全 文 ：４种紫珠属药用植物ＲＡＰＤ多态性分析
杨先国１，谷陟欣２，卢 捷２，刘克明３，黄 胜２
（１．湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲４１２０１２；２．九芝堂股份有限公司，湖南 长沙４１００２１；
３．湖南师范大学 生命科学学院，湖南 长沙４１００８１）
摘 要：目的：运用随机扩增多态性技术探索４种紫珠属药用植物的遗传多态性，为其种质鉴定提供依
据。方法：采用试剂盒提取法提取裸花紫珠、广东紫珠、大叶紫珠与杜虹花４种新鲜植物叶中的总
ＤＮＡ，采用经过筛选的２０条随机引物进行ＰＣＲ扩增。结果：试剂盒可有效获取４种紫珠植物的总
ＤＮＡ，扩增得到条带共１５２条，多态性条带１３７条，多态率达到８８．２％；聚类分析结果表明，４种紫珠供
试材料共分为３类。结论：４种紫珠ＲＡＰＤ扩增后的聚类分析结果与植物形态学观察分类结果相一致，
所得ＲＡＰＤ标记可用于紫珠属药用植物的多态性研究，为开发遗传鉴定的分子标记奠定基础。
关键词：紫珠属；基因组ＤＮＡ；ＲＡＰＤ；多态性；聚类分析
中图分类号：Ｒ２８２．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２１９７（２０１５）０７－００２８－０４
ＤＯＩ：１０．１１９５４／ｙｔｃｔｙｙ．２０１５０７０１４
收稿日期：２０１４－１１－０３
作者简介：杨先国（１９７７－），男，湖南中医药高等专科学校讲师，研究方向为中药质量与中药资源。
紫珠属植物（ＣａｌｌｉｃａｒｐａＬｉｎｎ）来源于马鞭草科，我国紫
珠属植物有４６种，主要分布于长江以南的广大地区，如海
南、广东、广西、云南、贵州、湖南、江西、福建等地。其中约
有３０多种可以作为药用，入药部位为茎叶或全株，其性平、
味苦，归肝、脾、肺经，具有活血止血、清热解毒等功效，主要
用于治疗吐血、咳血、便血、崩漏、创伤出血等［１－２］。
紫珠作为一种重要的中药资源，在我国被广泛使用。对
我国的中药材地方标准中收载的紫珠品种进行统计可知，我
国湖南、广东、广西、江西、云南、河南以及山东７个省区的中
药材地方标准收载了近８种紫珠属药用植物，其中以裸花紫
珠、广东紫珠、大叶紫珠以及杜虹花为主，现已作为中成药制
剂的原料药广泛使用。由紫珠药材制成的中成药品种达２０
多种，其中裸花紫珠为九芝堂股份有限公司生产的裸花紫珠
片的主要原料药［３－４］。但在原料收集过程中，可能有紫珠属的
其他药材混入到原料药中，由于紫珠属植物叶及枝均具有止
血、解毒等功效，且原植物药材性状极其相似，在市场流通及
临床应用过程中难以鉴别，因而常常相互混用。目前文献研
究主要集中在生药学鉴定［５－６］、质量标准研究方面［７－１１］，仍未
从分子水平对常用紫珠属药材进行鉴定。本研究采用ＲＡＰＤ
分子标记从ＤＮＡ分子水平对四个紫珠品种展开相关研究，
为合理利用紫珠属药用植物资源、从ＤＮＡ分子水平揭示四
种紫珠属药用植物品种的亲缘关系提供科学依据
。
图１ 肺心宁颗粒相对临界湿度
３ 结果与讨论
肺心宁胶囊制备工艺确定为：以干浸膏粉∶辅料＝
０．６５∶０．３５的比例加入辅料（甘露醇∶乳糖＝１∶１），以
９５％乙醇为润湿剂制成软材，过１６～１８目筛制粒，５０℃烘
干，用胶囊板装入一号胶囊中即得。
若仅仅加入辅料，则对肺心宁干浸膏粉性质的改善效
果不明显，所以采用制粒的方法进一步改善其流动性，中药
干浸膏粉通常具有很强的吸湿性，加大了直接制粒的难度，
所以通常加入适当辅料与之混合制粒。临界相对湿度
（ＣＲＨ）是药物吸湿性大小的衡量指标，可根据ＣＲＨ的大小
确定生产时的环境湿度，由实验结果可知，用９５％乙醇制成
的肺心宁颗粒临界相对湿度为７３．００％，故在生产时，车间
的相对湿度应控制在７３．００％以下。
参考文献：
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［Ｊ］．中华中医药学刊，２０１１，２９（３）：４６５－４６８．
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究［Ｊ］．时珍国医国药，２０１０，２１（１０）：２５９７－２５９８．
（责任编辑：宋勇刚）
—８２—
１ 材料与仪器
１．１ 材料
裸花紫珠Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ Ｈｏｏｋｅｒ ＆ Ａｍｏｔｔ，广
东紫珠ｃａｌｌｉｃａｒｐａ ｋｗａｎｇｔｕｎｇｅｎｓｉｓ Ｃｈｕｎ，大叶紫珠ｃａｌｌｉ－
ｃａｒｐａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｖａｈｌ，杜虹花 Ｃａｌｌｉｃａｒｐａｆｏｒｍｏｓａｎａ
