全 文 ：园　艺　学　报　2009, 36 (11):1651-1658
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2009-04-02;修回日期:2009-08-31
基金项目:广西壮族自治区科技厅项目 (桂科能 05112001-1C)
＊ E-mail:wangyihong27@ 126.com
两个叶绿体基因位点的 DNA条形码在桉属种间鉴
定中的应用
王以红 1＊ , 陶晓瑜 2 , 刘海龙 1 , 陈晓明1 , 邱英雄2
(1广西壮族自治区林业科学研究院 , 南宁 530001;2浙江大学生命科学学院 , 植物系统与进化实验室 , 杭州 310029)
摘　要:对桉属的 13个样本 (11个种 、 1个人工杂交种和 1个优良无性系)的 trnH-psbA基因间隔区
的序列进行了比对和分析 , 13个桉属样本的 trnH-psbA长度范围为 538 ～ 576 bp, 序列排序的一致性长度为
590bp。共检测出了 52个变异性状 , 其中 46个变异性状为碱基置换 , 6个性状为插入或缺失。同时 , 对桉
属 11个样本的 rpl2-trnH基因间隔区 (大单拷贝与反向重复接头)区域进行了序列分析 , 分析表明 , 11个
桉属样本的 rpl2-trnH长度范围为 79 ～ 149 bp, 序列排序的一致性长度为 154 bp。共检测出了 19个变异性
状 , 其中 4个性状为插入或缺失 , 15个变异性状为碱基置换。尾叶桉优良无性系的 trnH-psbA和 rpl2-trnH
序列与尾叶桉仅 1个位点的碱基置换;与巨尾桉 、 巨桉进行比较 , 尾叶桉优良无性系的 trnH-psbA序列有
27 bp的插入 , 以上 4个近缘样本在 rpl2-trnH区域的序列差异为 12个碱基置换。研究表明 , 通过两个
cpDNA基因位点序列不仅可以将桉属不同种进行区分 , 而且也可以区分尾叶桉优良无性系与尾叶桉。因此 ,
本研究涉及的两个叶绿体基因组位点序列在建立桉树植物种间鉴定的 DNA条形码方面具有潜在的应用价
值。
关键词:桉属;叶绿体 DNA;rpl2-trnH;trnH-psbA;鉴定;DNA条形码
中图分类号:S687;Q16　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2009)11-1651-08
ATwo-locusChloroplast(cp)DNABarcodeforIdentificationofDiferentSpeciesinEucalyptus
WANGYi-hong1＊ , TAOXiao-yu2 , LIUHai-long1 , CHENXiao-ming1 , andQIUYing-xiong2
(1 GuangxiAcademyofForestry, Nanning530001, China;2 LaboratoryofSystematicandEvolutionaryBotanyandBiodiversity,
ColegeofLifeSciences, ZhejiangUniversity, Hangzhou310029, China)
Abstract:Inthisstudy, sequencesoftrnH-psbAspacerwereanalyzedfor13Eucalyptussamples.The
trnH-psbAspacerof13Eucalyptussamplesvariedinlengthfrom538to576bp, andwerealignedwithacon-
sensuslengthof590bp.Fifty-twomutationswerescoredintotal.Sixofthesecharacterswereindels, and46
charactersweresubstitution.ThechloroplastgenomeofEucalyptus, likethatofmostangiosperms, posesses
invertedrepeats(IR).Therpl2-trnHspacer, locatedatoneoftwojunctionsbetweentheIRsandthelarge
singlecopy(LSC)regions, wasalsosequencedfrom11 EucalyptusDNAsamples.Sequencesofrpl2-trnH
were79 -149 bpinsize, andwerealignedwithaconsensuslengthof154 bp.Nineteenmutationswere
scoredintotal.Fourofthesecharacterswereindels.WhencomparedwithE.urophyla, onlyonemutation
wasobservedintherpl2-trnHspacersequencesoftheeliteclone(GL4).However, comparedwithE.
grandisandE.grandis×E.urophyla, GL4 possesedarelativelylarge(27 bp)insertionintrnH-psbA
intergenicspacer.Moreover, thesequencesofrpl2-trnHamongthesefourrelatedsamplesshowsingle-site
mutations(12 intotal).Extensivevariationwasfoundintherpl2-trnHandtrnH-psbAintergenicspacer
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(IGS)regions, suggestingthatthesequencesinthispairoflocihavethepotentialtodiscriminateamongthe
largestnumberofspeciesorvarietiesofeucalyptforDNAbarcodingpurposes.
