全 文 ：23 2
药 物 生 物 技 术
P ha rma e e u tie a li Bo te e h no logy 2 0 05
,
1 2 ( 4 )
:
2 3 2一 2 3 5
五种海桑属植物的遗传多样性分析
蔡春海` ,金国虔“ ,于凌杰’ , 吴梧桐’ ,李 萍2 , 叶波平 , ’
(l
. 中国药科大学生命科学与技术学院 ,江苏 南京 2 1。。0 9 ; 2 . 中国药科大学现代中药重点实验室 ,江苏南京 21 003 8)
摘 要 利用 A p es CP R 技术对来自于海南东寨港红树林自然保护区的 5 种海桑属植物的遗传多态性进行
了分析 。 由选用的 46 条随机引物共扩增出 908 个 D N A 片段 ,其中有 403 个 D N A 片段分别为不同种海桑所特
有的 ,占总扩增条带数的 4 . 4% ,呈现出较高的多态性 ,它们是海桑属植物不同种间潜在的分子标记 。 以 N T -
YS SP
C分析软件对这 5 种海桑属植物进行了聚类分析 ,结果表明 : 5 种海桑属植物可聚类为 3 个组 ,其中 I 组有
海桑和拟海桑 , fl 组有无瓣海桑和海南海桑 , m组仅包括卵叶海桑一种 , 与传统的植物分类学研究结果略有不
同 ,其原因有待进一步认识 。
关键词 海桑属植物 ;任意引物多聚酶链式反应 ;遗传多样性
中图分类号 : Q 7 文献标识码 : A 文童编号 : 10 05 一 89 15 ( 20 0 5 ) 0 4一 0 23 2一0 4
海桑属 ( S on ne ar it a) 植物是一类广泛分布于
热带海滨的特有盐生植物 ,在分类学上隶属于海桑
科 ( oS n n e r a t ia e e a e ) ,其适宜的生长环境温度一般
在 18 ℃一 20 ℃ 以上 。 海桑属植物因具有发达的根
系以及抗缺氧和抗旱等能力 , 在热带沿海一带被广
泛用于堤坝的防护和海洋生态环境的保护 。 我国
的海桑属植物主要分布于海南一带 ,包括杯曹海桑
( S o n n e ar t艺a a lb a ) 、海桑 ( 5 . 。 a s e o l a r i 、 ) 、海南海桑
( 5
. 人a i n a n e n s i 、 ) 、 大叶海桑 ( 5 . 0二 t a ) 、 拟海 桑
( 5
.
p a ar c a s e o l a r i、 )以及无瓣海桑 ( 5 . a p e t a l a )等
6个品种 , 其 中的无瓣海桑为孟加拉 国引人 的
品种 。
在长期的生活实践中 ,我国沿海居民发现海桑
属植物中海桑和杯曹海桑的果实 、 叶片和花可用于
治疗扭伤和溢血 〔` 〕 , 但未见有其它种类海桑药用的
报道 。 上述现象暗示不同海桑植物的化学组成有
较大的差异 ,而这种差异往往体现在遗传背景上的
不同 。 为此 , 开展海桑植物的遗传多态性分析 , 有
助于从 D N A 水平上揭示化学成分的多态性变化 ,
并为进一步通过分子标记技术定位相关的功能基
因奠定一个较好的工作基础 。
本研究以 A P一 P C R ( A r b i t r a r i ly P r im e d P C R )
技术阁对从海南东寨港一带分布的 5 种海桑属植
物的 D N A 多态性进行了分析 ,并从分子水平上对
上述 5种海桑属植物的分类进行了讨论 。
l 材料与方法
1
.
1 材料来源及处理
海桑 ( S o n n e ar t i a c a s e o l a r i : ) 、 拟海桑 ( 5 . p a -
ar c a s e o l a r i s )
、 无瓣海桑 ( 5 . a P e t 。 za ) 、 海南海桑
( 5
.
h a i n a n e n s i s ) 以及大叶海桑 ( 5 . 0二 z a )均采 自
海南省东寨港红树林保护区 (东经 n o “ 1 1 1一
1 10
0
4 0 1
,北纬 1 9 0 2 3 1一 2 0 0 0 5 1 ) 。 每种海桑植物取
10 一20 株进行分析 ,将同种不同株的植物嫩叶剪碎
后混合供 D N A 分析用 。
1
.
2 基因组总 D N A 的提取
称取同种海桑植物叶片混合物 2 9 ,参照 L ak -
s h im 等 ( 2 0 0 0) 的方法图提取基因组 D N A , 经适量
的 R N a s e 处理后 去除 R N A , 纯化后置于一 20 ℃冰
箱中保存 。
1
.
3 A -P P C R 分析仁2〕
建立 25 川 的 P C R 扩 增 体 系 , 其 中含 :
10 m m o l / I
J
T r i s
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,
4
.