Ｒｏｌｆｅ，由湖南中医药高等专科学校彭学著教授鉴定为真品。
样品来源及分类见表１，每种植物均取嫩叶提取基因组
ＤＮＡ，－２０℃保存。
１．２ 仪器
ＤＹＹ－２Ｃ电泳仪（北京六一仪器厂），ＰＣＲ 仪 ＭＡＳ－
ＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ），凝胶成像系统 Ｔａｎｏｎ
１６００Ｒ（上海天能），－８０℃超低温冰箱 ＤＷ－ＨＬ５３８（中科美
菱）。
１．３ 试剂与引物
广谱性植物总 ＤＮＡ提取试剂盒（ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ
Ｋｉｔｓ）购自广州 Ｍａｇｅｎ（美基）生物公司，２×Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
购自康为世纪，ＲＡＰＤ引物购自上海生工公司产品（见表
２）。其他试剂均为分析纯。
表１ ４种紫珠样品来源及分类
编号 样品 采集地 采集时间 备注
１
裸花紫珠Ｃａｌｌｉｃａｒｐａｎｕｄｉ－
ｆｌｏｒａ Ｈｏｏｋｅｒ ＆Ａｍｏｔｔ
海南五指山 ２０１４．７ 新鲜叶片
２
广东紫珠ｃａｌｌｉｃａｒｐａ ｋｗａｎ－
ｇｔｕｎｇｅｎｓｉｓ Ｃｈｕｎ
湖南株洲 ２０１４．７ 新鲜叶片
３
大叶紫珠ｃａｌｌｉｃａｒｐａ ｍａｃ－
ｒｏｐｈｙｌｌａ Ｖａｈｌ
广东大学城
植物园
２０１４．７ 新鲜叶片
４
杜虹花 Ｃａｌｌｉｃａｒｐａｆｏｒ－
ｍｏｓａｎａ Ｒｏｌｆｅ
广东大学城
植物园
２０１４．７ 新鲜叶片
表２ ＲＡＰＤ分析所用引物
引物编号 引物序列 引物编号 引物序列
Ａ１ ＧＴＧＣＣＴＡＡＣＣ Ａ１１ ＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧ
Ａ２ ＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴ Ａ１２ ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ
Ａ３ ＣＣＡＧＴＡＣＴＣＣ Ａ１３ ＧＴＴＴＣＧＣＴＣＣ
Ａ４ ＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡ Ａ１４ ＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧ
Ａ５ ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣ Ａ１５ ＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣ
Ａ６ ＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣ Ａ１６ ＣＣＴＴＧＡＣＧＣＡ
Ａ７ ＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧ Ａ１７ ＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧ
Ａ８ ＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣ Ａ１８ ＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧ
Ａ９ ＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧ Ａ１９ ＣＣＡＣＡＧＣＡＧＴ
Ａ１０ ＣＡＡＴＣＧＣＣＧＴ Ａ２０ ＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣ
２ 方法
２．１ 紫珠植物组织ＤＮＡ提取
采用 Ｍａｇｅｎ植物总ＤＮＡ提取试剂盒标示的使用方法
进行提取。采用液氮将植物样品研磨成粉末，转移５０～
１００ｍｇ冻藏样品至２ｍＬ离心管中，立即加入６００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ
ＰＴＬ／２－Ｍｅ和５μＬ ＲＮａｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ至样品中，剧烈涡旋使
样品充分分散，６５°Ｃ水浴２０ｍｉｎ，期间颠倒混匀２～３次，加
入６００μＬ氯仿－异戊醇（２４∶１），涡旋混匀３０ｓ，室温下
１２ ０００ｘｇ离心５ｍｉｎ，转移上清液至新的离心管中，加入等倍