Keywords:Eucalyptus;chloroplastDNA;rpl2-trnH;trnH-psbA;identification;DNAbarcoding
通过短的同源 DNA序列鉴定植物或动物种类被称为 DNA条形码 (DNAbarcoding), 基于 DNA
barcoding技术进行鉴定和分类的研究已成为生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点 (Mar-
shal, 2005;Pennisi, 2007)。该技术在动物种类鉴定中已得到广泛的应用 , 所采用的标准片段是线
粒体 COl基因中约 650 bp长的一段 (Hajibabaeietal., 2007)。在植物中 , 由于线粒体基因组进化速
率较慢 , 因此 , 叶绿体基因组的 DNA序列 (cpDNA)是建立植物 DNA条形码的最佳选择 (Kresset
al., 2005)。大多数被子植物 cpDNA有两个反向重复序列 (invertedrepeatsequence, IR), 两个 IR
之间为大单拷贝区 (largesinglecopyregion, LSC)和小单拷贝区 (smalsinglecopyregion, SSC)。在
LSC和 IR之间有两个连接区域 , Shinozaki等 (1986)定义为 JLA和 JLB。其中 , JLA两侧的 2个基因间
隔区 (Intergenicspacer)(rpl2-trnH、 trnH-psbA)由于片段的缺失和插入而呈现较高的进化速率 , 在
检测种间单倍型变异方面具有潜在的应用价值 (Vailancourt＆Jackson, 2000)。近年来 , 尽管不同学
者提出了不同的片段组合方案 , 但在植物 DNA条形码的研究方面还未获得一致的标准片段 (Holing-
sworth, 2008)。植物 DNA条形码的建立不仅有利于快速 、 准确地识别和鉴定物种 (Lahayeetal.,
2008), 同时 , 在观赏林木品种的鉴定 、 中药材真伪识别等方面也将发挥重要的作用 (陈士林 等 ,
2007)。与其他 DNA分子鉴定技术 , 如 RFLP、 RAPD、 AFLP、 AP-PCR、 基因芯片技术等相比 , DNA
条形码技术的重复性与准确率更高 , 操作也更为简便。
桉树是包括桃金娘科 (Myrtaceae)的杯果木属 (Angophora)、 桉树属 (Eucalyptus)和伞房属
(Corymbia)的众多树种的统称 , 共有 808个种和 137个亚种或变种 , 原产地为澳大利亚和印度尼西
亚及附近的几个岛屿 (Eldridgeetal., 1993)。桉树的一些种类适应性广 , 抗逆性强 , 繁殖容易 , 是
重要的生态和经济树种。迄今为止 , 我国引种的桉树已有 300多种 , 进行过育苗造林的有 200多种 ,
引种的范围遍及中国大部分地区。我国学者还通过杂交育种试验选育了巨尾桉 (E.grandis×E.