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J
M g C I:
,
D N A 模板 10 ~ 2 0 n g ,
4 0 0 拼m o l / L dN T P , 3 3 n g 随机引物 , 1 . 5 U T a q
D N A 聚合酶 (上海生工 ) 。
收稿 日期 : 20 0 5一 0 4一0 1 修回 日期 : 2 00 5一 0 5一 16
基金项目 :教育部高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目 ( N O 7 o 4o 2 6)
作者简介 :蔡春海 , 1 980 年生 ,江苏省启东市人 , 中国药科大学生命科学与技术学院 02 级硕士研究生 。
, 通讯作者 : D十波平 , T e l : 0 2 5一8 3 2 7 10 16 , D m a il : y e b p Zo o l@ y a h o . e o二 c n
蔡春海等 :五种海桑属植物的遗传多样性分析 2 3 3
将上述扩增体系于 49 ℃ 预变性 3 m ni , 然后
按 9 4 ℃变性 6 0 5 、 3夕oC 退 火 6 0 5 、 7 2 oC 延伸 9 0 5
共进行 40 个循环 , 最后于 72 ℃延伸 10 m in 结束
反应 。
P C R产物经 1 . 4 %琼脂糖凝胶电泳 、 E B 染色
后 ,用 iB o R ad 公司的凝胶成像系统扫描并保存 。
1
.
4 数据分析
将上述凝胶中的条带 (包括弱带 )记录为 1 , 而
缺失条带记录为 O 。 采用 N T s y s p 。 ( R o h l f 等〔` l ,
1 9 98) 生物学软件进行分析 ,获得的数据信息 (数字
矩阵 )通过 aJ c ar d ’ s 系数转换以显示 出 5 种海桑
属植物之间的遗传关系 , 并利用 聚类分析方法
( U l
〕
G AM
,
U n w
e i g h t e d P a i r G r o u p w i t h A
r i t h
-
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。 M ea n) 获得 5 种海桑属植物的聚类图 。
D N A 条带中有 4 03 个属 于多态性 D N A 片段 , 平
均每个引物产生的多态性扩增条带数为 8 . 8 , 占总
扩增条带数的 4 . 4% (表 1 ) 。
T a b
P la n t
D N A p o ly m o r p h is m s 飞n 5 s p e e ies o f oS n n e ar t i a
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2 结 果
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ó月吮巴刁叮`
2
.
1 5 种海桑属植物的遗传 多态性
利用 10 个随机引物对 5 种海桑属植物进行
了基因组 D N A 分析 , 选择其中 46 个有效随机引
物 (表 1) 进行了 A -P P C R 分析 , 并对扩增图谱清
晰 、条带稳定的 D N A 片段进行记数分析 ( 图 1 ) 。
T h e le gn th
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r k e r la n e 15 4 5 0 0
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t ar r i ly P r im e d 代二R
由 4 6 条有效引物共获得 D N A 扩增条带 908
个 ,平均每个引物产生的扩增条带数为 19 . 7 , 扩增
D N A 片段的大小为 20 一 2 4 0 bp 。 在扩增出的
G A G A (汇 C A A C
G T (获二C T A A CC
以二A T G A G A CC
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2 4 3药 物 生 物 技 术 第 2 1卷第 4期
续 表
R l 〕 N ub mr el于 Se q u en e eT N I ) 1N 3P B P P B ( % )
8 50 A CT T C《试二 C A C 50 0. 0
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.
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.
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N u mb er of p ol ynl or oh ieb and s ;PP B .P er e ent a g e of 即 I ymor ph ie
b and s
在分析过程中发现 :利用不同的随机引物对 5
种海桑属植物进行分析时产生的结果是不同的 , 其
中有些引物 (如 : 随机引物 5 2 1 、 5 2 4 、 5 3 2 、 5 3 6 、 54 0 、
54 3
、
54 7
、
5 5一、 5 7 1 、 5 8 0 和 5 9 1 等 )反映的种间多
态性为 。% , 而另外一些引物 (如 : 随机引物 5 58 、
58 6 和 5 94 等 )反映的种间多态性则高达 10 % ,大
多数 ( 占所有分析用 随机引物的 67 . 4% ) 介于
5 % ~ 8 0%间 (表 1 ) 。
2
.
