　IdentificationofgenusMorustrnLintronsequencesbyagarosegelelectrophoresis
　　trnL内含子序列片段采用 PCR产物直接测序
法 ,序列长度均在 550 bp左右 ,变异范围为 534 ～
561。与 GenBank已发表的桑科的鹊肾树(Streblus
pendulinus, AF501609)和麦粉饱食桑(Brosimumali-
castrum, AF501601)等 trnL内含子序列同源性在 90%
以上 ,确定该目的片段为桑属 trnL基因内含子 ,测序
结果提交 GenBank(登录号 EF195632-EF195645)。
2.2　桑属植物 trnL内含子的序列分析
　　用 ClustalX1.83软件对供试的 14份桑科植物
材料的 trnL内含子序列进行比对 ,同源性在 88% ～
99%间 ,构树和无花果与供试桑属各材料的同源性
均较低 ,分别为 90%、93%左右 ,而桑属各品系间的
同源性都大于 95%,说明供试桑属材料间亲源关系
较近。通过序列配对 , 14份供试材料间序列总长度
为 566bp,共检测到 106个变异位点 ,包括 56个碱
基替换 , 50个碱基插入或缺失 。
2.3　供试材料的 trnL内含子序列 A+T含量
　　14份桑科植物供试材料的 trnL内含子序列 A+T
含量较高 , 除桑属的牛耳桑 (65.8%)和吉蒙桑
(65.6%)外 ,其余材料的 A+T含量均在 66%以上 ,其
中构树的 trnL内含子序列 A+T含量高达 67.8%。 14
份供试材料的平均 trnL内含子序列核苷酸组成为
0.391 00(A)、 0.271 14(T)、0.176 79(C)、0.160 86(G),
平均 A+T含量为 0.662 14,说明该序列富含 A/T。
2.4　桑属植物 trnL内含子序列进化分析
　　采用 PHYLIP软件 ,以无花果 、构树作为外源
种 ,按最大简约数法(maximumlikelihood, DNAML)
构建进化树 ,采用 Bootstraping法对进化树(500个
重复)进行评估。从图 2显示的聚类结果来看 ,桑
科的构属 、无花果属和桑属分别单独聚为一类 ,这与
利用叶绿体 trnL-trnF基因间隔区序列和 ITS序列的
研究结果一致[ 2-6] ,进一步证明桑属属单系。桑属
植物聚类结果显示:在供试桑属种质材料中 ,蒙桑单
独聚为一类 ,亲缘关系最远(利用 ITS也获得了相同
结果 [ 6] );其它桑品种聚为一类 ,在这个聚类中又可
分成 3个聚类 ———牛耳桑单独聚为一类 ,插桑(鸡
桑种)、有毛岩桑(鬼桑种)、纹契桑(白脉桑种)、湖
桑 32号和火桑(瑞穗桑)聚为一类(插桑 、有毛岩桑
和火桑从形态上看 ,都具有长花柱 ,这和形态分类基
本一致),属于广东桑的钦二和伦教 40号 、保靖 5号
　300　 蚕　业　科　学 2008;34(2)　
(华桑)、T12(暹逻桑)和黔鄂桑 1号(长穗桑)聚为 一类 ,说明它们有相近的亲缘关系 。
括号内为 GenBank登录号
ThenumbersinbracketareGenBankAccessionNo.
图 2　桑属植物 trnL内含子序列系统发育树
Fig.2　PhylogenetictreeofgenusMorusgeneratedfromtrnLsequences
3　讨论
　　本研究利用 PCR产物测序法 ,对桑属植物
trnL内含子序列进行了分析 ,发现供试桑属材料
间的同源性较高 (>95%),序列变异和 trnL-F基
因间隔区序列一样 (桑属材料间平均同源性为
99.3%),小于 ITS序列间的变异 [ 2-6] ,该结果与其
它植物的相关研究一致 [ 9] 。聚类结果也进一步证
明桑属为单系 ,和其它序列分析结果一致 [ 2-6] ,也
和现有分类系统相吻合。采用 trnL内含子序列分
析方法的桑属内的聚类和形态分类相比 ,具有一
致性 ,但也存在一定差异 ,前者并没有完全按照现
有桑种划分进行聚类。因此 ,有望在桑属植物中
利用多重序列来进一步探讨其亲缘关系和对现有
分类系统进行补充和修订 。
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　301　　第 2期 汪伟等:基于 trnL内含子序列的桑属植物分子系统学初探