urophyla)、尾赤桉 (E.urophyla×E.camaldulensis)、 尾细桉 (E.urophyla×E.tereticornis)等
人工杂交种 (祁述雄 , 2003)。然而 , 由于桉树种类多 , 而且种间存在自然与人工杂交现象 , 种间及
品种间鉴定有时非常困难 (Oteweletal., 2005), 因此 , 有必要建立桉树种类的 DNA条形码 。近年
来 DNA序列分析方法已经被成功地应用于桉树的系统分类和进化的研究 (McKinnonetal., 1999;
Steaneetal., 2002)。
本研究中通过对桉属不同种类 、 尾叶桉优良无性系的两个叶绿体 DNA位点 (rpl2-trnH和 trnH-
psbA基因间隔区序列)进行序列分析 , 旨在探讨利用选择的两个 cpDNA基因位点序列作为桉树植物
DAN条形码的可行性 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
试验所用的材料为 广`林 4号 (广西壮族自治区林业科学研究院近年来培育的尾叶桉优良无性
系)、巨尾桉 、 巨桉 、 尾叶桉及其近缘种 (表 1)。于 2006年 6月采集新鲜叶片 , 硅胶彻底干燥。
DNA序列分析在浙江大学生命科学学院植物系统进化与生物多样性实验室完成 。
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表 1　供试桉树样本及其在 rpl2-trnH和 trnH-psbA区域检测的单倍型 (haplotypes)
Table1　TheEucalyptusurophylaelitecloneandrelatedspeciesinEucalyptusandidentifiedhaplotypes
fortherpl2-trnHandtrnH-psbAintergenicspacer(IGS)regions
优良无性系和种类
Eliteclonesandspecies
样品采集地点或来源文献
Localityorreferences
trnH-psbA单倍型
HaplotypesfortrnH-psbA
rpl2-trnH单倍型
Haplotypesforrpl2-trnH
广林 4号 GL4(Eucalyptusurophyla)广西林科院 GuangxiAcademyofForestry H1 Hap1
尾叶桉 E.urophyla 广西林科院 GuangxiAcademyofForestry H1 Hap2
巨尾桉 JWA 广西林科院 GuangxiAcademyofForestry H2 Hap3
(Eucalyptusgrandis×E.urophyla)
巨桉 E.grandis 广西东门林场 GuangxiDongmenForestFarmH2 Hap4
赤桉 E.camaldulensis 广西东门林场 GuangxiDongmenForestFarmH6 Hap5
窿缘桉 E.exserta 广西东门林场 GuangxiDongmenForestFarmH3 Hap6
圆角桉 E.teleticornis 广西东门林场 GuangxiDongmenForestFarmH4 Hap7
蓝桉 E.globulus 广西东门林场 GuangxiDongmenForestFarm Hap8
斜叶桉 E.obliqua Vailancourt＆Jackson(2000) Hap9
阿彻桉 E.archeri Vailancourt＆Jackson(2000) Hap10
山桉 E.dalrympleana Vailancourt＆Jackson(2000) Hap11
蜜味桉 E.meliodora Vailancourt＆Jackson(2000) H5
大花序桉 E.cloeziana Vailancourt＆Jackson(2000) H7
弹丸桉 E.pilularis AF190384 H8
E.erythrocorys AF190382 H9
棱角桉 E.tetragona AF190381 H10
剥皮桉 E.deglupta AF190379 H11
1.2　DNA提取
称取 0.1 g干叶 , 用凝胶 Fastprep(Bio101 , USA)粉碎 , CTAB法 (Doyle, 1991)提取每个样
本总 DNA, 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 , DNA的纯度和浓度通过紫外吸收法测定 。
1.3　叶绿体基因组的部分基因片段的序列扩增 、纯化和测序
采用通用 引物:rpl2, 5′-GATAATTTGATTCTTCGTCGCC-3′;trnH, 5′-CGGATGTAGCCAAGTG-
GATC-3′(Gouldingetal., 1996)扩增 rpl2和 trnH间的基因间隔区。采用通用引物:psbA, 5′-GT-
TATGCATGAACGTAATGCTC-3′;trnH, 5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′(Sangetal., 1997)扩
增 psbA与 trnH间的基因间隔区。
