全 文 ：2011年第5期 总第186期2011年第5期 总第186期CAOYE YU XUMU 草业与畜牧 CAOYE YU XUMU草业与畜牧试验研究
山蚂蝗属植物在全世界约350种，多分布于亚热
带和热带地区，我国有27种5变种，大多分布于西南
经中南部至东南部，仅1种产于陕、甘西南部［1］。目
前，对山蚂蝗属植物的研究多集中在药用价值［2~4］、根
瘤菌固氮［5,6］、饲草与饲料［7~9］、园林景观及草坪［10~12］
等方面，对山蚂蝗属植物遗传多样性的研究报道较
少，特别是山蚂蝗属植物从广义山蚂蝗属中独立出来
后，在分子评定方面的研究鲜有报道。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2份供试种质一份为绒毛山蚂蝗，另一份用卵叶
山蚂蝗作为对照。取籽粒饱满的种子10粒，分别种在
装有5.5kg土的花盆里，出苗15天后取样。每份材料
取嫩叶2~3g。放入封口袋中，编好号。放入-70℃冰
箱备用。
1.2 试剂
1.2.1 缓 冲 液 １： 100mmol/L Tris-cl （pH8.0）；
20mmol/L EDTANa2 （pH8.0）； NaCl 500mmol/L；
B-Mercaptoethanol 10mmol/L， 体 积 分 数 为 2%
CTAB，2%PVP。
1.2.2 缓 冲 液 2： 100mmol/L Tris-cl （pH8.0）；
50mmol/L EDTANa2 （pH8.0）； NaCl 500mmol/L；
B-Mercaptoethanol 10mmol/L， 体 积 分 数 为 2%
CTAB，2%PVP。
1.2.3 缓 冲 液 3： 100mmol/L Tris-cl （pH8.0）；
80mmol/L EDTANa2 （pH8.0）； NaCl 500mmol/L；
B-Mercaptoethanol 10mmol/L， 体 积 分 数 为 2%
CTAB，2%PVP。
1.2.4 缓 冲 液 4： 100mmol/L Tris-cl （pH8.0）；
50mmol/L EDTANa2 （pH8.0）； NaCl 500mmol/L；
B-Mercaptoethanol 10mmol/L， 体 积 分 数 为 1.4%
SDS，2%PVP。
1.2.5 氯仿、异戊醇缓冲液：氯仿 ∶异戊醇=24 ∶ 1；
酚 ∶氯仿 ∶异戊醇=25 ∶ 24 ∶ 1。
1.2.6 高盐TE缓冲液：1ml 1mol/L Tris-cl（pH=8.0）
与0.2ml 0.5mol/L（pH=8.0） EDTA和1.17g NaCl溶液
混合后，用重蒸水定容至100ml而成。
1.2.7 低盐TE缓冲液：1ml 1mol/L Tris-cl（pH=8.0）
与0.2ml 0.5mol/L（pH=8.0） EDTA溶液混合后，用
重蒸水定容至100ml而成。
1.2.8 其他试剂：液氮、异戊醇、异丙醇、无水乙
醇、70%乙醇、3mol/L KAc、5 mol/L KAc（注：常规
化学试剂均为分析纯）。
1.3 提取方法（见表1）
山蚂蝗属植物DNA提取方法研究
王春梅 1，徐 娜 2，李阳春 1*，白昌军 3，徐 立 3
（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.四川省草原科学研究院，四川 成都 611731；
3.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737）
摘 要：山蚂蝗属植物（Desmodium Desv.）部分种如绒毛山蚂蝗（D.velutinum（Willd.） DC.var.velutinum），在基因
组DNA提取过程中易降解，影响了基因组DNA的纯度。本文分析了引起绒毛山蚂蝗基因组DNA降解的可能原因，并采
用改良的SDS法解决了部分山蚂蝗属植物的DNA降解问题，提高了DNA的质量。对采用该方法提取的基因组DNA进行
AFLP分析，得到条带清晰、多样性丰富的图谱。结果表明改良的SDS法适宜绒毛山蚂蝗基因组DNA的提取。
关键词：山蚂蝗属植物；绒毛山蚂蝗；基因组DNA；SDS法；AFLP
收稿日期：2010-10-12
作者简介：王春梅（1978-），女，四川广元人，硕士，研究方
向为草业野生植物种质资源的保护与利用。
*通讯作者
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1673-8403（2011）05-0008-04
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1.3.1 CTAB法I：将0.1g叶片，于液氮中研磨至粉末
状，转入2ml离心管中；加入800μl己预热至65℃
的提取缓冲液 1，充分摇匀，在 65℃水浴中保温
40min以上，其间颠倒轻摇几次以免成团；取出离心