体积Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢＬ至上清液中，涡旋混匀３０ｓ，将ＤＮＡ 柱装
在收集管中，转移混合液（＜７００μＬ）至柱子中，８ ０００ｘｇ离心
３０～６０ｓ。然后按照使用手册方法进行提取，将提取的
ＤＮＡ保存于－２０℃下备用。
２．２ ＰＣＲ扩增及电泳检测
为获得稳定的试验结果，减少实验过程中因操作导致
的实验误差，ＰＣＲ反应体系选择２×Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＰＣＲ
扩增体系，只需在反应体系中加入ＤＮＡ模板、引物以及去
离子水，主要优化对ＲＡＰＤ影响较大的３个反应参数，即
ＰＣＲ反应体系中的 ＤＮＡ 模板浓度（１μＬ、１．５μＬ、２．０μＬ、
２．５μＬ、３．０μＬ）、引物浓度（０．４μＬ、０．８μＬ、１．２μＬ、１．６μＬ、
２．０μＬ）、体系循环次数（２５、３０、３５、４０、４５次）。优化结果表
明，ＤＮＡ模板浓度为２．５μＬ、引物浓度为２．０μＬ、循环４０次
为最佳反应条件。
ＰＣＲ扩增反应程序：向紫珠ＲＡＰＤ反应的５０μＬ反应
体系中加入模板 ＤＮＡ ２．５μＬ、引物２μＬ、２×Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ ２５μＬ以及去离子水２０．５μＬ。ＰＣＲ扩增程序为９４℃预
变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，３６℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０次
循环，７２℃后延伸７ｍｉｎ，４℃保存。取扩增产物５μＬ，在
１．５％琼脂糖凝胶上恒压（１１０Ｖ）电泳６０ｍｉｎ，凝胶中含
０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭（ＥＢ），采用凝胶成像系统照相。
２．３ 数据分析
对扩增后电泳带总数及多态性条带数进行统计。将电
泳图谱中的每一条带（ＤＮＡ片段）作为一个分子标记，并在
模板上有一个结合位点，不同的样本在凝胶上泳动距离相
同则表明其有相同的位点。根据各分子标记的有无得到所
有位点的二元数据，有带记为“１”（强带和弱带同记），无带
记为“０”，采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行聚类分析。
３ 结果与分析
３．１ 基因组ＤＮＡ电泳检测
取４种紫珠基因组ＤＮＡ提取液１０μＬ，在稳压１１０Ｖ、
１．０％琼脂糖凝胶上电泳６０ｍｉｎ。基因组ＤＮＡ 电泳检测结
果表明（见图１），通过试剂盒提取的紫珠ＤＮＡ样品整齐一
致，条带清晰，没有出现拖尾与扩散现象，纯度较高，因而可
以满足ＲＡＰＤ扩增试验的要求。
图１ ４种紫珠基因组ＤＮＡ电泳谱
３．２ ＲＡＰＤ标记多态性分析
２０条ＲＡＰＤ引物对４种紫珠属植物样本进行扩增得
到的条带的相对分子量主要集中在３００～２００ｂｐ，共扩增得
到条带１５２条，其中多态性条带共１３７条，多态率达８８．２％，
平均每条引物产生７．６个条带与６．８个多态性条带（见表
—９２—
３），４个样品的ＲＡＰＤ扩增结果见图２、图３、图４、图５。
表３ ＲＡＰＤ分析所用引物序列及扩增结果 （ｎ）
引物名称 扩增条带数 多态性条带数 多态性（％）
Ａ１ １０ １０ １００．０
Ａ２ １０ １０ １００．０
Ａ３ ７ ５ ７１．４
Ａ４ ８ ７ ８７．５
Ａ５ １２ １１ ９１．７
Ａ６ ９ ９ １００．０
Ａ７ ８ ８ １００．０
Ａ８ ７ ５ ７１．４
Ａ９ ７ ７ １００．０
Ａ１０ ６ ５ ８３．３
Ａ１１ ７ ７ １００．０
Ａ１２ ６ ５ ８３．３
Ａ１３ ９ ８ ８８．９
Ａ１４ ６ ６ １００．０
Ａ１５ ８ ７ ８７．５
Ａ１６ ４ １ ２５．０
Ａ１７ ６ ６ １００．０
Ａ１８ ８ ７ ８７．５
Ａ１９ ７ ７ １００．０
Ａ２０ ７ ６ ８５．７
总计 １５２ １３７
平均 ７．６ ６．８ ８８．２
３．３ 聚类分析
根据扩增条带，采用 ＳＰＳＳ１７．０ 软件中的 Ｗｉｔｈｉｎ－
ｇｒｏｕｐｓ ｌｉｎｋａｇｅ方法，根据遗传距离对４个样本进行聚类分
析，绘出紫珠样本间的ＲＡＰＤ聚类系统图（见图６）。从图６
中可以看出，利用ＲＡＰＤ方法可将４个紫珠样本分为３类，
其中杜虹花与广东紫珠的遗传距离最近，可归为一类，大叶
紫珠与裸花紫珠各为一类，而大叶紫珠比裸花紫珠在亲缘
关系上更靠近广东紫珠与杜虹花。
４ 结论
ＲＡＰＤ是建立在ＰＣＲ基础上的一种可对整个未知序
列的基因组进行多态性分析的分子标记技术，该技术具有
操作简单、快速，能在短时间内完成对多个样本研究的特