聚合酶链式反应 (PCR)在 GeneAmpPCRSystem9700 PCR仪 (Perkin-Elmer, USA)上进行。
反应体系为 50 μL, 内含 5μL的 10×bufer(TaKaRa), dNTPs(0.2 mmol· L-1), MgCl2 (2mmol·
L-1), 100 μg· mL-1 BSA(牛血清白蛋白), TaqDNA聚合酶 (2U), 引物各为 7.5 pmol, 5 μL50%
的甘油 , 20 ng基因组 DNA。
PCR扩增条件:90 ℃预变性 5 min, 然后进行 35个循环:94 ℃变性 1 min, 46 ～ 55 ℃复性 1
min, 72℃延伸 1 min;循环结束后 72 ℃延伸 4 min。扩增产物经上海生工生物工程技术服务有限公
司 UNIQ-10纯化试剂盒进行纯化后 , 送上海英骏生物技术有限公司的 ABI337型自动测序仪 (PEAp-
pliedBiosysterm, USA)直接测序 。为保证所测序列的准确性 , 分别对每一样品的序列进行正向 、 反
向测序 。
1.4　数据的统计分析方法
本研究中所测得的 DNA序列采用 Sequencer(ver.4.0 GeneCode, AnnArbor, MI)和 ClustalX
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(1.5b)(Thompsonetal., 1994)进行排序 , MacClade4.0 (Maddison＆Maddison, 2000)进行差异
位点的比对和分析。
2　结果与分析
2.1　桉树 cpDNAtrnH-psbA非编码序列的分析结果
利用 Sang等 (1997)的通用引物对整个基因组 DNA进行扩增 , 扩增得到了单一条带 , 片段大小
约为 500 ～ 600 bp之间 (图 1)。
序列分析结果表明 , 尾叶桉优良无性系广林 4号 (GL4)、巨尾桉 、巨桉 、尾叶桉及其 10个近缘
种类的 trnH-psbA基因间隔区的序列长度为 538 ～ 576bp, 经过排序后的一致性长度为 590 bp(图 2)。
共检测出了 52个变异性状 , 其中 6个为 Indel(插入或缺失), 包括两个大片段的插入 (分别位
于 394 ～ 419bp之间和 535 ～ 546bp之间)和 4个 1 ～ 5 bp的插入或缺失。 46个变异性状为碱基置换
(substitution), 其中 18个变异性状为信息位点 , 28个变异性状为 Singleton(图 2)。在 46个碱基置换
(substitution)类型中 , 23个为转换 (transition), 23个为颠换 (transversion)。
如表 1所示 , 13个样本共检测了 11种单倍型 (Haplotype), 其中 , GL4与尾叶桉共有一种单倍
型 (H1), 巨尾桉和巨桉共有一种单倍型 (H2), 其它种类的单倍型为特有单倍型 (H3 ～H11)。
GL4、 尾叶桉 、 H4 (圆角桉), H6 (赤桉)有一个 27bp(TAGAAAAATGTTACTCATAATTAAGT)
的插入 (图 2), 插入片段起始的 13bp碱基序列 (ATAGAAAAATGTT)与该插入片段末端后的起始
13 bp的碱基序列一致 (位置:422 ～ 434 bp之间)。因此 , 这个插入片段可能是临近片段经复制
(duplication)而产生。 H9 (E.erythrocorys)与 H10 (棱角桉 E.tetragona)在 536 ～ 547之间有一个
12 bp的插入 。从图 2中可以看到 , GL4与巨尾桉以及巨桉相比 , 除了碱基置换以外 , 有一个 27 bp
的大片段的插入 。
图 1　cpDNA引物 rpl2-trnH和 trnH-psbA对供试桉树样本的扩增结果
1、 9:广林 4号;2、 10:尾叶桉;3、 11:巨尾桉; 4、 12:巨桉;5、 13:赤桉;
6、 14:窿缘桉;7、 15:圆角桉; 8:蓝桉;M:Marker。
Fig. 1　PCRprofilesoftherelatedspeciesinEucalyptuswithtwocpDNAprimers(rpl2-trnHandtrnH-psbA)
1, 9:GL4;2, 10:E.urophyla;3, 11:E.grandis×E.urophyla;4, 12:E.grandis;
5, 13:E.camaldulensis;6, 14:E.exserta;7, 15:E.teleticornis;
8:E.globulus.M:DNAmarker.
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图 2　13个桉树样本的 trnH-psbA区域序列排序结果
上面数字代表核苷酸位置 , 连字符表示排序空位。
Fig. 2　AlignmentofthesequencesfromthetrnH-psbAin13Eucalyptussamples
Abovenumbersrepresentnucleotideposition, andhyphensrepresentgapsinsertedforalignment.