管，加入等体积的氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1 v/v）混合
液，充分混匀，室温下12000 rpm离心10 min；取上
清，加入等体积的氯仿 ∶异戊醇（24 ∶ 1 v/v），充分混
匀，4℃下12000 rpm离心10 min； 在回收的上相中
加入1/10体积的预热的10%CTAB溶液，颠倒混匀；
加入等体积预冷的异丙醇，充分摇匀，于-20℃冰箱放
置约15 min，取出， 4℃下6000rpm离心10 min；弃
上清，用70%乙醇漂洗2次，风干用200μl 高盐TE
缓冲液溶解沉淀。
1.3.2 CTAB法II: 同步骤1.3.1，只是第二步加入缓冲
液2。
1.3.3 CTAB法III: 同步骤1.3.1，只是第二步加入缓
冲液3。
1.3.4 SDS法 I：称取0.1g新鲜叶片，于液氮中研磨
至粉末状，转移到2ml离心管中；加入800μl己预热
至65℃的提取缓冲液4，轻轻搅动，使粉末充分散
开，在65℃保温40 min；加入500μl 5mol/L KAc，充
分混匀，置冰浴（0℃）30 min；于4℃ 12000rpm离
心 15 min；取上清，加入等体积的氯仿 ∶ 异戊醇
（24 ∶ 1），轻轻颠倒离心管数次，放置片刻，抽提；于
4℃ 8000rpm离心10 min；取上清，加入等体积预冷
的异丙醇，混匀，-20℃放置15 min；于4℃ 6000rpm
离心10 min，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，
风干；加入200μl高盐 TE缓冲液，充分溶解沉淀。
1.3.5 SDS 法 II：同步骤 1.3.4，只是第二步加入
500μl 3mol/L KAc。
1.4 DNA纯化
在DNA粗提液中加入10μl 1mg/ml RNase酶，在
37℃的水浴锅中保温1h，加入200μl灭菌水，充分混
匀；加入等体积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1），混
匀，4℃下12000 rpm离心10min；取上清，加入等体
积的氯仿 ∶异戊醇（24 ∶ 1），混匀，4℃12000 rpm离
心10 min；取上清，加入2倍体积的预冷无水乙醇，
充分摇匀，-20℃冰箱放置约30min，4℃下12000 rpm
离心10 min；弃上清，用70%乙醇漂洗3次，风干，
用50μl低盐TE缓冲液溶解沉淀，放入-20℃冰箱备
用。
1.5 DNA纯度测定
取5L DNA样液和1μl loading buffer于0. 8%的琼
脂糖凝胶上电泳，核酸染料(Gold View)染色，凝胶成
像系统观察成像并统一记录试验结果。
取2μlDNA样液稀释50倍，在核酸蛋白测定仪
（Eppendorf）上测定其在260nm、280nm波长处的OD
值和260nm波长处浓度，依据公式（样液DNA浓度=
稀释液浓度×稀释倍数）计算DNA产率。依据OD260/
OD280的比值判断DNA样品的纯度。
1.6 DNA定量
取10μl DNA样液，稀释标定到50ng/μl，所有
DNA稀释液均放入-20℃冰箱备用。
1.7 AFLP分析
取各标定的DNA稀释供试样液4μl为模板，按
北京鼎国生物技术有限责任公司的试剂和操作步骤进
行酶切、连接、预扩增和选择性扩增，然后用聚丙酰
胺凝胶电泳，电泳完毕后，银染染色，照相，观察结
果。
2 结果与分析
2.1 不同提取方法的电泳结果分析（见图1）
如图1电泳结果所示，采用SDS法提取的绒毛山
蚂蝗基因组DNA（处理2、处理4、处理8、处理9）
的效果都较好，其中以鲜样提取的质量最好（处理
8、处理9），其次是-70℃（处理4）的样。而采用
CTAB法提取绒毛山蚂蝗基因组DNA都有不同程度的
降解，降解最严重的是处理1（-20℃保存）和处理5
（20mmol/L EDTANa2），处理7（80mmol/L EDTANa2）
降解相对较少，DNA的产率最高，其次是处理6的鲜
样（50mmol/L EDTANa2）和处理3（-70℃）存在部
分降解，DNA的产率稍高。
卵叶山蚂蝗（D. ovalifolium）基因组DNA提取相
对容易，无论那种方法或者存放温度都能提取出无降
解、无RNA、点样孔干净等高质量的总DNA。存放
于-20℃的CTAB法II（处理1）、SDS法I（处理2）和
表1 山蚂蝗基因组DNA提取方法
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
样品来源
-20℃
-20℃
-70℃
-70℃
鲜样
鲜样
鲜样
鲜样
鲜样
提取方法
CTAB法II
SDS法I
CTAB法II
SDS法I
CTAB法I
CTAB法II
CTAB法III
SDS法I
SDS法II
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20mmol/L EDTANa2（pH8.0）时 （处理5） 这三种处