2 5种海桑属植物的聚类分析
采用 U P G M A 方法对 5 种海桑属植物的亲缘
关系进行了分析 (表 2 ) ,并构建了它们的聚类分析
图 (图 2 ) 。
T a b 2 S im ila r i t y e o d f ie ien t
a n d h e er t ie d is t a n e e a m o n g 5 s p e e ie s o f S o n n e ar t i
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32
C O e f i C ie n t
Fig 2 C lu s t e r in g a an ly
s is o f th e 5 s p ce i
e s in S o n en ar t i a
P la n r
根据对 5种海桑植物的 D N A 多态性分析结
果 ,可将它们分为 3 组 ,其中 I 组有海桑和拟海桑 ,
组内遗传相似系数为 0 . 34 ; 1 组有无瓣海桑和海
南海桑 ,组内遗传相似系数为 。 . 35 ; m组仅包括卵
叶海桑一种 。 I 组 和 1 组 间的遗传相似系数为
。. 29 ,卵叶海桑与上述四种海桑的遗传亲缘关系比
较远 ,平均遗传相似系数为 。 . 24 。
3 讨 论
在传统的分类学上 ,一般根据海桑属植物花瓣
的有无将其分为两大类 : 杯曹海桑 、 海桑和拟海桑
为有花瓣的一类 , 其他则属于无花瓣的类型 ;杯尊
海桑与海桑和拟海桑的主要区别在于前者的花曹
裂片为红色 ,后两者则为浅绿色或黄白色 ;无瓣海
桑与海南海桑和大叶海桑的区别在于花粤裂片的
数目不同 ,前者为 4 枚 ,后两者多于 5 枚困 。 但是 ,
由于受到生长环境 (如 :水质 、 土质 、气候 、 日照以及
雨量的变化等 )的影响 , 海桑属植物的分类地位仍
然存在着一些争论圈 。
本研究利用 A P e P C R技术对海南东寨港红树
林保护区的 5 种红树植物的多态性进行了分析 , 并
对这 5 种海桑植物进行了聚类研究 。 结果表明 : 5
种海桑植物的聚类分析结果与传统的分类研究结
果比较接近 ,不同的是 : 在传统分类学研究中认为
大叶海桑和海南海桑比较接近 , 而本研究则显示 :
无瓣海桑与海南海桑在 D N A 水平上更加接近 , 它
们与大叶海桑的遗传距离相对较远 。 周涵韬等阁
利用 巧 条随机引物对 6 种海桑植物的分析结果则
显示出与传统分类更加接近的结果 ,其原因可能与
分析过程中采用随机引物的数 目和随机引物的序
列不同有关 。 事实上 , 在我们的研究过程中也显
示 : 有些引物并不能反映种间的差异 ,而另一些引
物则几乎显示出 10 %的多态性 , 因此 , 在分析过
程中应加大采用随机引物的数目以增加结果分析
的可靠性 ,在本研究过程中 , 我们则选用了 46 条随
蔡春海等 :五 .种海桑属植物的遗传多样性分析 23 5
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仁I」. 海洋学报 . 2 f ) () 2 . 2 4 ( 5 ) : 9 8 .
困
机引物 ,其统计学更有意义 。
在本研究过程中 ,我们发现 了一些海桑品种的
特异 DN A 扩增条带 , 显示出该种 与其他海桑品种
在 D N A 水平上 的 差 异 , 目前 正 在 对 这 些 特 异
D N A 扩增条带进行进一步 的验证 和序列 分析 [
作 ,这些差异 D N A 片段对物种 的鉴别以及因种间
差异导致的生理生化方 面的研究和应用价值尚待
进一步验证 。
致谢 : 在样品的采集 、 鉴定和数据 的分析过程
中分别得到海南东寨港红树林 自然保护 区管理处
陈伟和李文潜老师以及南京大学生命科学学院阮
成江博士的大力支持
参考文献
莫竹承 . 红树植物的药用 与食川刁」. 海洋信息 · ! , :招 8 : 性
G e n e t i e D i v e r s i t y A n a l y s i s o f 5 S P e e i e s o f S o n n e r a t i a P l a n t s
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A b s t ar e t G
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d l f f e r e n e e f r o m 5
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一左 14 1 一种可增强基因枪接种 )I N 八 疫苗诱牛 细胞免疫应答的方法 本发明提供 r 一种可增强基因枪接种
D N A 疫苗诱生的 T hl 型免疫应答的方法 ,本发明也涉及制备质粒 D N A C p ( ; 寡聚核什酸包裹金颗粒的方法 。 本发明在
基因枪接种质粒 D N A 疫苗的同时共导人 一定比例的合成的寡核营酸 〔’ p (泪N A ( C p (刃 D N )作为佐剂 。 动物免疫实验证实 :
本发明能增强基因枪接种 D N A 疫苗的 T hl 型免疫应答水平 ,包括总 19 ( 蚤, 19 (论 a , 特异性 C T I一 活性 , 抗原特异的 IF N Y 产
生能力 。 本发明有利于克服基因枪接种 D N A 疫苗诱牛低水平 一 r hl 型免疫应答的缺陷 , 可用于肿瘤及病毒持续性感染等的
治疗 。