2.2　桉树无性系及其近缘种 cpDNA的 rpl2-trnH序列的分析结果
利用 Goulding等 (1996)的通用引物对整个基因组 DNA进行扩增 , 扩增得到了单一条带 , 片段
大小约为 100 bp(图 1)。序列分析结果表明 , 尾叶桉优良无性系广林 4号以及巨尾桉 、巨桉 、 尾叶
桉及其 7个近缘种类的 rpl2-trnH区域的长度范围为 79 ～ 149bp, 经过排序后的一致性长度为 154 bp
(图 1)。共检测出了 19个变异性状 , 其中 18个变异性状发生在 rpl2和反向重复片段 (IR)的末端的
基因间隔区 , 有一个大片段的插入发生在 LSC与 IR之间的接头区域 (JLA:140 ～ 145bp之间)。 15个
变异性状为碱基置换 (substitution), 其中 4个变异性状为信息位点 , 11个变异性状为 Singleton。在
Indel(缺失或插入)类型中 , 有 2个为大片段的插入 , 2个为大片段的缺失 , 2个单碱基的缺失。 15
个碱基置换 (substitution)类型中 , 4个为转换 (transition), 11个为颠换 (transversion)。阿彻桉
表 2　尾叶桉优良无性系及其近缘种类 rpl2-trnH区域差异序列位点
Table2　ChloroplastDNAsequencepolymorphismsdetectedinrpl2-trnHregionsof11Eucalyptussamples
材料 Samples 2 12 14 15 18 21 23 29 35 36 49 59 60 68 78 127 128 140
广林 4号 GL4 A C C G C G A T A T A A 1a A 0 T 1c 0
尾叶桉 E.urophyla . . . . . . . . . . . . . . . G . .
巨尾桉 JWA . . . . G . . . . G . T . . . . . .
巨桉 E.grandis T T T T G . . A . G . T . . . . . .
窿缘桉 E.exserta T T . . T C G . G . . . . . . . . .
圆角桉 E.teleticornis . . . . G . . . . . . . . . . . . .
赤桉 E.camaldulensis . T . . . . . . . . . . . . . . . .
蓝桉 E.globulus . . . . . . . . . . . . . T . . . .
斜叶桉 E.obliqua . . . . . . . . . . C 0 0 0 . . 0 1d
阿彻桉 E.archeri . . . . . . . . . . . . . T 1b . . .
山桉 E.dalrympleana . . . . . . . . . . . . . T . G . .
　　注:上面 数字 表示 核 苷酸 位置;以下 为 插入 片 段, 1a, TTAATTAT; 1b, TTATTATTCAAAAATAGGAGTAATTAAT-
CAAAAATAGGAGTAATTAAT;1c, GGAGTAATTAAT;1d, CGAAT。
　 　 Note:Abovenumbersrepresenttheposition ofnucleotide: 1a, TTAATTAT; 1b, TTATTATTCAAAAATAGGAGTAATTAAT-
CAAAAATAGGAGTAATTAAT;1c, GGAGTAATTAAT;1d, CGAAT.
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(E.archeri)有一个最大片段的插入 (48bp)(图 3, 表 2), 在这个插入片段中 , 2个重复出现的 14bp
(TAGGAGTAATTAAT)的插入片段序列与 IR末端的 14 bp的序列一致。因此 , 这个插入片段可能是
IR末端序列经复制 (duplication)而产生 。斜叶桉 (E.obliqua)在 IR区域出现 2个大片段的缺失。
蓝桉 (E.globulus)在 LSC与 IR之间的接头区域 (JLA)有 5 bp碱基插入。其它种类之间的 DNA序
列差异为碱基置换。尾叶桉优良无性系与尾叶桉有一个位点差异 , 即 GL4在 127 bp处为 T, 而尾叶
桉则为 G。通过这个位点差异就可以把尾叶桉优良无性系与尾叶桉区分开来 (图 3, 表 2)。尾叶桉优
良无性系与巨尾桉以及巨桉之间分别有 3个和 8个位点的碱基置换。 11个样本共检测了 11种单倍型
(Haplotype)(表 2, 图 3)。
图 3　11个桉树样本的 rpl2-trnH区域的序列排序结果
所有样本的 JLA接头区域 、 IR区域以及 LSC区域被标出。
上面数字代表核苷酸位置 , 连字符表示排序空位。
Fig.3　Alignmentofthesequencefromtherpl2-trnHregionin11Eucalyptussamples
ThepositionsoftheJLAjunction(JLA), theIRandthelargesingle-copy(LSC)regionwerethenextrapolatedforalsamples.