理的DNA产率相对较低。
对比不同EDTA浓度梯度处理电泳结果可知，浓
度越低，降解越严重，DNA产量较低；提高EDTA浓
度，降解减少，DNA产量提高；EDTANa2 (pH8.0)浓
度达到80mmol/L时，降解较少，DNA产量也较高。
2.2 DNA纯度分析（见表2）
根据电泳结果，上下两个泳道中处理3、4、6、
7、8、9效果较好，分别抽取这些处理提取的DNA进
行纯度测定。
一般来说，纯净的DNA溶液是透明的，用核酸蛋
白测定仪（Eppendorf）测定其260及280的吸收值比
应为1.8。260及 230的吸收值比应大于2.0 ［13］。若
OD260/OD280大于1.8，表明样品中含有较多的RNA；若
比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多或混杂
有提取时所用的酚试剂。OD260/OD230小于2.0时，表明
溶液中有残存的小分子及盐类杂质［13］。从表中可以看
出，本研究中OD260/OD280 的比值除了绒毛山蚂蝗的处
理3小于1.6，处理8和卵叶山蚂蝗的处理9稍大于1.8
外，其余均在1.6～1.8之间。但是OD260/OD230的比值
却相差很大，除了两者的处理9，其他都小于2.0，表
明都有不同程度的小分子及盐类杂质残存。
通过电泳和纯度检测，最终确定采用处理9（即
SDSⅡ）提取山蚂蝗属植物的DNA进行AFLP分析。
2.3 山蚂蝗属植物的部分AFLP分析（见图2）
采用SDSⅡ法提取山蚂蝗属供试植物的DNA进行
AFLP分析，能扩增出多态性丰富的条带。如图2所
示，AFLP分析结果条带清晰，多态性好。由此可
见，所筛选出的方法提取的DNA质量好，纯度高，可
用于AFLP分析。
图2 山蚂蝗属植物的部分AFLP分析(E-AAC/M-CAA)
图1 山蚂蝗属植物基因组DNA
绒毛山蚂蝗
卵叶山蚂蝗
处理号
3
4
6
7
8
9
3
4
6
7
8
9
OD260/OD280
1.54
1.65
1.63
1.60
1.81
1.79
1.72
1.78
1.66
1.73
1.75
1.83
OD260/OD230
1.80
1.26
1.34
1.27
1.56
2.01
1.98
1.58
1.93
1.16
1.47
2.03
DNA含量(ng/ul)
78.4
82.3
70.2
291.6
155.5
251.7
93.8
89.5
92.5
205.6
91.6
90.9
表2 6种处理的山蚂蝗属植物DNA的浓度和纯度
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3 讨论
植物幼叶DNA提取过程中出现的降解原因通常
有三种：人为的操作技术、褐变、DNA酶活性的影
响［13］。本研究中，卵叶山蚂蝗基因组DNA未见降
解，即使采样后两个小时再放入-70℃或-20℃冰箱
中，两天之内提取都没有降解的情况发生；即使出现
些许的褐变也没有影响DNA的纯度。绒毛山蚂蝗却极
容易降解，本试验的 9 种处理中同时加入了
B-Mercaptoethanol和 PVP40 以防止褐变带来的降解，
但是绒毛山蚂蝗DNA仍然存在严重的降解问题，所以
在本试验中设计了EDTANa2 （pH8.0）浓度梯度，结
果表明随着浓度的增加，所提取的基因组DNA的产率
也相应增加，降解也相对减少，所以本试验认为绒毛
山蚂蝗等的降解可能与DNA酶的活性有关，即绒毛山
蚂蝗等植物中DNA酶的活性相对较高。
本试验设计了材料保存的不同温度处理，结果表
明材料保存温度对山蚂蝗属植物基因组的提取有一定
的影响。卵叶山蚂蝗对保存温度要求相对不严格，但
是绒毛山蚂蝗在采样后短时间内不放在冰袋内，提取
出来的基因组DNA就会降解，所以采样必须使用冰
袋，回到实验室后即放置于-70℃的冰箱保存，
从-70℃冰箱取出后放置于液氮中。取样、磨样的过
程要快而且严谨，才会尽量减少山蚂蝗属植物基因组
DNA的降解。
对AFLP标记来说，DNA的降解，多糖、多酚以
及提取过程中EDTA、SDS等杂质的残留都会影响双
酶切，所以提取高质量的DNA是进行分子生物学研
究的首要步骤。而且要电泳结果和纯度都达到较好的
结果才能开始下一步的试验。每种植物的内含物不一
样，所以提取方法也要做相应的改变，虽然卵叶山蚂
蝗 、 假 地 豆 （D.heterocarpon （Linn.） DC.var.
heterocarpon）等用任何一种常规的方法或者是在任何
保存条件下都可以提取出高质量的基因组DNA，操作
简单，但是在同一个AFLP研究中，必须用同一种方
法提取所有供试的山蚂蝗属植物基因组DNA，这样便
于下一步AFLP分析。所以用改进SDS法提取的山蚂
蝗属植物，电泳效果和纯度检测都较好，而且能被双
酶酶切，AFLP分析效果较好，适宜于所有山蚂蝗属
植物DNA的提取。
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