点，被广泛应用于药用植物种质资源的遗传多样性研
究［１２－１３］、种质鉴定及评价［１４－１５］、引种驯化［１６］和分类学研究等
方面［１７］。但由于ＲＡＰＤ－ＰＣＲ的影响因素较多，重复性与稳
定性较差，为提高实验的稳定性与可重复性，本实验采用２
×Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＰＣＲ 混合反应体系，该体系中含有
Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ以及Ｔａｑ酶浓度等均经过优化，适宜各类植物
的扩增实验。在体系的优化过程中，仅需要对基因组ＤＮＡ
模板的浓度、引物浓度及循环次数等参数进行优化，实验结
果表明，ＤＮＡ模板浓度为２．５μＬ、引物浓度为２．０μＬ、循环
４０次时，扩增的条带较多，条带较清晰。
图２ 裸花紫珠ＲＡＰＤ扩增图
图３ 广东紫珠ＲＡＰＤ扩增图
图４ 大叶紫珠ＲＡＰＤ扩增图
—０３—
图５ 杜虹花ＲＡＰＤ扩增图
图６ 紫珠样品ＲＡＰＤ聚类分析结果
紫珠属植物ＲＡＰＤ分析结果表明，２０个引物共检测出
１５２条带，多态性条带共１３７条，多态率达８８．２％。从ＤＮＡ
分子水平来说，样本间遗传距离越大，说明遗传分化越大；
聚类分析结果表明，４个紫珠属样本可分为３类，其中杜虹
花与广东紫珠的遗传距离最近，大叶紫珠与裸花紫珠各为
一类，上述分析结果与紫珠属植物的生药学分类相一致。
采用ＲＡＰＤ分子标记研究紫珠属资源之间的遗传多样性和
亲缘关系，对于紫珠属药用植物种质资源的遗传育种、合理
利用具有重要意义。
参考文献：
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（责任编辑：尹晨茹）
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４１００２１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８１，Ｃｈｉｎａ）
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ｍａｃｒｏｐｈｙｌａ Ｖａｈｌ ａｎｄ Ｃａｌｉｃａｒｐａ ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｒｏｌｆｅ，ｔｈｅｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ２０ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｗａｓ ｅｆｆｅｅｔ－
ｉｖｅ ｆｏｒ ４Ｃａｌｉｃａｒｐａ ｌｉｎｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｎｔｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ，２０ｐｒｉｍｅｒｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ
１５２ｂａｎｄｓ，１３７ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ ｗａｓ ８８．２％，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｇｏｏｄ．Ｔｈｅ ｄｅｎｄｏｇｒａｍ ｒｅ－
ｆｌｅｃｔｅｄ ｔｈａｔ ４ｓａｍｐｌｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｔａｘａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｉｓ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．ＲＡＰＤ
ｍａｒｋｅｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ Ｃａｌｉｃａｒｐａ ｌｉｎｎ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｌｉｃａｒｐａ Ｌｉｎｎ；Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；ＲＡＰＤ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ
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