Abovenumbersandhyphensrepresentgapsinsertedforalignmentandnucleotideposition, respectively.
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3　讨论
叶绿体 DNA序列片段的非编码区 , 由于受环境选择压力小 , 进化速率快 , 具有相对较高的核苷
酸替换率 , 被用于探讨种间或种内的亲缘关系和鉴定的研究 (Shawetal., 2007)。有研究表明 ,
rpl2-trnH、 trnH-psbA序列在烟草属 (Nicotiana)不同种间也存在较高的变异性 (Gouldingetal.,
1996)。尽管 , trnH-psbA被多数学者建议作为显花植物种间鉴别的 DNA条形码 (Chaseetal., 2005,
2007), 但 rpl2-trnH序列变异并没有被广泛研究 。本研究 trnH-psbA的序列分析表明 , 尾叶桉优良无
性系与尾叶桉之间的 trnH-psbA序列完全一致 , 但与巨尾桉以及巨桉相比 , 除了碱基置换以外 , 有 27
bp大片段的插入。巨尾桉是巨桉 (母本)和尾叶桉 (父本)的人工杂交种 , 巨尾桉与巨桉的 trnH-
psbA序列一致 , 也反映了桉树叶绿体遗传与大多数被子植物一样为母系遗传 。rpl2-trnH的测序分析
表明 , rpl2-trnH序列在桉属种间变异较大 , 尾叶桉优良无性系与巨尾桉以及巨桉之间分别有 3个和 8
个位点的差异。尾叶桉优良无性系与尾叶桉之间有一个碱基置换 。通过这个位点差异我们就可以把广
林 4号与尾叶桉区分开来。因此 , 本研究结果表明 , rpl2-trnH基因间隔区在桉树种间的变异比 trnH-
psbA要大 。Payn等 (2007)利用 rpl2-trnH序列分析方法对印度尼西亚及附近的几个岛屿尾叶桉谱系
地理进行了研究 , 与该研究检测出的叶绿体单倍型 (haplotype)种类进行比较分析发现 , 本试验中检
测的尾叶桉优良无性系与尾叶桉的两种单倍型在印度尼西亚及其附近几个岛屿的不同自然群体中有分
布 。由此可知 , 从尾叶桉不同分布点的自然群体中进行取样与引种将有利于加快良种选育。
综上所述 , 通过叶绿体 DNA的 JLA区域两侧的 rpl2-trnH与 trnH-psbA基因间隔区序列的比较 , 可
以对本研究中所有的桉属种类 (包括 1个优良无性系)进行区分 (表 1)。因此 , 桉树叶绿体 DNA的
rpl2-trnH与 trnH-psbA基因间隔区可以作为桉树苗木市场种间鉴定的 DNA条形码。然而 , 由于桉树有
808个种和 137个亚种或变种 , 这两个基因间隔区序列组合是否在桉树所有的种类均存在差异 , 值得
进一步研究 。同时 , 尽管不同的学者 (Kress＆ Erickson, 2007;Fazekasetal., 2008;Lahayeetal.,
2008)提出了不同叶绿体序列片段组合 (rbcL+trnH-psbA, matK+atpF-atpH+psbK-ps6J, matK+
atpF-atpH+trnH-psbA)作为整个陆地植物鉴定的 DNA条形码 , 但本研究的结果显示 , 叶绿体 DNA
的 JLA区域附近的 rpl2-trnH在构建整个陆地植物 DNA条形码方面或许具有潜在的应用价值 , 值得进一
步研究 。
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